目前，牡蛎已成为全球主要的经济性养殖贝类，其中，中国牡蛎的养殖产量连续多年居世界首位，占全球总产量的80%以上[1]。据《2023年中国渔业统计年鉴》[2]统计，中国牡蛎养殖产量约为620.0万t，占全国海水养殖总产量的27%以上。其中，长牡蛎(Crassostrea gigas)作为中国主要的牡蛎养殖优势种，广泛分布于中国沿海水域[3]，其肉质爽肥、鲜美，富含多种氨基酸、维生素及微量元素[4]，深受消费者喜爱。然而，在市场需求持续增长的背景下，牡蛎养殖规模的快速扩大与产品质量提升不同步，出现“大而不强”的产业发展困境。目前，牡蛎筏式养殖区域缺乏统一规划，设施布局不合理[5]。普遍存在的超容量养殖现象引发养殖海域水质恶化，浮游植物群落结构与生物多样性的显著改变，直接影响牡蛎的生长发育和产品品质[6]。这种粗放式发展模式直接导致中国牡蛎单位养殖产值明显低于世界平均水平[7]，市售牡蛎品质参差不齐，存在出肉率低、生长缓慢、抗病能力弱等问题[8]。
随着水产设施养殖技术的发展，工厂化育肥逐渐成为牡蛎养殖产业转型升级的重要方向。该技术通过可控环境下的短期暂养，配合精准投喂策略，可提升牡蛎的生长速度和出肉品质[9]，实现净化和育肥的双重目的。养殖过程中，长牡蛎可通过鳃丝摆动滤食水中颗粒物[10]，已有研究采用干粉、豆粕等制备牡蛎人工饵料，此类饵料虽具备成本优势，但其应用中常出现消化吸收率较低、适口性不佳及水质受影响等问题[11]。微藻营养丰富，能显著提高水产动物的幼苗存活率和免疫力[12]，是牡蛎的优质饵料。此外，温度、盐度等环境因子也显著影响双壳贝类的滤食行为与生长状况[13]。研究表明，温度和盐度显著影响菲律宾帘蛤(Ruditapes philippinarum)的生存率和滤食行为，当盐度低于15时，其滤食行为几乎停止，死亡率显著增加，随着盐度的提高，菲律宾帘蛤的渗透调节功能和摄食行为恢复[14]。在一定温度范围内，贝褶纹冠蚌(Cristaria plicata)、背角无齿蚌(Anodonta wooodiana)、河蚬(Corbicula flurninea)的滤食率均呈现出随温度升高而升高的趋势[14]。也有研究综合分析了温度、盐度和养殖密度对长牡蛎幼虫生长和存活的影响，构建了生长和存活模型，为其发育阶段的参数优化提供了理论依据[15]。然而，工厂化条件下牡蛎育肥的相关研究存在明显不足。
本研究针对工厂化养殖模式下长牡蛎短期育肥的需求，系统探究了暂养环境参数、饵料选择与牡蛎生长、存活的协同作用关系。研究了不同温度梯度和盐度梯度条件下，长牡蛎对典型饵料微藻滤食效率的差异及其对出肉率、肥满度和生化组分的影响，以期获得长牡蛎工厂化育肥的最适条件。本研究结果可为牡蛎工厂化暂养育肥模式提供关键参数支撑，对推动产业升级具有一定实践价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 长牡蛎暂养 试验所用长牡蛎来自大连石城岛筏式养殖海区。选择二倍体长牡蛎400 ind.[壳长(113.95±9.87)mm，壳宽(67.53±5.58)mm，壳高(41.46±4.34)mm，体质量(156.65±17.9)g]和三倍体牡蛎2 600 ind.[壳长(94.77±9.09)mm，壳宽(62.50±6.59)mm，壳高(24.13±8.08)mm，体质量(160.02±8.96)g]。长牡蛎清洗后迅速转移到实验室，以0.25 ind./L的密度进行暂养，暂养期间条件维持温度25 ℃±1 ℃，盐度30±1，溶解氧(8±1)mg/L。每日换水并投喂适量新鲜藻液。
1.1.2 微藻培养 海水小球藻(Chlorella sp.)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、小新月菱形藻(Nitzschia closterium)均由大连金砣水产公司赠予。藻种活化及扩增培养所用培养基为经0.45 μm滤膜过滤，并于121 ℃灭菌锅中高温灭菌后的海水配置的f/2培养基(小新月菱形藻需加入500 g/L Na2SiO3)。3种微藻接种于5 L锥形瓶中培养，培养基与灭菌海水按体积比5∶1 000混合配置，培养体积为3 L，温度维持在25 ℃±1 ℃，光照强度为150 μmol/m2/s，光暗周期为24L：00D，瓶口使用无菌透气封口膜。为避免藻种受到污染，试验中所用器具在使用前均高温灭菌。
