马氏珠母贝Pm-SATB2基因及其可变剪切异构体的鉴定及功能探究

马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)是重要的经济贝类之一，主要用于珍珠的培育，也是中国最具经济价值的海水珍珠养殖品种之一，其珍珠产量占全国海水珍珠总产量的95%以上[1]。在人工养殖中，贝类天然形成珍珠的概率极低，因此海水珍珠养殖中最重要的一环是人工植核育珠，其过程是将供体贝的细胞小片和珠核植入到受体贝的内脏团中，细胞小片形成珍珠囊并分泌珍珠质到珠核[2]。但是珠核与细胞小片属于外来物，易引发受体贝产生排斥反应，易导致贝体吐核，甚至贝类死亡，造成珍珠品质不佳及产量降低。因此，珍珠贝植核后的免疫机制仍属于当前关注的焦点。

可变剪切(alternative splicing，AS)是真核生物基因表达调控的重要机制，其通过选择性剪接前体mRNA，产生多种不同的成熟mRNA异构体并翻译成各种不同的蛋白产物，进而增加基因表达的多样性与复杂性[3-4]。在生物体中，可变剪切主要包括5种类型：外显子跳跃(ES)、可变5’剪切位点 (A5SS)、可变3’剪切位点 (A3SS)、内含子滞留 (RI) 和外显子互斥 (MXE)[5]。可变剪切通过调节特定基因的剪切模式，影响细胞的表型和生理功能。在物种分化、免疫调节、炎症反应等生理过程中，可变剪切事件都发挥着重要的作用[6]。有研究报道，NF-κB、JNK、MAPK等经典免疫通路中的众多基因，其表达受到可变剪切机制的精细调控[7]；在扇贝“青农金贝”性腺发育中，可变剪切事件通过调控基因表达的多样性，影响性腺发育的进程[8]；长牡蛎(Crassostrea gigas)的免疫系统可通过可变剪切产生免疫响应的特异性和多样性[9]。尽管可变剪切在生物免疫系统中发挥重要作用，但由于物种的差别，在不同物种间可变剪切事件的发生也会导致生物体内不同免疫功能的表现。

特异AT富含序列结合蛋白(special AT-rich sequence binding protein，SATB)是能够与基质结合区(scaffold/matrix attachment regions，MARs或S/MARs)结合的蛋白质，可促进基因重组和染色质重建，通过调节组蛋白甲基化、乙酰化等多种途径来调控基因的表达，在肿瘤转移[10-11]、癌细胞转移[12]、凋亡调控、免疫调节等方面发挥重要作用。研究表明，SATB1在T淋巴细胞的三维空间中创建基因网络，其缺乏会导致免疫特异性基因表达失调，从而诱导广泛炎症和自身免疫[13]。此外，SATB1在Tfh细胞和Tfr细胞的分化过程中起着重要的调节作用，抑制SATB1蛋白表达可促进Tfh细胞的分化，阻止Tfr细胞的形成[14]。SATB1还对免疫耐受至关重要，SATB1的缺失破坏T细胞分化中染色质动态结构，可导致免疫基因表达失调引发自身免疫[15-16]。SATB2则在免疫细胞活化和免疫反应的启动中起关键作用，SATB2通过与DNA的基因附着区基质结合区富含AT碱基对结合来影响染色体的重塑[17]，这种重塑过程对免疫细胞活化和免疫反应启动至关重要；此外，SATB2也能通过与其他转录因子结合影响下游基因的表达。

SATB2作为核基质结合蛋白，通过调控基因网络参与脊椎动物多系统发育，在脊椎动物中备受关注[18]。近期研究发现，其阴性表达与结直肠癌免疫微环境紊乱相关[19]；此外，高表达SATB2能逆转miR-7641低表达对MCF-7细胞的影响，促进增殖、侵袭和细胞骨架重建，同时抑制凋亡[20]。但在软体动物中，SATB2基因的研究较少，因此，本研究中从马氏珠母贝基因组中调取Pm-SATB2基因的DNA序列，从全长转录组数据中获得了Pm-SATB2的可变剪切异构体基因，利用荧光定量PCR技术鉴定Pm-SATB2基因及其可变剪切异构体的序列及其在不同刺激后的表达变化，并采用原位杂交试验分析了其在马氏珠母贝中血细胞中定位，以期为马氏珠母贝免疫调控研究提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用的马氏珠母贝均为大小一致、活力正常且为1.5～2.0龄的“海选一号”优良品种，选取地为广东湛江市徐闻县大井村养殖海区。试验所需引物见表1。

