2013年, 第28卷, 第3期　
刊出日期：2013-06-21

  

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  迟钝爱德华氏菌Ⅲ型分泌系统基因的克隆及多重PCR检测方法的建立

  王斌, 赵凤梅, 李军伟, 沈皓, 王惠, 胡亮

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 217-223. https://doi.org/NULL

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  采用PCR法扩增大菱鲆Scophthalmus maximus出血性败血症病原菌迟钝爱德华氏菌Edwardsiella tarda L-49231菌株Ⅲ型分泌系统 (TTSS)的装置蛋白 (esaC)、效应蛋白 (eseB、eseC、eseD)和调节蛋白(esrA、esrB)6种基因,并将其克隆到载体PMD19-T中分别进行测序;通过优化反应条件,建立一次检出效应蛋白eseB、eseC和eseD 3种基因片段的多重PCR方法;采用所建立的多重PCR方法检测迟钝爱德华氏菌不同菌株(L-49231、GhAn080310、GhAn080313和GhAn080314)、沙门氏菌Salmonella enterica、大肠杆菌Escherichia coli和肠杆菌Enterobacter中效应蛋白基因的存在情况。结果表明:L-49231菌株中存在esaC、eseB、eseC、eseD、esrA和esrB 6种基因片段,大小分别为837、184、934、445、464、458 bp,与GenBank中迟钝爱德华氏菌PPD130/91菌株的这6种基因的同源性分别为99%、97%、99%、99%、99%、98%;通过优化反应条件,在退火温度为54℃,基因eseB、eseC和eseD引物浓度 (μmol/L)组合比为5∶10∶2,Mg2+浓度为1.5 mmol/L时,能够得到清晰、稳定且均一的多重PCR产物,并与目的条带分子量一致;采用所建立的多重PCR方法进行检测,迟钝爱德华氏菌L-49231菌株中存在eseB、eseC和eseD 3种基因片段,迟钝爱德华氏菌GhAn080310、GhAn080313、GhAn080314菌株中存在eseB和eseC基因片段,但未检出eseD基因片段;沙门氏菌、大肠杆菌和肠杆菌中均未检出eseB、eseC和eseD基因。表明所建立的多重PCR方法对迟钝爱德华氏菌具有较好的特异性,可检出具有Ⅲ型分泌系统效应蛋白的菌株。
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  仿刺参体壁创伤修复消减文库的构建与分析

  秦艳杰, 李霞, 张慧敏, 王雪

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 224-229. https://doi.org/NULL

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  应用抑制性消减杂交技术 (SSH),构建了仿刺参Apostichopus japonicus(体质量为65～90 g)正常体壁及创伤修复 (24、48、72、96、120 h后)体壁的消减cDNA文库,利用PCR和斑点杂交技术对文库进行筛选,随机挑取的768个克隆中发现292个阳性克隆,对其中信号强度较强的224个阳性克隆进行测序,得到208个有效EST序列。经BlastX工具对获得的EST与GenBank数据库进行比对分析,结果有171个EST序列与数据库中的基因同源 (e≤0.001,相似性＞40%),其中153个为未知基因,18个为已知功能或已命名基因,包括在创伤及修复的体壁中上调表达的β微管蛋白、微管蛋白α-1链、肌动蛋白、肌动蛋白ike 7B类似物、细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、tRNA假尿苷合成酶A、GTP酶、细胞分裂周期2类似蛋白、有丝分裂原活化蛋白激酶、homeobox蛋白、延伸因子1A、核糖体蛋白L30、核糖体蛋白L17、60S酸性核糖体蛋白P0、26S蛋白酶调节亚基、泛素特异性肽酶24、大肠癌血清抗原3、清道夫受体蛋白12等。本研究结果可为探讨刺参体壁再生过程和分子机理,以及筛选刺参体壁创伤修复过程中相关功能基因的研究提供基础依据。
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  “光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

  田盛君, 李晓东, 姜玉声, 刘胥, 杨红威, 原振政, 郑岩

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 230-235. https://doi.org/NULL

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  采用磁珠富集法 (Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建 “光合1号”新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个 (占73.40%),非完美型微卫星座位17个 (占18.09%),混合型微卫星座位8个 (占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对 (占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。
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  低盐胁迫下仿刺参DD104基因的定量表达分析

  田燚, 莫海波, 常亚青

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 236-240. https://doi.org/NULL

