在水生生态系统中，浮游动物是初级生产力和更高营养水平之间的重要联系纽带，影响生态系统运行和鱼类食物补充[1-3]。浮游动物的种群数量和分布特征在不同季节有所不同，且其受环境因素的影响较大[4-6]。此外，借助于浮游动物对环境污染敏感的特点，对浮游动物的群落组成、生物量和丰度的动态变化、浮游动物物种多样性等进行研究，可为了解和评价水生生态系统健康状况提供科学依据[7-8]。
从单个环境样品(土壤、水样、粪便)中，甚至是古代环境样本中获取DNA，然后进行分子标记的PCR扩增，再进行高通量测序的技术称为DNA宏条形码(DNA metabarcoding)技术[9-10]。宏条形码技术是一种结合DNA条形码和高通量测序的新方法，可用于生物多样性快速评估，可以对物种进行快速、准确地识别和鉴定，已成为物种多样性调查的有效手段。DNA宏条形码以高通量、低成本、快速鉴定大量物种的优势，已广泛应用于海洋生态调查等领域，如生物多样性分析、遗传多样性研究、食性分析、生态评估等多方面[11]。
Schroeder等[12]对比分析形态学方法和DNA宏条形码技术，研究了威尼斯潟湖和附近沿海地区(亚得里亚海北部)浮游动物的群落结构及多样性，发现DNA宏条形码技术更好地区分了浮游动物成分，分类群丰富度更高。张金勇等[13]通过宏条形码分子方法和形态学鉴定方法对马来西亚马塘红树林保护区浮游动物进行物种组成及多样性的比较研究。利用形态学方法鉴定得到的分类单元中多数能通过宏条形码技术得以识别；然而宏条形码技术所鉴定出的绝大部分类群却无法通过形态学手段进行有效鉴定。李超伦等[14]研究了DNA条形码在海洋浮游动物生态学中的应用，通过分析海洋中桡足类、介形类等浮游动物类群得出DNA条形码将提供除种类鉴定外更加丰富的信息，从而使人们更好地理解海洋生物的多样性及其在生态系统中的功能。高养春等[15]采用宏条形码分子方法结合显微镜计数对鸭绿江优势类群桡足类进行多样性的比较研究，结果发现，宏条形码分子鉴定方法共鉴定出4目23科，而形态学方法仅鉴定出3目5科，宏条形码分子技术显著提升了生物群落物种组成解析的效率和精度。冯芸芝等[16]对海洋浮游生物18S rDNA V4及V9区进行高通量测序，探讨了不同分子标记的类群偏好性，检出的生物种类和组成存在差异，研究结果表明，V4区更多用于浮游生物的检测。以上研究证实了DNA宏条形码技术在监测浮游生物多样性方面的潜力与重要地位。
普兰店湾是许多鱼类、虾蟹类的重要产卵场、育幼场和索饵场。浮游动物作为水产动物的重要饵料，其数量、种类和出现时间将直接影响渔业资源的变化。研究该海域的浮游动物动态，对于理解和保护当地渔业资源、评估海湾的生态承载能力具有现实意义。2009年以来，普兰店湾水质逐步恶化，水域环境日益引起公众和管理部门的关注[17]。有关普兰店湾海域环境容量和污染物排放量等已进行了不少调查与监测，但尚缺乏浮游动植物、底栖生物和珍稀濒危物种等生物多样性状况的资料和变化规律的研究，因此，选择普兰店湾作为研究区域具有代表性和现实意义。本研究中首次应用DNA宏条形码方法分析了普兰店湾内浮游动物群落结构及多样性。利用MiSeq PE300测序平台比较16S、18S V4和18S V9区引物对浮游动物群落表征的差异，探究了不同引物对该海域浮游动物宏条形码监测的影响，证实了DNA宏条形码技术在普兰店湾浮游动物研究中的适用性。此外，本研究还对辽东湾浮游生物群落进行了高通量测序与生物信息学分析，以补充该海域浮游生物的分子数据库，并为辽东湾乃至同类近海生态系统的长期生物多样性监测、评估与保护管理提供精准、高效且可复制的分子方法学参考与决策支持。
1 材料与方法
1.1 调查时间及采样站位
2021年5月在大连普兰店湾海域布置5个采样站位，站位设置的分布如图1所示，各采样站位的具体经纬度及采样水深见表1。
图1 普兰店湾浮游动物采样站位
Fig.1 Sampling stations in Pulandian Bay
表1 采样站位和水深
Tab.1 Sampling stations and water depth
采样站位sampling station水深/mwater depth东经east longitude北纬north latitudepw33121°48'34″39°22'22″pw87121°42'42″39°23'54″pw107121°43'00″39°22'59″pw1814121°37'01″39°13'49″pw2216121°32'29″39°09'56″