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取检测参照TRIzol说明书提取血细胞的总RNA，全程低温操作，避免RNase污染。提取RNA专用钢珠无水乙醇清洗、灭菌后，与解冻血细胞共研磨裂解，加氯仿分层离心取上清，异丙醇沉淀RNA，75%乙醇洗涤，DEPC水溶解后使用NanoDrop® Series检测样品RNA的浓度；使用Agilent® 2100 Bioanalyzer检测每个RNA样品的完整性；将检测合格的RNA样品用试剂盒(Clontech SMARTer PCR cDNA Synthesis Kit)反转录为第一链cDNA；通过PCR扩增合成双链cDNA。

1.2.2 基因序列鉴定与验证结合转录本全长序列及基因结构分析结果，利用DNAMAN软件比对转录本之间的差异，设计引物后使用PCR技术验证，其采用的体系为10 μL。反应结束后，取4 μL PCR产物与6 μL DNA loading buffer混合均匀，加入10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测条带，后送生工广州测序部测序。

1.2.3 荧光定量参照反转录试剂盒(20 μL)使用TransScript® Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反转录RNA，PCR孵育结束后，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

参照PerfectStart® Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒说明书，以β-actin为内参基因，进行荧光定量。反应体系为10 μL，反应程序如下：95 ℃下预变性5 min；随后98 ℃下变性30 s，60 ℃下退火15 s，最后在72 ℃下再延伸15 s，共进行40个循环。

1.2.4 原位杂交分别以马氏珠母贝血细胞cDNA为模板，利用特异性引物PCR扩增lncPm-IRF1a_1和lncPm-IRF1b_1的全长序列，反应体系为10 μL。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目标片段。使用T7 High Efficiency Transcription试剂盒进行体外转录，结合DIG RNA Labeling Mix进行体外转录制备带有DIG标记的探针，反应体系为20 μL，37 ℃孵育2 h。使用EasyPure® RNA Purification Kit纯化转录产物，检测探针浓度并分装至-80 ℃下保存。

按照博士德(Boster Bio)MK1033敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅳ(CY3)内的说明书准备湿盒、原位杂交专用玻片、盖玻片及缓冲液。使用一次性2 mL注射器抽取马氏珠母贝血淋巴，抽取后立即滴加在原位杂交专用玻片上，等待约30 min，待细胞爬片后，倾斜玻片，用移液枪将上清吸走，滴加4%多聚甲醛(0.1% DEPC)，室温固定30 min～1 h。使用蒸馏水或者灭过菌的ddH2O充分洗涤，可使用移液枪对玻片从上往下轻轻冲洗。然后按照说明书进行后续试验步骤。封片后，使用倒置荧光显微镜观察荧光信号。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。荧光定量数据采用2-ΔΔCt计算定量结果，确定待测基因在不同组间的相对表达水平。采用SPSS软件进行统计分析。运用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较不同组间的差异，显著性差异设为0.05。

2 结果与分析

2.1 Pm-SATB2基因序列分析

从马氏珠母贝基因组中调取了Pm-SATB2基因的全序列，将其序列与其他物种进行序列比对分析并构建进化树(图1)。结果显示发现，脊椎动物来源的SATB基因聚为一支，无脊椎动物来源的STAB聚为另一支，Pm-SATB2与长牡蛎的SATB2的同源性最高；序列比对结果分析，Pm-SATB2的ULD及首个结构域(Homeodomain，HD)在长牡蛎、青翼海兔(Aplysia californica)和海天牛(Elysia chlorotica)中保守性较高。