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  以2龄仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,利用实时定量PCR技术分析了DD104基因在仿刺参不同组织中以及低盐胁迫后不同时间的表达情况。结果表明:DD104基因在仿刺参管足中的表达水平最高,在体腔液、触手、呼吸树中的表达水平次之,在体壁、肌肉和肠中的表达水平较低;仿刺参在受到低盐胁迫后,体内DD104 mRNA的表达随盐度胁迫时间的增加呈现波动性增减,胁迫72 h时DD104基因的表达最强,在肌肉和管足中的表达量达到最大;胁迫48 h时肠组织中的表达量最大;胁迫24 h时体腔液中的表达量最大。研究表明,低盐胁迫后DD104基因在仿刺参不同组织中的表达发生变化的时间点不同,低盐胁迫下DD104基因表达量的变化规律说明该基因的表达可能与渗透胁迫密切相关。
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  花(鱼骨)与唇(鱼骨)及其正反杂交子代的微卫星标记分析

  李倩, 练青平, 胡廷尖, 刘士力, 王雨辰, 宓国强

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 241-246. https://doi.org/NULL

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  利用12对微卫星引物对花(鱼骨)和唇(鱼骨)及其正反杂交子代(花(鱼骨)♀×唇(鱼骨)♂F1和唇(鱼骨)♀×花(鱼骨)♂ F1)共4个群体进行微卫星分析,计算等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、多态性信息含量(PIG)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(胁)、遗传分化系数(Fst)、Nei氏遗传距离(Ds).结果表明:在4个群体中,反交F1的平均Ne最大(3.453 7),花(鱼骨)的平均Ne最小(3.0497);花(鱼骨)和唇(鱼骨)及其正反杂交子代4个群体的平均PIC分别为0.5994、0.602 6、0.628 0、0.6374；反交F1的平均Ho最高(0.411 1),花(鱼骨)的平均Ho最低(0.208 3).聚类分析结果表明,正交F1和母本花(鱼骨)先聚为一支,再和父本唇(鱼骨)聚为一支,最后同反交F1聚在一起.遗传距离和遗传相似系数结果显示:正交F1与母本花(鱼骨)的遗传相似系数最大,与反交F1的遗传相似系数最小；反交F1同父本花(鱼骨)的遗传相似系数最大,同母本唇(鱼骨)的遗传相似系数最小.杂交子代群体的等位基因基本来自父母本双方,可以推断杂交子代的遗传物质来自父母双方,属两性融合生殖,且杂交子代的遗传变异水平明显高于父母本,是真正意义上的杂交种.
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  利用164个微卫星标记分析镜鲤家系的遗传多样性和经济性状

  徐浩, 鲁翠云, 孙效文

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 247-253. https://doi.org/NULL

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  利用来源于细菌人工染色体文库 (Bacterial artificial chromosome,BAC)的164个微卫星标记分析了镜鲤Cyprinus carpio L.家系遗传多样性及标记与体质量、体长、体高、体厚4个性状间的相关性。结果表明:镜鲤家系68个个体在164个微卫星位点上共扩增出402条条带,观察杂合度 (Ho)为0.220 6～1.000 0,平均为0.62,多态性信息含量 (PIC)为0.243 9～0.702 8,平均为0.42,总体表现为中度多态(0.25≤PIC≤0.50),遗传多样性水平较高;利用SPSS 17.0的GLM模块分析标记与性状间的相关性,有25个标记与相应性状相关 (P＜0.05),其中6个标记与性状的相关性达到极显著水平 (P＜0.01),使用独立样本T检验和Duncan's多重比较找到了每个位点的优势基因型;利用NCBI的Blast模块将各位点序列与斑马鱼的序列进行比对,有11个位点与斑马鱼基因相关,一致度均在80%以上,其中6个基因功能已知。
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  传染性造血器官坏死病毒糖蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

  刘学光, 郑怀东, 郭欣硕, 罗靳, 蔺翠翠, 王秋雨

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 254-258. https://doi.org/NULL

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  通过人工合成方法得到传染性造血器官坏死病毒 (IHNV)糖蛋白 (G蛋白)基因,将该基因克隆到表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a/IHNV-G,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)plySs中。经SDS-PAGE电泳及Western blotting分析表明,在1 mmol/L IPTG(诱导剂)、37℃条件下诱导4 h后,G蛋白在大肠杆菌中成功表达,得到了相对分子质量约为57 000的G蛋白。采用直接切胶免疫小鼠的方法制备多克隆抗体,ELISA分析结果显示,血清效价可达到1∶10 000。本试验中得到的G蛋白和多抗血清可为IHNV疫苗的研制以及胶体金试纸条快速检测方法的建立提供理论基础。
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  鱼肠道弧菌单克隆抗体的制备及应用