1.2 方法
1.2.1 长牡蛎滤食能力评估 试验开展了不同微藻种类、暂养温度、盐度及长牡蛎种类条件下长牡蛎滤食能力的评估。试验前将长牡蛎饥饿处理24 h，记录长牡蛎壳长、壳宽及壳高等外形指标，挑选出各外形指标相似的长牡蛎开展试验。试验过程维持长牡蛎养殖密度为0.2 ind./L，不同微藻的初始投喂密度均为1×106 cells/mL，使用血球计数法计算每小时藻细胞密度变化，计算长牡蛎对微藻的滤食率(FR)，每组设置4次重复。取样前充分混匀水体，具体试验设置见表1。
表1 试验设计
Tab.1 Experimental design
组别group盐度salinity微藻种类microalgae species温度/℃temperature试验对象experimental oystert滤食时间/hfeeding timea30海水小球藻、球等鞭金藻、小新月菱形藻25三倍体长牡蛎8b30海水小球藻10,15,25三倍体长牡蛎8c2,10,20,30海水小球藻25三倍体长牡蛎6d30海水小球藻25 ℃二倍体长牡蛎、三倍体长牡蛎8
注：a为不同微藻种类；b为不同温度；c为不同盐度；d为不同牡蛎类型。
Note：a represents the different microalgae species；b represents the different temperature；c represents the different salinities；d represents the different oyster types.
滤食率(FR)计算公式为
RFR=(C0-C1)×V/C0。
(1)
式中：C0、C1分别为试验前后海水中微藻细胞密度(cells/mL)；V为海水体积(L)；t为滤食时间(h)。
1.2.2 盐度对长牡蛎出肉率和肥满度的影响 短期试验发现，盐度为0条件下长牡蛎存活率较低，故长时间暂养试验设置10、20、30 3个盐度梯度，养殖密度为0.13 ind./L，水温维持在10 ℃±1 ℃，每日换水并投入海水小球藻，维持1×106 cells/mL 的初始投喂密度，试验持续15 d。试验结束后，每组取长牡蛎20 ind.，沥干水分称量其湿全质量、湿软体质量，60 ℃下烘干48 h，冷却至室温后称量其软体干质量及壳干质量，计算长牡蛎的出肉率(MY，%)和肥满度(F，%)，每组设置3次重复。
YMY=W1/W2×100%，
(2)
F=W3/W4×100%。
(3)
式中：W1为长牡蛎湿软体质量(g)；W2为长牡蛎湿全质量(g)；W3为长牡蛎软体干质量(g)；W4为长牡蛎壳干质量(g)。
1.2.3 盐度对长牡蛎不同组织生化组分的影响 将不同盐度组的长牡蛎置于冰上快速解剖，分别取长牡蛎外套膜、鳃、闭壳肌、性腺，置于-80 ℃超低温冰箱保存，检测前室温解冻并避免反复冻融。使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测其各组织中蛋白质、糖原含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量，每组样品设置3个平行，测定步骤参考说明书。
1)蛋白质含量分析。取组织样本各100 mg，加入9倍体积的生理盐水，冰水浴条件机械匀浆，2 500 r/min下离心10 min，取上清液稀释成1%组织匀浆，添加考马斯亮蓝显色剂，摇匀后于595 nm波长处测量OD值，计算各组蛋白质浓度。
2)糖原含量分析。取各组织样本100 mg用生理盐水漂洗后，按质量体积比1∶3加入碱液制成匀浆，沸水浴煮，加入相应显色液，测定不同盐度条件下各组织中的糖原含量。