2.2 Pm-SATB2可变剪切异构体分析与验证

基于课题组已有的全长转录组数据，调取Pm-SATB2基因的编码本。发现Pm-SATB2的第四个外显子末端发生外显子互斥使得基因结构发生改变(图2)，形成了可变剪切异构体，命名为Pm-SATB2_1。根据序列特征，设计特异性引物，利用马氏珠母贝血细胞cDNA为模板，通过PCR技术对Pm-SATB2基因可变剪切异构体进行验证，测序结果与全长转录组序列一致，说明Pm-SATB2_1基因真实存在于马氏珠母贝血细胞中。通过ORF Finder和SMART在线工具分析结果表明，Pm-SATB2与PmSATB2_1均有UD domain、CUTL domain和功能结构域Homeodomain，Pm-SATB2比Pm-SATB2_1多出两个HD结构域。

2.3 Pm-SATB2基因及其可变剪切异构体的免疫功能分析

利用实时荧光定量PCR(QPCR)检测Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在马氏珠母贝不同组织及不同刺激下的表达变化。从图3可见，Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在肝胰腺(hepatopancreas，HE)、鳃(gill，GI)和性腺(gonad，GO)中的表达量最高，在HE、GI、GO、血细胞(hemocyte，B)、外套膜套膜区(mantle pallial，MP)和足(foot，F)组织中的表达有显著性差异(P<0.05)。但在外套膜边缘膜(mantle edge，ME)、外套膜中央膜(mantle central，MC)和闭壳肌(adductor muscle，A)中皆无显著性差异(P>0.05)，试验结果表明，Pm-SATB2在马氏珠母贝中的不同组织中的功能具有差异。

为进一步探究Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在马氏珠母贝的免疫功能，利用QPCR检测它们在LPS刺激及植核后不同时间的表达变化。结果如图4所示，Pm-SATB2和Pm-SATB2_1在LPS刺激后6 h时均出现了显著性升高(P<0.05)，但Pm-SATB2在24 h时显著性下调(P<0.05)，Pm-SATB2_1在24 h时无显著性变化(P>0.05)；在植核刺激后，与0 h相比，Pm-SATB2与Pm-SATB2_1 的表达在6～24 h皆显著性降低(P<0.05)。原位杂交结果显示，Pm-SATB2_1主要定位于淋巴样细胞；而Pm-SATB2则主要存在于颗粒细胞(图5)。

3 讨论

可变剪接是真核生物中从酵母到哺乳动物乃至人类普遍存在的现象[21]，其在维持蛋白质基本功能的同时，降低了基因序列的选择压力，并显著增加了机体蛋白质组的多样性，为复杂生物功能的实现提供了分子基础。外显子互斥事件的可变剪切在基因表达调控和蛋白质多样性产生中具有重要作用。如果蝇Dscam基因通过外显子互斥剪接产生多种蛋白，调控神经发育[22]。

3.1 Pm-SATB2基因及其可变剪切异构体结构特征

本试验通过分析全长转录组数据中Pm-SATB2基因序列，发现Pm-SATB2通过外显子互斥产生了可变剪切异构体Pm-SATB2_1。通过序列比对分析发现，Pm-SATB2与无脊椎动物SATB2同源性较高，与脊椎动物相比，如人的SATB2序列差异较大，表明Pm-SATB2基因在生物演化过程中发生了序列改变。生物基因组进化发生在一系列不同水平上，基因碱基序列的突变，涉及碱基对变化及插入或缺失，当这些变化发生在编码位置或调控序列时，通常会形成生物基因的差异[23]。结构域预测确认了Pm-SATB2与Pm-SATB2_1的蛋白结构特征：两者均含有ULD domain、CUTL domain和HD结构域，值得注意的是，Pm-SATB2相较于Pm-SATB2_1额外包含两个Homeodomain结构域。ULD和CUTL是SATB1蛋白N端模块的两个关键结构域，二者以串联形式(ULD-CUTL)协同发挥作用[24]。ULD具有与泛素相似的三维结构，介导SATB形成四聚体，这种多聚化状态对其DNA结合功能至关重要；而CUTL是新鉴定的DNA结合域。二者与C端的同源结构域(HD)及中部的CUT1-CUT2串联结构域共同构成SATB的多域协同DNA识别机制[25]。Homeodomain在蛋白质-DNA和蛋白质-蛋白质相互作用中起重要作用，是某些具有DNA结合特异性转录调控因子的特征性结构，在细胞发育代谢过程中发挥重要作用，能够调控分化细胞的定位和分化途径[26-27]。细胞的分化及其他特殊功能的执行通常通过转录因子间复杂的相互作用实现，细胞通过转录因子独特的组合程序响应不同生理信号[28]。因此，Pm-SATB2与Pm-SATB2_1结构域的差异可能赋予了其在马氏珠母贝中不同的生物学功能。