  吴晓春, 邓灯, 刘慧, 程顺峰, 张晓君

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 259-263. https://doi.org/NULL

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  以鱼肠道弧菌Vibrio ichthyoenteri为抗原免疫小鼠,用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,分别采用酶联免疫吸附 (ELISA)技术和间接免疫荧光抗体 (EFAT)技术筛选强阳性杂交瘤细胞株,亚克隆阳性细胞株,获得5株抗鱼肠道弧菌单克隆抗体 (1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)。Western blotting分析结果显示,单抗2D10与相对分子质量为44 200、36 700的鱼肠道弧菌蛋白发生特异性结合;用流式细胞术 (FCM)检测单抗强度,结果显示阳性荧光比例为13.63%,阴性对照荧光比例不足1%;人工感染牙鲆试验结果表明,运用该单抗能够建立鱼肠道弧菌的快速诊断方法。
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  菲律宾蛤仔3种壳色群体低盐耐受能力的比较研究

  丁鉴锋, 王锐, 闫喜武, 赵立强, 杨凤, 王连顺

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 264-268. https://doi.org/NULL

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  通过测定3种壳色群体菲律宾蛤仔Ruditapesp hilippenarum(斑马蛤、珍珠白和对照组)在低盐度(15)海水中0、1.5、3、6、12、24、48 h时的死亡率、个体平均增重、血浆渗透压、Na+浓度、Cl-浓度、血浆总蛋白浓度、鳃组织三磷酸腺苷(ATP)酶活性及血细胞总数等指标,比较了3种壳色菲律宾蛤仔的低盐耐受能力。结果表明:斑马蛤的死亡率最低 (3.92%);3种壳色蛤仔的血浆渗透压均呈现逐渐降低的趋势,第24 h时,斑马蛤渗透压显著高于对照组(P＜0.05),第48 h时,3种壳色蛤仔的血浆渗透压都与海水渗透压接近;3种壳色蛤仔血淋巴中Na+浓度均呈现升高过程,第24 h时,珍珠白和斑马蛤的Na+浓度达到最大值,显著高于对照组(P＜0.05);对照组蛤仔Cl-浓度呈现先升高后恢复的过程,而斑马蛤和珍珠白Cl-浓度呈现先降低后恢复的过程,第24 h时,斑马蛤和珍珠白血淋巴Cl-浓度显著高于对照组(P＜0.05); 3种壳色蛤仔的ATP酶活性呈现先升高后恢复的过程,第6 h和24 h时,珍珠白鳃组织ATP酶活性显著高于对照组(P＜0.05);3种壳色蛤仔的血细胞总数也呈现先升高后恢复的过程,第1.5 h时,珍珠白和斑马蛤血细胞总数显著低于对照组(P＜0.05),第48 h时,斑马蛤血细胞总数显著高于对照组(P＜0.05)。
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  口虾蛄繁殖周期及生殖细胞发育的研究

  刘海映, 谷德贤, 姜玉声, 邢坤

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 269-272. https://doi.org/NULL

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  对大连市黑石礁海域口虾蛄Oratosquilla oratoria卵巢性腺指数的周年变化进行测定,对雌雄个体的生殖细胞发育进行了组织学观察。结果表明:3月,随着水温的升高,口虾蛄繁殖个体卵巢发育逐渐成熟,性腺指数上升,至6月达到最大值,7月,随着繁殖个体的排卵,性腺指数下降,至9月出现全年的最小值;口虾蛄1龄即可性成熟,每年产卵1次;雄性生殖细胞发育分为精原细胞期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精细胞期和精子期5个时期,雌性生殖细胞发育分为卵原细胞期、卵黄形成前期、卵黄形成期和成熟期4个时期。
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  温度对河川沙塘鳢幼鱼耗氧率和排氨率的影响

  刘建忠, 施永海, 邓平平, 张海明, 陆根海

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 273-276. https://doi.org/NULL

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  进行了温度 (10、14、18、22、26、30、34℃)对河川沙塘鳢Odontobutis obseura幼鱼呼吸和排泄的影响试验。结果表明:河川沙塘鳢幼鱼的耗氧率和排氨率均随水温的升高呈直线上升,且都具有良好的直线回归关系 (r2分别为0.972和0.971);18～22℃时河川沙塘鳢的氧氮比 (O∶N)明显高于26～34℃时的比值 (P＜0.05);10～34℃时的热能效系数 (Q10)值为1.734,最低Q10值 (1.069～1.161)出现在22～30℃时。研究表明,河川沙塘鳢幼鱼的可耐受温度为10～34℃,适宜生长温度为22～30℃。
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  仿刺参体壁手术缝合方法的研究