3)抗氧化酶活性分析。取各样本100 mg，然后加生理盐水研磨制成10%匀浆，3 000 r/min 下离心10 min，取上清液分别测定SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量，并以单位质量蛋白质进行标准化。
1.3 数据处理
试验均采用平均值±标准误(mean±S.E.)来表示试验数据。利用GraphPad Prism软件进行图表制作，使用SPSS 21软件进行组间单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan方法比较各组间差异，显著性差异设为0.05。通过综合生物响应模型IBR模型，评估微藻粒径、温度、盐度及牡蛎倍性对长牡蛎微藻滤食效率的影响。
2 结果与分析
2.1 长牡蛎滤食能力评估
长牡蛎对3种微藻的滤食效率具有明显的种间差异(图1(a))。随滤食时间延长，长牡蛎对3种微藻的滤食率均呈降低趋势，对球等鞭金藻和小新月菱形藻的滤食率在初始1 h内相对较高，之后迅速下降，滤食率分别维持在1.82×108、9.51×107 cells/h/ind.。8 h内长牡蛎对海水小球藻的平均滤食率最高(2.12×108 cells/h/ind.)。温度响应试验表明，10 ℃～25 ℃条件下长牡蛎均能滤食海水小球藻，且滤食率与温度呈显著正相关，低温条件会抑制长牡蛎对海水小球藻的滤食，10 ℃暂养条件下平均滤食率为9.08×107 cells/h/ind.(图1(b))。长牡蛎于1 h滤食率最高，随后呈波动下降趋势。不同盐度条件下，随时间延长长牡蛎滤食率均呈下降趋势(图1(c))。2～30盐度范围内滤食率与盐度存在正相关性，各组均在1～2 h表现出最高滤食率，其中30盐度条件下长牡蛎对海水小球藻平均滤食率达2.21×108 cells/h/ind.。此外，三倍体个体对小球藻滤食效率高于二倍体个体(图1(d))，其8 h平均滤食率分别为8.68×107、5.86×107 cells/h/ind.，且与其他环境条件一致，随时间延长二倍体和三倍体长牡蛎的滤食率均呈下降趋势。
图1 不同因素对长牡蛎滤食能力的影响
Fig.1 Effects of different factors on the filtration capacity of Crassostrea gigas
IBR分析表明，长牡蛎对微藻的滤食率与温度、盐度、倍性呈正相关(图2)。其中，盐度与长牡蛎滤食能力的相关性最为密切，相关系数大小依次为盐度(0.715**)>温度(0.641*)>倍性(0.321)。相反，长牡蛎对微藻的滤食率与藻种粒径呈负相关(-0.567)，小新月菱形藻粒径最大，长牡蛎对其滤食率最低。
图2 长牡蛎微藻滤食率的IBR分析
Fig.2 IBR analysis of microalgae filtration rate of Crassostrea gigas
2.2 不同盐度暂养对长牡蛎出肉率及肥满度的影响
在短时间暂养条件下，不同盐度梯度对长牡蛎的出肉率影响较小(图3(a))。盐度0～30梯度组长牡蛎的出肉率为20.47%～22.38%，其中盐度20组的出肉率最高。短时间低盐度暂养可显著提升长牡蛎的肥满度(图3(b))，当盐度为0时，长牡蛎肥满度为8.88%，显著高于其他盐度组(P<0.05)，且随盐度升高肥满度呈降低趋势。
标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。
The means with different letters are significantly different among the groups(P<0.05)，and the means with the same letters are not significantly different among the groups(P>0.05)，et sequentia.