1.2 方法
1.2.1 样品采集 使用浅水Ⅰ型浮游生物网(网目孔径0.505 mm，网口内径50.0 cm，网长145 cm)，依据《海洋监测规范第7部分：近海污染生态调查和生物监测》(GB 17378.7—2007)采集浮游动物样品。采集的浮游动物保存在新的采样瓶中，加入无水乙醇固定样品，用于后续基因组DNA提取。
1.2.2 基因组DNA提取 使用DNeasy 血液和组织试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取样品中的总DNA，提取后用超微量紫外-可见分光光度计NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific，USA)检测其浓度，10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，检测合格的DNA置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 PCR扩增及高通量测序 由Zhan等[18]研究可知，传统 COI 引物与16S和18S引物相比，难以提供稳定的PCR产物，因此进行浮游动物研究时建议选择18S和16S基因。以每个样品的基因组DNA为模板，分别对16S区、18S V4区和18S V9区进行扩增，所采用的引物均为浮游动物通用引物，引物序列见表2。为了区分每份浮游动物样品，每对PCR引物合成前分别添加8 bp的Barcode标签[18]。
表2 本研究所使用的3对通用引物
Tab.2 Three pairs of universal primers for this study
引物primer引物序列(5'-3')primer sequence (5'-3')参考文献reference16SF:TRACYGTGCDAAGGTAGCR:YTRRTYCAACATCGAG-GTCZhan等[19]18S V4F:AGGGCAAKYCTGGTGC-CAGCR:GRCGGTATCTRATC-GYCTTAmaral-zettler等[20]18S V9F:TTGTACACACCGCCCR:CCTTCYGCAGGTTCAC-CTACParameswaran等[21]
利用Qubit3.0 DNA检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)精确定量基因组DNA，以确定PCR反应应加入的DNA量。PCR第一轮扩增反应体系用2×Hieff® Robust PCR Master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F 1 μL，Primer R 1 μL，PCR products 10～20 ng，用ddH2O补足至30 μL；PCR反应程序为94 ℃下预变性3 min，94 ℃下变性20 s，55 ℃下退火20 s，72 ℃下延伸30 s，共进行30个循环，最后在72 ℃下再延伸5 min。通过20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，为了得到均匀的长簇效果和高质量的测序数据，使用Qubit3.0荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific，USA)进行文库浓度测定，最终测序文库使用Illumina MiSeq PE300平台(San Diego，CA，USA)进行测序。
1.3 数据处理
使用FastQC程序[22]，修剪每个MiSeq读数的尾部，直到最后一个碱基的Phred质量得分(与碱基检出准确度相关)≥20。然后，配对末端读数(MiSeq平台中的R1和R2)，当读数对重叠超过9 bp时，使用Flash程序[23]组装，否则被丢弃。获取有效数据后，采用Usearch v11.0.667[24]对获得的高质量序列按照97%一致性水平进行可操作性分类单元(operational taxonomic units，OTUs)聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTUs用于后续分析。利用RDP Classifier v2.12软件(Michigan State University，USA)对聚类获得的OTUs通过blastn程序与NCBI Nr(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库进行序列分类注释，一致性>90%且coverage>90%的序列被用于后续分类，不满足条件的序列则被归为未分类，根据一致性98%、95%、90%、85%和80%的阈值依次赋予种、属、科、目和纲5个分类水平的界限。