  赵丽娜, 李霞, 李雅娟, 秦艳杰

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 277-280. https://doi.org/NULL

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  以仿刺参Apostichopus japonicus为试验材料,建立了一种海参体壁手术缝合的方法。将体质量为(55±2.6)g的仿刺参放入盛有0.54 mol/L硫酸镁溶液的解剖盘中麻醉1 h,然后用灭菌手术刀沿腹后部1/3处往前纵向切开约2 cm切口,深至体腔。采用单纯对合缝合法进行缝合,缝合后放回加有抗生素的水槽中培育。结果表明:试验组仿刺参伤口经缝合后,创口在10 d时已基本愈合,20 d时切口处组织与正常组织没有区别,且在培育过程中,化皮率为10%,死亡率仅为5%;对照组伤口未经缝合,其创口愈合时间较试验组平均慢10 d,且化皮率高达58.7%,死亡率为51.7%。该方法可应用到海参的创伤试验研究以及养殖生产中。
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  中国刺参与韩国红刺参杂交及子代发育特性的研究

  孙灵毅, 赵强, 任利华, 王有廷, 王亮, 贺加贝

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 281-286. https://doi.org/NULL

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  分别以刺参Stichopus japonicus中国群体和韩国群体为母本,采用同步催产法,同时收集中国刺参和韩国红刺参的精子、卵子,进行正交 (中国刺参♀×韩国红刺参♂)和反交 (韩国红刺参♀×中国刺参♂),比较两者的受精率,同时对正交受精及早期胚胎发育过程进行连续光镜和荧光显微镜观察。结果表明:中国刺参和韩国红刺参正交和反交的受精率分别为91%和94%;韩国红刺参的精子可以穿过中国刺参的卵膜进行受精,并激活卵子减数分裂使其释放第一极体 (PB1)和第二极体 (PB2),然后受精卵开始进行卵裂;杂交胚胎发育正常,正交和反交的孵化率分别为75%和90%。另外,在试验中发现有多精入卵现象。
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  一种病毒感染引起半滑舌鳎腹水症的病理学观察

  张正, 荣小军, 王印庚, 王岚, 廖梅杰, 李彬

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 287-292. https://doi.org/NULL

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  利用石蜡切片技术和电镜技术对患有腹水症的半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther主要组织器官进行了组织病理学观察与分析。结果表明:感染腹水症的半滑舌鳎全身主要的组织器官都发生了不同程度的病理变化,其中鳍部皮肤出现血红细胞浸润和淤积;鳃小叶上皮细胞空泡变性,柱状细胞发生炎症;肝胰脏和肾脏都出现了局灶性的组织坏死和溃烂,组织间充满空泡变性的细胞,超微病理观察发现大量病毒粒子;心脏的心肌组织出现固缩和局灶性溃烂;胆囊壁浆膜层结缔组织增生,毛细血管充血;消化道黏膜层和黏膜固有层分离,黏膜固有层成纤维细胞固缩或水样变性,致密层变疏松。根据病理学研究结果初步分析认为,一种未知病毒可能是半滑舌鳎腹水症的主要致病原。
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  以配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹生长及消化酶活性的影响

  杨志刚, 阙有清, 纪连元, 郭子好, 成永旭, 曾奇韬

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 293-297. https://doi.org/NULL

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  用塑料围网将一个池塘分隔成6个100 m2的小池塘,每池放养100只体质量为 (10.01±1.02)g的中华绒螯蟹Eriocheir sinensis,分别投喂配合饲料和杂鱼,每种饲料设3个重复。养殖180 d后随机采样,称量体质量,测量壳长和壳宽,计算肝胰腺指数、性腺指数、出肉率、肌肉营养成分和消化道消化酶活性。结果表明:投喂两种饲料的中华绒螯蟹的体质量、肝胰腺指数、性腺指数、出肉率、壳长、壳宽及肌肉中的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均无显著性差异 (P＞0.05),说明以配合饲料替代杂鱼对中华绒螯蟹的生长无明显影响;配合饲料组蟹胃的类胰蛋白酶和肠的脂肪酶活性显著高于杂鱼组 (P＜0.05),杂鱼组蟹肠的淀粉酶活性显著高于配合饲料组 (P＜0.05),两种饲料对蟹消化道其他各部位消化酶的活性均无显著性影响 (P＞0.05)。
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  甲砜霉素在松浦镜鲤体内的药物代谢动力学研究