图3 不同盐度对长牡蛎品质的影响
Fig.3 Effects of different salinities on the quality of Crassostrea gigas
在长期暂养试验中，在盐度10下长牡蛎的出肉率最高，达到36.49%，显著高于盐度20组(21.06%)和盐度30组(22.81%)(P<0.05)(图3(c))。长牡蛎在盐度0下表现出最佳肥满度，达8.17%，高于20盐度组(7.31%)和30盐度(7.57%)(P>0.05)(图3(d))。与短时间暂养结果相反，长时间暂养中盐度0组的死亡率最高，导致无法在该盐度下继续进行剩余试验。
进一步分析盐度10、20、30下长牡蛎的湿软体质量、湿全质量、软体干质量、出肉率和肥满度之间的相关性。从图4可见，盐度与各生长指标均呈负相关，其中盐度与湿软体质量呈显著负相关关系(P<0.05)；而各生长指标间存在正相关性，其中软体干质量与湿软体质量、出肉率与湿全质量呈极显著正相关性(P<0.01)；壳干质量与盐度呈负相关，与其他指标呈正相关。
图中数值为相关系数；*表示P<0.05，**表示P<0.01。
Values in the figure represent the correlation coefficients；* means P<0.05，** means P<0.01.
图4 相关性分析
Fig.4 Correlation analysis
2.3 不同盐度暂养对长牡蛎各组织中蛋白质及糖原含量的影响
从图5(a)可见，在正常培养条件下(盐度30)，长牡蛎外套膜和性腺中蛋白质含量较高，各组织中蛋白质含量均随盐度的下降而降低，其中外套膜和内脏团中蛋白质含量在各组间存在显著性差异(P<0.05)。在闭壳肌组织中，盐度30组的蛋白质含量显著高于其他盐度组(P<0.05)。鳃组织中蛋白质含量在各盐度处理组间均无显著性差异(P>0.05)。
图5 不同盐度对长牡蛎各组织蛋白质含量和糖原含量的影响
Fig.5 Effects of different salinity on the protein content and glycogen content in various tissues of Crassostrea gigas
从图5(b)可见，在正常培养条件下(盐度30)，长牡蛎各组织中糖原含量呈组织特异性分布，内脏团中含量最高，闭壳肌中最低。在低盐条件下，外套膜和闭壳肌组织中普遍出现糖原积累现象，盐度20下糖原含量显著高于其他盐度组(P<0.05)。而在内脏团与鳃组织中糖原含量则保持相对稳定，各盐度组间无显著性差异(P>0.05)。
2.4 不同盐度对长牡蛎抗氧化能力的影响
从图6可见，盐度变化对长牡蛎抗氧化酶系统产生显著的组织特异性影响。SOD作为长牡蛎抗氧化防御的第一道防线，在低盐条件下不同组织中SOD活性均呈升高趋势。在内脏团和鳃组织中，盐度10组SOD活性显著高于其他组(P<0.05)，而闭壳肌组织的SOD活性在盐度20组最高(P<0.05)。闭壳肌中CAT活性与盐度呈正相关，其在盐度30组显著高于盐度10组(P<0.05)。在外套膜和内脏团组织中，盐度20条件下的CAT活性达到峰值(P<0.05)。鳃组织的CAT活性在不同盐度条件无显著性差异(P>0.05)。与SOD活性相反，低盐度条件会降低长牡蛎各组织GSH-Px活性。在内脏团、闭壳肌组织中盐度10组低于盐度20组，而在与海水直接接触的外套膜及鳃组织中，GSH-Px活性在低盐度10组高于盐度20组。MDA作为脂质过氧化的产物，其在长牡蛎闭壳肌中含量最低，且各盐度组无显著性差异(P>0.05)。低盐度暂养会导致外套膜和内脏团组织中MDA含量增加，盐度20组MDA含量显著高于盐度30组(P<0.05)。而鳃组织中MDA含量则在低盐度条件下显著降低(P<0.05)。