Coverage指数和α 多样性指数(Chao1、Ace、Shannon及Simpson指数)采用Mothur v 1.30.2软件(University of Michigan，USA)计算所得。使用较直观的条形图形式呈现不同分类阶元(门、纲、目和科)上的群落组成情况，箱体图分析基于不同宏条形码引物的浮游动物多样性及丰度特征。其中条形图、箱体图在Origin 8.0软件中进行，散点图、Spearman相关性分析在SPSS 19.0软件中完成。利用R的vegan package中的冗余分析(RDA)用于阐明不同环境因子在调节浮游动物群落结构中的作用。
2 结果与分析
2.1 不同宏条形码引物测序浮游动物稀释性曲线
16S引物测序结果显示，样本的原始测序数据经过拼接和质量过滤后，总共获得273 312条序列，每个站位样品的有效序列片段数量为47 834～60 317条，平均为54 662.4条序列，经去除重复序列、OTU聚类(97%的阈值)等步骤，所有站位样品总共获得72个OTUs(图2(a))；18S V4区引物测序结果显示，样本的原始测序数据经过拼接和质量过滤后，总共获得226 567条序列，每个站位样品的有效序列片段数量为27 450～57 092条，平均为45 313.4条序列，经去除重复序列、OTU聚类(97%的阈值)等步骤，18S V4区引物所有站位样品总共获得77个OTUs(图2(b))；18S V9区引物测序结果显示，样本的原始测序数据经过拼接和质量过滤后，总共获得269 897条序列，每个站位样品的有效序列片段数量为46 799～60 631条，平均为53 979.4条序列，经去除重复序列、OTUs聚类(97%的阈值)等步骤，18S V9区引物所有站位样品总共获得470个OTUs(图2(c))。根据OTUs数目做的样品稀释曲线(图2)，所有站位样品OTUs数目都趋于饱和，表明各样品测序数据量足够覆盖大部分的种类。原始测序读长数据已存入NCBI SRA数据库，访问编号为SRR35166186。
图2 基于16S、18S V4和V9区引物测序浮游动物样品OTUs数目稀释性曲线
Fig.2 Rarefaction curves of OTUs number in zooplankton samples based on primers of 16S，18S V4，and 18S V9
2.2 基于不同宏条形码引物的浮游动物多样性指数
从图3(a)可以看出，各样品文库的覆盖率较高，表明样本序列检出率高，测序结果真实可靠。基于Ace、Chao1、Shannon和Simpson指数，探讨在不同引物条件下浮游动物的多样性特征，本研究结果表明，基于18S V9区引物获得的浮游动物的Ace、Chao1和Shannon 指数均显著高于16S和18S V4引物获得的浮游动物的多样性指数(P<0.05，图3(b)～(d))；但基于18S V4区引物获得的Simpson指数显著高于16S和18S V9(P<0.05，图3(e))。
图3 不同引物检测到的浮游动物多样性指数的变化
Fig.3 Variation of zooplankton diversity index detected by different primers
2.3 基于不同宏条形码引物的浮游动物群落结构分析
基于不同宏条形码引物，对比分析门、纲、目、科分类阶元上大连普兰店湾浮游动物的物种组成(图4、图5)。本研究中发现，在不同的引物条件下，大连普兰店湾浮游动物的群落结构组成差异性较大。在门分类阶元上，从图4(a)可以看出，16S引物共检出6门，18S V4区引物检出9门，18S V9区引物检出34门，三者共有4门相同。从图5(a)可以看出，16S引物检出的浮游动物以节肢动物门(Arthropoda)和脊索动物门(Chordata)为主，占总丰度的比例分别为74.28%和25.13%；以18S V4区引物检出的浮游动物以节肢动物门所占比例最大，为78.1%；以18S V9区引物检出的浮游动物主要为节肢动物门(83.12%)和环节动物门(Annelida，3.48%)。
