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大连海洋大学学报  2022, Vol. 37 Issue (3): 450-456    DOI: 10.16535/j.cnki.dlhyxb.2021-136
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异育银鲫IgM单克隆抗体的制备及其应用
郭宝琴，魏畅*，王轶南，李强
1.盐城工学院 海洋与生物工程学院，江苏 盐城 224051；2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023
Development and application of monoclonal antibody against IgM of silver prussian carp Carassius auratus gibelio
GUO Baoqin,WEI Chang*,WANG Yinan,LI Qiang
1.College of Marine and Biological Engineering,Yancheng Institute of Technology,Yancheng 224051,China;2.College of Fisheries and Life Science,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China
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摘要 为制备抗异育银鲫Carassius auratus gibelio IgM单克隆抗体，以单克隆抗体为工具构建鲫血清中鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)特异性抗体酶联免疫检测技术，运用硫酸铵盐析结合Protein A亲和层析法,从异育银鲫血清中分离、纯化免疫球蛋白IgM。结果表明：经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示，纯化的血清IgM主要有两条蛋白带，相对分子质量分别为82 000和25 000，分别为异育银鲫IgM的重链和轻链；以纯化的IgM免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术获得了5株抗异育银鲫IgM单克隆抗体，分别命名为8G1、7C6、8C2、8C5和5C2；抗体分型结果显示，8G1、8C2、8C5和5C2均为IgG1亚型，7C6为IgG2b亚型；免疫印迹分析显示，5株单抗均可特异性识别相对分子质量为25 000的IgM轻链分子；间接免疫荧光分析显示，5株单抗均可与异育银鲫脾脏中部分白细胞发生特异性结合，阳性细胞表面呈现绿色点状荧光信号；用鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)病毒粒子包被酶标板，以抗异育银鲫IgM单抗作为检测一抗，碱性磷酸酶标记羊抗鼠Ig作为检测二抗，构建了鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，进一步优化显示，该技术中最佳单抗为8C5，最佳二抗稀释度为1∶2 000，鲫血清最佳稀释度为1∶20。研究表明，本研究中成功制备了抗异育银鲫IgM单克隆抗体，并以此为工具构建了检测鲫血清中CyHV-2特异性抗体酶联免疫检测技术，研究结果可为今后开展异育银鲫特异性免疫应答研究及CyHV-2疫苗效果评价提供科学参考。
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关键词:  异育银鲫  免疫球蛋白  单克隆抗体  鲤疱疹病毒Ⅱ型    
Abstract: In this study,immunoglobulin IgM from the serum of silver prussian carp Carassius auratus gibelio was isolated and purified by ammonium sulfate salting out method combined with protein A affinity chromatography.SDS-PAGE analysis showed that the purified IgM mainly contained two protein bands with relative molecular mass of 82 000 and 25 000,respectively.Balb/c mice were immunized with purified IgM,and five anti-crucian carp IgM monoclonal antibodies,named as 8G1,7C6,8C2,8C5 and 5C2,were obtained by hybridoma technique.Isotype analyzing indicated that 8G1,8C2,8C5 and 5C2 belonged to IgG1 isotype,and 7C6 belonged to IgG2b isotype.Western blot results showed that the five monodonal antibody (MAb) strains specifically recognized IgM light chain molecule with relative molecular mass of 25 000.The indirect immunofluorescence showed that all the five monoclonal antibodies recognized the sIgM cell of silver prussian carp.In addition,the indirect ELISA method for detection of the anti-CyHV-2 serum antibody in sliver carp was established using the anti-IgM monoclonal antibody as primary antibody and AP-labeled sheep anti-mouse Ig as the secondary antibody.The results of condition optimization indicated that the candidate 8C5 is the optimal anti-IgM monoclonal antibody,and 1∶20 dilution of fish serum is the optimal concentration for ELISA detection.Results of this study provides an effective tool for future research on immune response of silver prussian carp and an effective method for the evaluation of immune effect of vaccination.
Key words:  Carassius auratus gibelio    immunoglobulin    monoclonal antibody    cyprinid herpesvirus 2
               出版日期:  2022-08-04      发布日期:  2022-08-04      期的出版日期:  2022-08-04
中图分类号:  S 941.2  
基金资助: 江苏省重点研发计划(BE2021326);江苏省农业科技自主创新专项(CX(18)3028)
引用本文:    
郭宝琴, 魏畅, 王轶南, 李强. 异育银鲫IgM单克隆抗体的制备及其应用[J]. 大连海洋大学学报, 2022, 37(3): 450-456.
GUO Baoqin, WEI Chang, WANG Yinan, LI Qiang. Development and application of monoclonal antibody against IgM of silver prussian carp Carassius auratus gibelio. Journal of Dalian Ocean University, 2022, 37(3): 450-456.
链接本文:  
https://xuebao.dlou.edu.cn/CN/10.16535/j.cnki.dlhyxb.2021-136  或          https://xuebao.dlou.edu.cn/CN/Y2022/V37/I3/450
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