3.2 Pm-SATB2及其可变剪切异构体的表达变化

本研究中检测Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在马氏珠母贝不同组织及LPS与植核刺激后的表达水平。结果发现，Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在He、Gi、Go中的表达高于其他组织；在同组织之间，Pm-SATB2在HE、GI、B组织中的表达显著高于Pm-SATB2_1，说明Pm-SATB2基因在机体不同组织中的功能存在差异。贝类的肝胰腺是细菌积聚的主要部位，可通过滤食和排泄清除有害细菌[29]；鳃具有营养吸收、消化和呼吸功能，也是免疫防御的第一道屏障；血细胞在先天性免疫中起关键作用[30]。在不同组织中，相同基因的表达也存在差异，研究发现，CaM基因在香港牡蛎各组织中均有表达，其中鳃组织表达量最高，心脏最低[31]。Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在同种组织的表达差异反映了转录调控机制的复杂性，AS事件的发生可能导致Pm-SATB2_1表达水平与Pm-SATB2产生差异。同时，AS事件可能导致基因结构域的缺失，进而赋予其独特的生物学功能[32]。凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)E75基因的6种可变剪切异构体中，LvE75-3缺乏DBD结构域，这导致其在功能上与其他异构体存在差异[33]。在LPS刺激后，Pm-SATB2的表达在6 h出现显著性上升(P<0.05)，24 h出现显著性下降(P<0.05)，而Pm-SATB2_1在6 h出现显著性上升(P<0.05)，24 h无显著性变化(P>0.05)，这表明Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在LPS诱导的免疫反应中可能执行不同功能。类似地，人PDCD1的AS亚型PD-1IR2的可变剪切异构体通过产生免疫响应的特异性和多样性进而影响免疫调节[34]。而植核手术后6～24 h，Pm-SATB2与Pm-SATB2_1的表达显著下调，说明它们在LPS和植核刺激诱导免疫响应中具有不同的作用。在双壳类动物中，血淋巴是先天性免疫的主要组成部分，其中的血细胞直接参与吞噬病原体、免疫响应和宿主防御过程，构成先天免疫的核心防线[35]。

3.3 Pm-SATB2及其可变剪切异构体在免疫细胞中的定位

原位杂交试验发现，Pm-SATB2_1主要定位于淋巴样细胞，而Pm-SATB2主要存在于颗粒细胞，说明Pm-SATB2与Pm-SATB2_1可能均参与贝类先天性免疫。细胞定位上的差异反映了两者在免疫功能方面的差异。淋巴样细胞在无脊椎动物中具有重要功能，在调节炎症反应、识别和清除病原体中发挥重要作用[36]。颗粒细胞是贝类免疫细胞中具有吞噬能力的细胞，可吞噬病原体等外来物质[30]。试验结果表明，Pm-SATB2和Pm-SATB2_1在马氏珠母贝的不同细胞类型中特异性表达，可能通过不同的机制调控免疫应答过程。

4 结论

1)马氏珠母贝中存在Pm-SATB2及其可变剪切异构体Pm-SATB2_1，说明SATB2家族在软体动物中通过异构体的形成实现功能分化。

2)Pm-SATB2与Pm-SATB2_1在LPS和植核刺激后均有表达变化，说明二者在马氏珠母贝免疫应答中发挥调节作用。

3)Pm-SATB2_1定位于淋巴样细胞，Pm-SATB2定位于颗粒细胞，说明二者可能通过在不同的免疫细胞中分工协作，共同参与马氏珠母贝的防御机制。

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