图4 不同引物检出的浮游动物在不同分类阶元的韦恩图
Fig.4 Venn of zooplankton at different classfication levels detected by different primers
图5 不同引物检出的浮游动物在不同分类阶元的相对丰度
Fig.5 Relative abundance of zooplankton at different classfication levels detected by different primers
在纲分类阶元，从图4(b)可以看出，16S引物共检出10纲，18S V4区和18S V9区引物检出数分别为20纲和79纲，三者共有6纲相同。从图5(b)可以看出，16S引物检出的浮游动物中软甲纲(Malacostraca)的reads数占比最高，占总丰度比例为74.33%；以18S V4区引物检出的浮游动物中软甲纲和颚足纲(Maxillopoda)的平均reads数处于前2位，分别占59.05%和19.31%；以18S V9引物检出的浮游动物中颚足纲、六只幼虫纲(Hexanauplia)和多毛纲(Polychaeta)的reads数较多，所占比例分别为65.94%、18.00%和3.49%。
在目分类阶元上，从图4(c)可以看出，16S引物、18S V4区和18S V9区引物分别检出20、37和158目，共有8目相同。从图5(c)可以看出，基于16S引物检出的浮游动物相对丰度较高的目为十足目(Decapoda)、端足目(Amphipoda)、norank_Malacostraca和糠虾目(Mysida)，所占比例分别为61.66%、8.86%、3.24%、0.56%；基于18S V4区引物检出的浮游动物主要包括十足目、norank_Malacostraca和哲水蚤目(Calanoida)，占总丰度比例分别为40.36%、18.96%和19.04%；以18S V9区引物检出的浮游动物主要包括十足目(24.52%)、norank_Malacostraca(17.61%)、哲水蚤目(17.74%)、糠虾目(14.34%)、端足目(10.36%)和无柄目(Sessilia，0.38%)。
在科分类阶元上，从图4(d)可以看出，16S引物检出数最低，共检出37科，18S V4区检出52科，18S V9区引物检出数最多，共检出222科，三者共有10科相同。从图5(d)可以看出，基于16S引物检出的浮游动物主要包括长臂虾科(Palaemonidae)、弓蟹科(Varunidae)、藻钩虾科(Ampithoidae)、虾蛄科(Squillidae)、美人虾科(Callianassidae)、豆蟹科(Pinnotheridae)和糠虾科(Mysidae)等，所占比例分别为43.93%、14.51%、8.49%、3.2%、1.07%、0.74%和0.55%；基于18S V4区引物检出的浮游动物相对丰度较高的科为长臂虾科、卓虾蛄科(Takuidae)、纺锤水蚤科(Acartiidae)、藻虾科(Hippolytidae)、哲水蚤科(Calanidae)、宽水蚤科(Temoridae)、弓蟹科和美人虾科，占总丰度的比例分别为32.10%、18.60%、11.98%、6.58%、5.12%、1.44%、0.92%和0.39%；基于18S V9区引物检出的浮游动物相对丰度较高的科为长臂虾科(18.35%)、虾蛄科(17.18%)、糠虾科(13.49%)、纺锤水蚤科(10.09%)、双眼钩虾科(5.36%)、哲水蚤科(5.32%)、藻虾科(4.76%)、藻钩虾科(4.69%)和裂虫科(Syllidae，3.46%)。
