脂质组学分析雌二醇处理对三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中脂质代谢的影响

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)梭子蟹科(Portunidae)的代表性经济物种[1]，在中国东海海域的渔业资源与水产养殖业中占据重要地位[2]。近年来，受过度捕捞、海洋环境改变等因素的影响，三疣梭子蟹的野生种群数量呈现不断减少的趋势，为满足市场需求，该物种的人工养殖得以快速发展[3]。目前，三疣梭子蟹的全人工繁殖仍面临性腺发育同步性差、卵子质量不稳定等问题[4]，其中，脂质代谢调控作为性腺发育的关键环节，其机制尚未完全明晰。

雌激素作为关键的类固醇激素，参与各类生物的生殖、生长发育及代谢调控等多个生理过程，研究显示其在动物体内的主要活性形式是雌二醇(E2)[3-5]。近年来，E2在三疣梭子蟹的卵巢发育调控中已被证实具有核心作用，且其调控机制研究已取得一定进展。柳梅梅等[6-8]研究发现，E2处理可显著促进三疣梭子蟹的卵巢发育且对其卵黄蛋白原(Vg)合成的调控作用在不同卵黄发生阶段具有阶段特异性。进一步研究发现，三疣梭子蟹基因组中无雌激素受体(ER)仅发现一个雌激素相关受体基因(ERR)，且ERR干扰后，三疣梭子蟹性腺指数及Vg基因的表达水平均显著下降，推测E2可通过ERR调控三疣梭子蟹的卵巢发育[9]。尽管如此，由于ERR是孤儿核受体，不能与E2结合，其调控三疣梭子蟹Vg表达的具体作用机制仍需要进一步解析。而在三疣梭子蟹卵巢发育过程中，除卵黄蛋白外，脂质亦作为一类重要的营养物质得以积累。脂质是一类具有重要功能的生物大分子，不仅构成细胞膜的主要成分，还在能量储存与信号传导中发挥关键作用[10-12]。研究显示，E2可通过调控脊椎动物脂代谢相关基因的表达影响其脂肪合成、分解及脂蛋白运输等过程[13-15]。而在甲壳动物中，现有关于E2调控其脂质代谢的研究报道显示，一定剂量的E2可诱导罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺中总脂的合成，以及提高澳比杜斯螯虾(Cherax albidus)和日本沼虾(Macrobrachium nipponense)肝胰腺中总饱和脂肪酸和总多不饱和脂肪酸的含量[16-18]。刘晓[19]则证实拟穴青蟹(Scylla paramamosain)中参与E2代谢的17β-雌二醇脱氢酶(17E2DH)基因的表达与卵巢磷脂酰胆碱(PC)和甘油三酯(TAG)积累呈正相关。在三疣梭子蟹的研究中显示，外源注射雌二醇可显著改变肝胰腺中脂肪酸代谢相关基因的表达水平和脂肪酸含量[20]。以上研究主要聚焦于E2对单一脂质及相关基因表达的变化，但激素处理后卵巢和肝胰腺中脂质组成的系统性变化及两组织间脂质之间的协同变化尚不清楚。

脂质组学是系统生物学研究的核心领域之一，其致力于从系统层面解析生物体内脂质分子的组成、结构及功能[21]。随着液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等技术的发展，脂质组学技术已能实现生物样本中脂质分子的高通量精准分析，这为揭示脂质转运规律提供了有效工具[22]。甲壳动物中，该技术也已用于解析饲料n-3PUFA对三疣梭子蟹肝胰腺脂质组的影响及幼体发育中磷脂的动态变化，以及探究三疣梭子蟹肝胰腺脂质对饲料的响应及幼体磷脂变化[23-24]。然而，脂质组学技术尚未用于解析性激素(如E2)对三疣梭子蟹肝胰腺与卵巢脂质代谢的调控作用。鉴于三疣梭子蟹人工繁殖中脂质营养调控的迫切需求，以及E2在性腺发育中的关键作用，本研究中通过脂质组学分析了活体条件下注射E2对三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中脂质分子组成及其含量变化的影响，以期为解析外源E2对甲壳动物脂质分子的调控作用提供有价值的数据，同时为优化三疣梭子蟹人工育苗的营养强化策略提供有益参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用三疣梭子蟹源自浙江省水产研究所科研基地外塘，选取刚完成生殖蜕壳的健康雌蟹60只，平均体质量为(196.80±0.28)g，暂养一周后分为2组，每组设置30个重复。试验共设计2组，分别为对照组(0 μg/g体质量E2组)和雌二醇组(1 μg/g体质量E2组)，对照组每次注射同等剂量的溶剂，而雌二醇组注射剂量为1 μg/g 体质量E2，注射部位为三疣梭子蟹游泳足基部。试验期间，每周注射1次，共注射5次，注射完立即泼洒维生素C，防止应激。采用室内水泥池(7.4 m×4.5 m×1.45 m)进行养殖试验，养殖框内一侧放置约3 cm高的弧形PVC管，另外一侧为投饵区。养殖30 d后，每组取9只三疣梭子蟹的卵巢(对照组：C-O，雌二醇组：E2-O)和肝胰腺(对照组：C-H，雌二醇组：E2-H)样品于-80 ℃保存用于后续分析。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理分别取卵巢和肝胰腺组织各100 mg左右，向每份组织样品中分别加入1 mL预冷的甲醇∶乙腈∶水混合溶液(V∶V∶V=2∶2∶1)，用MP匀浆仪对其破碎，随后，对卵巢和肝胰腺进行低温超声处理2次，每次30 min。处理完毕后，将其于-20 ℃环境中静置60 min，接着以13 000 g的转速冷冻离心15 min，然后，收集上清液分装至冻存管内(900 μL/管)，通过真空干燥的方式去除溶剂，将所得的冻干粉保存于-80 ℃中待用；在进行质谱分析前，向冻干粉中加入100 μL乙腈水溶液使其溶解，经涡旋振荡后，以14 000 g的离心力在4 ℃条件下再次离心15 min，取上清液用于进样分析。