图6 不同盐度对长牡蛎各组织抗氧化酶活性的影响
Fig.6 Effects of different salinity on the antioxidant enzyme activities in various tissues of Crassostrea gigas
3 讨论
3.1 不同因素对长牡蛎滤食能力的影响
随着市场对牡蛎品质要求的提升，工厂化暂养牡蛎技术日益受到关注。其中，饵料选择及环境条件控制尤为重要，但相关研究仍显不足。牡蛎在滤食过程中对微藻具有选择性，太平洋牡蛎倾向于优先滤食小规格的藻类[16]，与本研究结果一致，长牡蛎偏爱于滤食海水小球藻，其次是球等鞭金藻、小新月菱形藻。这主要与微藻的粒径直接相关，小球藻的粒径通常为3～8 μm，这个尺寸范围易于被长牡蛎的鳃丝和黏液纤毛捕捉。球等鞭金藻细胞及小新月菱形藻细胞粒径相对较大，且球等鞭金藻具有鞭毛和趋光性，不易被纤毛捕捉[16]。小球藻不仅具备理化特征适配性，且其富含蛋白质、维生素、矿物质，以及酚类和类胡萝卜素等抗氧化物质[17]，可满足牡蛎健康生长发育的需求。此外，三倍体长牡蛎因其生长快、出肉率高等优点已成为主要养殖品系，在本研究中其微藻滤食能力显著优于二倍体长牡蛎。同样，相同海域、同一规格的三倍体美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的滤食率也强于二倍体，与本研究结论一致[18]。三倍体牡蛎通过减少在生殖过程中的能量投入，使其摄食代谢强度与能量转换效率较二倍体个体显著提升，提示在牡蛎工厂化暂养过程需根据倍性合理配置投饵量。
滤食性贝类对微藻的滤食能力受到养殖温度与盐度等环境因子的直接影响。长牡蛎能在10 ℃～30 ℃的水域良好生长，在25 ℃条件下滤食率达峰值。温度是影响贝类生理活跃度、酶活性的关键调控因素，在适宜的温度范围内，纤毛摆动频率与温度呈正相关[19]。过高温度可能导致酶变性[19]，影响代谢速率，而低温则会抑制酶活性，进而抑制生理机能。在温度胁迫下，长牡蛎需消耗更多的能量来适应外界环境的变化，同时可能引起氧化损伤，进而影响牡蛎的滤食能力和生长速度[20]。盐度变化直接影响长牡蛎的渗透压平衡，当渗透压的改变超过本身可调控范围时，就会直接影响动物体内Na+、K+、Cl-离子浓度，进而对其滤食能力、存活率和渗透压调节能力产生影响[21]。同时，盐度也会影响牡蛎的生长和代谢过程。有研究表明，高盐度胁迫导致缢蛏(Sinonovacula constricta)鳃组织溶解，死亡率增加[22]。
3.2 盐度对长牡蛎出肉率和肥满度的影响
在本研究中，长期低盐胁迫表现出较高的出肉率和肥满度，提示长牡蛎可通过能量分配重构来应对胁迫，这种重构可能通过影响附着力、鳃纤毛运动及心脏跳动来增强能量代谢并调整能量分配以适应盐度胁迫[23]。长时间盐度胁迫也会影响牡蛎体内蛋白质和糖原的含量，这些能量代谢资源的分配直接决定了牡蛎在低盐环境中的存活与生长表现。蛋白质在牡蛎的能量代谢、贝壳形成、环境应激响应、免疫功能及生长和发育中发挥着多方面的作用[24]。Fuhrmann等[25]发现，牡蛎中与糖酵解相关的蛋白质浓度随着盐度的降低而增加，而本研究中发现，除鳃组织外，其他组织的蛋白质浓度均随盐度降低而降低。鳃作为渗透压调节的关键器官，对盐度变化更为敏感，当盐度降低时，鳃组织会上调离子转运相关蛋白基因的表达，合成转运蛋白以平衡渗透压。糖原是牡蛎主要的供能物质，参与长牡蛎生长、繁殖和抗逆等生理活动，长牡蛎的肥满度与糖原含量呈现显著正相关性[26]。