基于16S引物检出的优势物种共有4种，包括强壮藻钩虾(Ampithoe valida)、巨指长臂虾(Palaemon macrodactylus)、绒毛近方蟹(Hemigrapsus penicillatus)、虾蛄(Oratosquilla oratoria)；基于18S V4引物检出的优势物种共有6种，包括长额猬虾(Palaemon longirostris)、溞鲨虾蛄(Taku spinosocarinatus)、沃氏纺锤水蚤(Acartia omorii)、北极哲水蚤(Calanus glacialis)、水母深额虾(Latreutes fucorum)、太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)；基于18S V9引物检出的优势物种共有8种，包括螳螂虾蛄(Squilla mantis)、锯齿长臂虾(Palaemon serrifer)、美洲糠虾(Neomysis americana)、哈德逊纺锤水蚤(Acartia hudsonica)、北极哲水蚤(Calanus glacialis)、太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)、深额虾属(Latreutes sp.BOLD：ACR5469)，见表3。
表3 基于16S、18S V4和V9区引物测序浮游动物群落优势种名录
Tab.1 List of dominant species in planktonic community based on 16S，18S V4，and V9 region primer sequencing
引物名称primers物种species优势度Y强壮藻钩虾(Ampithoe valida)0.069 748 3216S巨指长臂虾(Palaemon macrodactylus)0.434 230 49绒毛近方蟹(Hemigrapsus penicillatus)0.135 017 74虾蛄(Oratosquilla oratoria)0.032 034 38长额猬虾(Palaemon longirostris)0.433 150 88溞鲨虾蛄(Taku spinosocarinatus)0.185 371 5518S V4纺锤水蚤(Acartia omorii)0.103 524 44北极哲水蚤(Calanus glacialis)0.064 397 15水母深额虾(Latreutes fucorum)0.043 831 18太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)0.030 020 98螳螂虾蛄(Squilla mantis)0.173 867 20锯齿长臂虾(Palaemon serrifer)0.163 348 92美洲糠虾(Neomysis americana)0.087 852 3918S V9哈德逊纺锤水蚤(Acartia hudsonica)0.068 850 70北极哲水蚤(Calanus glacialis)0.059 832 87太平洋纺锤水蚤(Acartia pacifica)0.030 220 68深额虾属(Latreutes sp. BOLD:ACR5469)0.029 915 30
2.4 浮游动物群落结构与环境因子的相关性分析
为研究浮游动物群落结构与环境因子的关系，将不同引物的优势类群与环境因子进行冗余分析。分析结果如图6所示，从图6可知，水深(DTW)和溶解氧(DO)是影响16S、18S V4和18S V9区引物所获得的普兰店湾所有站位浮游动物优势类群结构的主要因素。从图6(a)可知，水深对优势类群的分布影响最大，部分物种与水深呈负相关关系，强壮藻钩虾与水深正相关性最强；从图6(b)可知，溶解氧与水深对优势类群的分布有较大影响，大部分优势物种与溶解氧存在正相关关系，其中北极哲水蚤相关性最强。从图6(c)可知，水深和溶解氧是影响优势类群结构的主要因素，大部分类群与水深呈负相关关系，锯齿长臂虾、太平洋纺锤水蚤、螳螂虾蛄与其呈正相关关系，其中锯齿长臂虾相关性最强。绝大部分类群与溶解氧呈正相关关系，其中美洲拟哲水蚤正相关性最强。
图6 基于16S、18S V4和V9区引物测序浮游动物群落结构与环境因子相关性的RDA分析
Fig.6 Redundancy analysis of correlation between zooplankton community structure and environmental factors
3 讨论
3.1 不同宏条形码引物的浮游动物丰度特征
从图7可见，基于不同宏条形码引物大连普兰店湾水域浮游动物的丰度存在差异性。其中，基于18S V9区引物检出的浮游动物的reads数最高，而18S V4区引物检出的reads数最低(图7(a))；基于18S V9区引物检出的浮游动物的OTUs数目均显著高于16S和18S V4区检出的浮游动物的OTUs数目(P<0.05，图7(b))。另外，从图7可见，18S V9区引物检出的浮游动物的reads数和OTUs数目最高，呈现出较为一致的变化趋势，而18S V4区引物检出的浮游动物的reads数较丰富，但OTUs数目较低。