1.2.2 色谱-质谱分析色谱柱在三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺的分析过程中温度为25 ℃，梯度洗脱：0～0.5 min，95% B；0.5～7 min，B线性降至65%；7～8 min，B线性降至40%；8～9 min，40% B；9～9.1 min，B线性升至95%；9.1～12 min，95% B。样本分析按照随机进样顺序进行，以消除仪器检测信号波动的干扰。

采集谱图的ESI源条件如下：Gas1：60，Gas2：60，CUR：30，源温度：600 ℃，ISVF为±5 500 V；TOF MS质荷比：60 000～1 000 000，产物离子质荷比：25 000～1 000 000，TOF MS为0.20 s/光谱，产物为0.05 s/光谱；IDA获得二级质谱，DP：±60 V。

1.3 数据处理

为提高代谢物的覆盖范围并优化检测结果，本研究中同时采用正离子模式(POS)和负离子模式(NEG)两种电离方式。在数据处理阶段，对两种电离模式下得到的数据分别进行独立分析，借助R语言的gmodels软件包(V2.18.1)开展主成分分析(PCA)，将原始数据压缩为n个主成分，用以体现原始数据集的特征。而正交最小偏二乘判别分析(OPLS-DA)则通过R语言的ropls程序包实现，该方法整合了正交信号矫正(OSC)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)两种技术，可将X矩阵信息拆分为与Y相关及不相关的两个部分。在剔除不相关的差异信息后，剩余的相关信息会集中体现在第一个预测成分中。为验证OPLS-DA模型的可靠程度，研究中对模型实施了交叉验证与置换检验。

为筛选出不同试验组间的显著差异代谢物，显著差异的判定阈值设定为OPLS-DA模型中的VIP≥1，同时T检验的P<0.05。此外，对于代谢通路(pathway)的显著性评估，将Q≤0.05的代谢通路定义为在差异表达代谢物的显著富集通路。利用R包MSEAp进行过表达分析(over representation analysis，ORA)。

2 结果与分析

2.1 卵巢和肝胰腺中脂质组成成分分析

本研究中对三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺进行脂质定性定量分析，其中正离子模式下(表1)，共检测到2 255种脂质分子，属于33种脂质亚类。主要包含47.007%的TAG、13.925%的DAG、10.643%的PC、8.027%的PE、4.612%的PG、2.838%的Cer、1.907%的PS、1.685%的AcCa、1.330%的LPC、1.286%的PI等。其中TAG是占比最高的脂质，其次是DAG，可见正离子模式下甘油酯是三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢中脂质的主要组分。

负离子模式下(表2)，共检测到1 159种脂质分子，属于27种脂质亚类。主要包含26.920%的PC、12.166%的PE、11.217%的CL、10.181%的Cer、8.024%的磷PS、5.781%的Hex1Cer、4.228%的PI、3.365%的LPC、2.847%的SM、分别各占2.502%的LPE和PIP、2.157%的Hex2Cer、1.553%的Hex3Cer、1.208%的PG和1.035%的PA等。其中PC、PE和CL三者之和占三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢总脂质组分的50.303%，可见负离子模式下甘油磷脂类是三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢脂质的主要组分。

脂类分为GP、SP、FA、GL、ST、PL、SL和PK 8个大类，在本试验中正离子模式下筛选了三疣梭子蟹的肝胰腺和卵巢中脂质的主要组分是GP，负离子模式下三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢脂质的主要组分是GL。然而固醇类只在正离子模式下可以筛选出8种，分别为ST(d47：2)、ST(d30：2+O)、ST(d40：6)、ST(d47：3)、ST(d49：2)、ST(d49：3)、ST(m44：6)+H-H2O和ST(d40：5)(表3)，脂肪酸酰类只在负离子模式下可以筛选出3种，分别为FA(20：5)-H、OAHFA(44：11)-H和FA(22：6)-H(表4)。