  杨洪波, 王荻, 卢彤岩

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 298-302. https://doi.org/NULL

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  采用液相色谱与质谱连用技术 (LC-MS),研究了以30 mg/kg(体质量)的药量在单次口灌给药条件下,甲砜霉素在松浦镜鲤Cynipus carpio L.体内的药物代谢动力学。试验水温为 (20±0.2)℃,试验鲤(1+龄) 体质量为 (84.84±17.45)g。在给药后 0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、4.00、6.00、8.00、12.00、24.00、36.00、48.00、72.00 h采集鲤的肌肉、血浆、肝胰脏和肾脏,测定各组织中甲砜霉素的浓度,用药动学3P97软件进行数据分析和处理。结果表明,甲砜霉素在鲤体内吸收分布迅速,符合一级吸收二室开放模型,但消除缓慢。甲砜霉素在鲤血浆、肝胰脏、肾脏和肌肉中的主要药代动力学参数如下:消除半衰期 (T1/2β) 分别为 77.292、24.625、79.966、25.600 h;分布半衰期 (T1/2α) 分别为7.317、0.454、7.409、1.376 h;药时曲线下总面积(AUC)分别为 782.641 μg/(mL·h)、544.756 μg/(g·h)、3 616.060 μg/(g·h)和158.634 μg/(g·h)。鉴于甲砜霉素在鲤血浆和肾脏中的消除半衰期长,消除缓慢,建议使用该类药物时应相对延长给药间隔时间。
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  海参多肽脱色脱腥工艺的优化研究

  郑金娃, 汪秋宽, 何云海, 刘舒, 任丹丹

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 303-306. https://doi.org/NULL

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  以仿刺参Apostichopus japonicus为原料,经复合酶解得海参多肽酶解液,通过静态吸附试验及柱层析分离试验研究了粉末活性炭、颗粒活性炭、硅藻土、强碱性阴离子树脂 (D280)、弱碱性阴离子树脂(D380)、弱酸性阳离子树脂 (D301R、D315、D301T、D152)和大孔吸附树脂 (D3520、ADS-5、ADS-7)对海参多肽酶解液的脱色脱腥效果,以优化海参多肽脱色脱腥工艺。结果表明:树脂D280的脱色脱腥效果最佳,最佳脱色脱腥工艺为酶解液与树脂体积比为3∶1,流速为2 mL/min,在此脱色脱腥工艺条件下,脱色率达69.78%,游离氨基酸态氮回收率为86.42%,海参多肽回收率为82.49%,脱腥率达67%,海参多肽酶解液通过D280脱色脱腥后,其游离氨基酸态氮含量为461.7 mg/L,海参多肽含量为9.77 mg/mL。
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  青海省湟水鱼类资源现状及保护对策

  唐文家, 陈毅峰, 丁城志

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 307-313. https://doi.org/NULL

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  于2008—2010年对黄河上游最大的支流——青海省湟水进行了鱼类资源调查,并对渔业资源变化、生物多样性和鱼类面临的生态问题进行了初步的探讨。结果表明:湟水流域有鱼类36种,隶属于4目8科26属,鲤形目鱼类为主要类群,有2科19属25种,鲑形有3科4属6种,鲈形目有2科2属4种,合鳃鱼目有1科1属1种,其中土著鱼类有14种,外来鱼类有22种;湟水流域土著鱼类呈现出个体小型化趋势,生物多样性指数整体不高,水域污染、水利水电工程建设以及外来鱼类物种的入侵,对湟水鱼类资源造成了一定的威胁,为此,提出了保护湟水渔业资源的几点建议。
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  渔业水域调查采样点智能生成系统的研究与实现

  施炜纲, 汤滔, 张在志, 段金荣, 徐东坡

  大连海洋大学学报. 2013, 28(3): 314-318. https://doi.org/NULL

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  利用Visual Basic结合ActiveX组件MapX对渔业调查水域进行采样点智能规划的技术、方法和开发流程进行了介绍。所生成的模块能提供以网格为单元对渔业调查水域进行科学规划,实现各调查样区的无缝联结。该系统操作简便,突出了专业特色,节省了购买和学习地理信息系统软件的成本。该模块被应用于太湖水质调查中,通过与用户交互自动生成以网格为单元的采样点及相应的地理坐标参数,为解决传统采样点布设方法中缺乏地理坐标界定的缺陷提供了理想的解决方案。在后期渔业水域调查数据统计中,亦可利用该系统对空间数据和水域调查数据进行管理与统计,自动生成和输出基于调查数据空间分布的专题图。