图7 不同引物检出的浮游动物Reads数和OTUs数目的丰度特征
Fig.7 Richness features of zooplankton Reads number and OTUs number detected by different primers
18S V9区引物物种覆盖度最高，有大量OTUs被注释到长臂虾科、虾蛄科和糠虾科等21个科分类阶元，18S V4区和16S引物则分别注释到10、14个科，不同引物在物种覆盖度层面呈现出18S V9>16S>18S V4的趋势。另外，就不同引物的扩增特异性而言，18S V9区引物对浮游动物具有更高的扩增特异性，浮游动物丰度的占比为85.21%，而18S V4区和16S引物分别为77.13%和73.22%。张莉等[25]在对比分析ITS、18S V4和18S V9区引物黄海微型真核浮游植物多样性水平时，同样发现18S V9区引物获得的物种丰度更高。
本研究中使用的18S V9区引物的扩增产物长度为140 bp，在满足高通量测序读长要求的同时还兼顾了物种辨识敏感性。18S V9区引物测序中检出的浮游动物占比最高，并且长臂虾科(18.87%)、虾蛄科(17.76%)和糠虾科(14.66%)等占浮游动物群落总丰度的比例比较均衡。18S V9区引物所发现的物种数量也最多，更为适合浮游动物群落组成的研究。
3.2 不同宏条形码引物检出的浮游动物群落结构及多样性特征
研究发现，基于不同宏条形码引物检出的普兰店湾浮游动物群落结构均以节肢动物门为主，本次调查发现的类群与李雨轩等[26]于2013—2022年在大连湾进行的海洋浮游动物群落镜检结果相同。具体而言，基于16S引物检出的节肢动物门占比为74.28%，基于18S V4区引物获得的节肢动物门占比为78.1%，而基于18S V9区引物检出的节肢动物门占比最高，达到83.12%。Hirai等[27]在研究日本北海道海域浮游动物群落结构时发现，基于18S V9区引物检出的浮游动物主要门类为节肢动物门，比例最高达79.5%，与本研究结果相近。Casas等[28]应用18S V9区引物探讨了红海浮游动物群落结构，发现该海域浮游动物的优势类群也是节肢动物门，丰度比例高达66%。高旭等[29]在探究浮游动物DNA宏条形码引物的扩增差异时发现，18S V9区引物具有更高的物种覆盖度，不仅能扩增出浮游动物(15.5%)，还能扩增出大量藻类和真菌，但其物种识别敏感性较差；16S引物获得的OTUs有88.1%属于浮游动物，具有更好的特异性。Zhan等[18-19]比较了COI、16S和18S引物后发现，传统COI引物PCR扩增不佳或缺乏引物通用性，建议选择18S和16S引物进行研究。因此，选择不同引物时应区分其适用范围，统筹考虑研究目的和待测生物类群。
本研究中物种多样性指数分析结果表明，基于18S V9区引物获得的浮游动物的Ace、Chao1和Shannon指数均显著高于16S和18S V4区引物获得的浮游动物的多样性指数。说明基于18S V9区引物获得的浮游动物的群落丰富度和多样性最高。本研究中同时探讨了不同引物条件下普兰店湾浮游动物的物种丰度及多样性，发现基于18S V9区引物获得的OTUs数量(470)远大于18S V4(77)和16S(72)，其OTUs注释到科分类阶元的数量信息也最多。
3.3 普兰店湾浮游动物群落结构与环境因子的响应关系
本研究中，浮游动物群落结构与环境因子相关分析表明，水深、水温(SST)、盐度(SAL)和溶解氧是影响浮游动物群落结构最重要的环境因子，这与党亚茹等[30]、杨森等[31]、李浩然等[32]和王宁等[33]对渤海、北黄海近岸海域浮游动物群落结构研究结果一致。
水深是影响浮游动物样品群落结构的重要因素，可能原因是水深影响水温，大量研究已证实，水温可以影响浮游动物的生长繁殖、群落组成结构及空间分布，因而水深也会影响浮游动物群落结构[34-36]。普兰店湾是典型的温带半封闭狭长形浅水海湾，水体交换能力弱，湾内外的浮游生物群落存在差别。本研究结果显示，16S、18S V4和18S V9区引物所检出的浮游动物样品群落结构中，水深在不同环境因子中所起的作用最大，16S引物所检出的十足目巨指长臂虾、端足目强壮藻钩虾与水深呈显著正相关关系，18S V9引物所检出的十足目锯齿长臂虾亦与水深存在正相关关系。普兰店湾从内到外，不断增加的水深较好地解释了不同站位浮游动物群落结构的变化。