现有研究普遍发现，低盐胁迫会降低贝类的糖原含量。如Freitas等[27]发现，紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)糖原含量在盐度14条件下显著低于盐度35组。Carregosa等[28]发现，菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)在极端盐度下表现出较低的糖原含量。而本研究中，在低盐度条件下，长牡蛎各组织的糖原含量反而增加，这可能和胁迫时间有关，短时间胁迫可能会诱导长牡蛎合成更多糖原以应对低盐胁迫的挑战。长牡蛎可能通过糖原分解产物参与渗透调节以维持离子平衡[29]，同时调整能量分配策略，优先保障基础代谢需求而抑制非必需生理活动[30]。这种应激性糖原积累现象反映了长牡蛎对低盐环境的适应性策略，但其分子机制仍需进一步研究。
3.3 盐度对长牡蛎不同组织的影响
海洋贝类缺乏特异性免疫细胞和抗体，主要依赖抗氧化相关酶系统及非特异性酶系统调节和保护自身[31]。其中，SOD是抗氧化酶系统的第一道防线[32]，CAT能够分解过氧化氢，生成水和氧气，GSH-Px可清除过氧化氢和长牡蛎脂质过氧化物，MDA可评估细胞脂质过氧化损伤程度[33]。正常生理状态下，生物体维持活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的动态平衡，盐度胁迫会诱导ROS的产生，过量ROS可能导致脂质过氧化，损害细胞结构和功能，激活牡蛎抗氧化系统。Wei等[34]的研究表明，大珠母贝(Pinctada maxima)在低盐条件下，其血淋巴中SOD和GSH活性显著升高，而在高盐度条件下活性下降。本研究中长牡蛎在低盐胁迫下，各组织内普遍观察到SOD活性升高，不同组织均会清除过量积累的ROS，以应对低盐急性氧化压力。Fuhrmann等[25]观察到低盐胁迫会降低牡蛎CAT活性，影响机体对关键氧化产物过氧化氢的分解效率，与之相反，本研究中发现，低盐胁迫诱导了长牡蛎组织CAT活性升高，这可能是长牡蛎对抗氧化应激的保护性响应。相比之下，GSH-Px响应滞后，其在低盐条件下受到抑制，可能是过氧化氢积累氧化消耗GSH-Px，干扰GSH代谢途径[35]。此外，盐度胁迫引发的氧化损伤可直接反映为脂质过氧化产物MDA含量的升高。葛红星等[36]报道青蛤(Cyclina sinensis)低盐适应初期MDA显著升高，相似的，本研究中，在低盐胁迫条件下长牡蛎外套膜、内脏团及闭壳肌中MDA均呈上升趋势，提示长时间盐度胁迫会引发脂质过氧化损伤。从短期来看，长牡蛎能够通过提高抗氧化酶活性来应对低盐胁迫，然而，当长牡蛎长期处于低盐胁迫下，持续激活抗氧化防御机制导致能量消耗增加，就会抑制其生长，同时，低盐环境易引发长牡蛎体内能量失衡，影响肉质和品质，进而降低其市场价值。
4 结论
1)工厂化暂养牡蛎可通过对饵料及环境条件的控制有效提高牡蛎的暂养效果。本研究系统分析了饵料微藻种类、温度、盐度及牡蛎倍体对长牡蛎滤食性能的影响，发现长牡蛎对微藻的粒径具有明显的选择性，三倍体长牡蛎相较于二倍体显示出更强的滤食能力，在25 ℃和30盐度条件其滤食能力较强。
2)长时间低盐条件暂养长牡蛎可提高其出肉率和肥满度，但会引起牡蛎能量代谢重构和抗氧化防御系统激活，进而影响牡蛎的品质和抗逆性。本研究结果为牡蛎工厂化暂养技术的发展提供了重要的科学依据。
致谢：在此衷心感谢众鲜达乐农科技江苏有限公司对本研究的资金支持。
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