水温和盐度是影响浮游动物分布及其群落演替的重要因素，不同浮游生物对温度和盐度的适应范围不同从而造成其群落的差异[37]。党亚茹等[30]在研究海州湾邻近海域浮游动物群落时空变化与环境因子关系时，发现春季浮游动物桡足类通常与温度具有正相关关系。本研究中RDA 相关性分析显示，16S引物所检出的两种优势种巨指长臂虾和强壮藻钩虾与水温、盐度呈正相关关系；18S V4引物所检出的短尾类蚤状幼体、太平洋纺锤水蚤也与水温、盐度呈正相关关系，沃氏纺锤水蚤则与之呈负相关；值得注意的是，18S V9引物所检出的7种优势种中，只有锯齿长臂虾与水温、盐度呈正相关关系。这一研究结果表明，水温和盐度可能是影响浮游生物生长与繁殖的关键因素，不同的浮游生物对温盐的适应范围不同从而造成其群落的差异。
溶解氧是海洋生态系统中异氧生物唯一的氧气来源，是调节海洋生物身体代谢活动的重要因素，溶解氧浓度的高低会直接影响水体生物的丰度[38]。 任爽宁等[39] 在海州湾研究浮游桡足类的分布特征及其与环境因子的相关性时发现，溶解氧是影响春季浮游桡足类丰度的主要环境因子，溶解氧浓度较低时，浮游桡足类丰度值较高。本研究中发现，普兰店湾海域溶解氧呈现东北-西南逐渐降低的趋势，RDA 相关性分析显示，18S V4引物所检出的优势种桡足类北极哲水蚤、短尾类蚤状幼体与溶解氧呈正相关关系，与18S V9引物检出的优势种研究结果一致。
3.4 DNA宏条形码技术在浮游动物调查中的应用前景
宏条形码技术不但具有鉴定效率高、花费较低等优点[13]，而且能得到更多的浮游动物种类和丰富度信息，因此近年来被广泛应用于水域生态调查中[40]，但其在浮游动物调查中还存在部分局限性。主要概括为以下两个方面，一是标志基因的选择，二是本土数据库不全。目前在浮游动物研究领域，尽管存在多个可用作物种鉴定的标志基因，但尚无任何一种基因能够实现所有物种的同步高效扩增，且保证各物种间的扩增效率均衡[18-19]。因此，不同生物群落标志基因的选择是制约宏条形码技术应用于环境评估的关键因素之一。在宏条形码分析中，物种鉴定的准确性高度依赖于测序序列与数据库之间的比对。数据库的覆盖范围和数据质量是影响结果可靠性的关键因素，尽管GenBank和NCBI等公共数据库的物种信息近年来得到迅速扩充，但水生生物类群的收录仍显著落后于陆生生物，且缺乏辽宁本土的物种数据库。这在很大程度上导致大量宏条形码序列无法获得有效注释，从而限制了该类数据的解析和应用。因此，目前亟需建立辽宁甚至全国本地化条形码数据库，以提高宏条形码调查的准确性和可靠性。
4 结论
1)16S引物所有站位样品总共获得72个OTUs；18S V4区引物所有站位样品总共获得77个OTUs；18S V9区引物所有站位样品总共获得470个OTUs。其中16S检测出6门10纲20目37科，18S V4检测出9门20纲37目52科，18S V9检测出34门79纲158目222科；基于16S、18S V4和18S V9区引物检出的普兰店湾浮游动物群落结构均以节肢动物门为主，占总丰度比例均超过70%，但基于18S V9区引物检出的浮游动物的reads数和OTUs数目最高。
2)基于18S V9区引物获得的浮游动物的Ace、Chao1和Shannon指数均显著高于16S和18S V4区引物获得的浮游动物的多样性指数，且其门、纲、目和科的数目更高。
3)RDA分析表明，水深和溶解氧是影响16S、18S V4和18S V9区引物所获得的普兰店湾所有站位浮游动物优势类群结构的主要因素。16S引物所检出的优势种巨指长臂虾及强壮藻钩虾与水深呈显著正相关的关系，18S V9引物所检出的锯齿长臂虾亦与水深存在正相关关系；另外，18S V4引物所检出的优势种桡足类北极哲水蚤、短尾类蚤状幼体与溶解氧呈正相关关系，与18S V9引物检出的优势种研究结果相一致。
4)DNA宏条形码技术因其高效、低成本等优点被广泛应用于水生态调查，但其在浮游动物研究中会受本土参考数据库不完善的限制，影响了物种注释的准确性与应用可靠性，因此，建立本地化条形码数据库是目前亟需完成的任务。
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