2.2 卵巢和肝胰腺中脂质组成差异代谢物分析

为了进一步了解三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中脂质分子差异的具体情况，对不同组之间进行了比较，正离子模式下，如图1所示，C-H和E2-H组之间筛出差异脂质数量2(上调0，下调2)。从表5可见，下调的两个脂质为TAG(20：3_20：5_22：6)和TAG(15：0_15：0_16：0)。E2-O和C-O组之间筛出差异脂质数量19(上调19，下调0)，从表6可见上调的两个脂质属于TAG(15：0_16：0_22：6)和TAG(19：1_18：1_22：6)，17个脂质属于DAG，分别是DAG(39：4)、DAG(31：2e)、DAG(17：1_18：1)、DAG(19：0_20：5)、DAG(36：1e)、DAG(18：0_22：5)、DAG(41：7)、DAG(33：2e)、DAG(38：4e)、DAG(17：0_22：6)、DAG(16：0_20：4)、DAG(20：1_20：1)、DAG(19：0_22：6)、DAG(20：1_22：2)、DAG(42：8e)、DG(18：0_16：0)和DAG(16：0_20：1)。

负离子模式下，如图1所示，C-H和E2-H组之间筛出差异脂质数量0(上调0，下调0)，E2-O和C-O组之间筛出差异脂质数量2(上调2，下调0)，从表7可见，上调的两个脂质为PC(16：0_20：5)和PC(19：1_22：5)。由于雌二醇处理前后的卵巢和肝胰腺中的差异脂质分子数量较少，对差异脂质通过KEGG进行脂质通路富集分析，结果显示，未显著富集到差异代谢相关通路。

3 讨论

3.1 三疣梭子蟹卵巢与肝胰腺的脂质组成特征分析

甘油三酯和磷脂是生殖腺中主要的脂质成分，为胚胎发育和幼体生长提供必需能量，同时也是水生生物体内重要的能量储备物质[25-26]。本研究中脂质组学分析显示，三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺的脂质分布具有显著的组织特异性。正离子模式下GL占主导地位，其中TAG占比达47.007%，这一结果与封强梅[27]在中华绒螯蟹中观察到的TAG作为主要能量储备的特征一致，表明了其在生殖能量供应中的核心作用。负离子模式下共鉴定出1 159种脂质分子，870种被归类为GP，其中PC丰度最高，这与拟穴青蟹、南美白对虾(Penaeus vannamei)卵巢发育中PC为主要积累的脂质结果一致，证实PC可能通过维持细胞膜完整性和参与脂质转运等机制，在卵母细胞成熟和胚胎发育中发挥重要作用[28-29]。

3.2 E2对三疣梭子蟹卵巢和肝胰腺中脂质代谢的差异化调控

E2处理显著重塑了三疣梭子蟹肝胰腺和卵巢的脂质代谢特征，在肝胰腺中，TAG(20：3_20：5_22：6)和TAG(15：0_15：0_16：0)的含量显著降低，这可能与E2上调激素敏感性脂肪酶(HSL)基因表达、促进TAG水解有关[30]。这种调控促使肝胰腺储存的脂质分解为游离脂肪酸，经血淋巴定向转运至卵巢以满足生殖需求[18]。在卵巢中，E2处理显著增加了2种TAG和17种DAG的含量，值得注意的是，这些脂质分子富含22：6(DHA)和20：5(EPA)等长链多不饱和脂肪酸，为卵黄蛋白合成提供了结构基础[31]。其中DAG作为TAG生物合成的前体物质，其积累进一步促进了TAG合成，从而支持卵黄沉积和卵母细胞成熟[32-33]。而PC(16：0_20：5)和PC(19：1_22：5)显著增加可能通过增强卵黄膜稳定性、提高脂质转运效率支持卵母细胞成熟[34]。这种调控模式与甲壳动物血淋巴中高密度脂蛋白(HDL)介导的PC转运机制相一致[28]。

尽管差异脂质分子未显著富集到特定代谢通路，但TAG、DAG和PC均参与甘油磷脂代谢与胆碱代谢网络，这与拟穴青蟹胚胎发育、中华绒螯蟹卵巢研究中甘油磷脂代谢为核心通路的结论相符[27，35]。此外，胆碱是PC的碱性化合物，这些化合物起着激素或细胞信使的作用，足够的PC可促进脂质运输[36]，表明该代谢网络在甲壳动物生殖脂代谢中的重要性，也为后续解析E2调控脂质代谢的分子机制提供了方向。

4 结论

1)E2处理显著降低了三疣梭子蟹肝胰腺中甘油三酯(TAG)的含量，表明E2可能促进了肝胰腺中储存脂质的动员。

2)在卵巢中，E2处理显著促进了TAG、DAG和PC的积累，显示出E2对卵巢脂质合成的正向调控作用。卵巢中积累的TAG和PC富含DHA和EPA等多不饱和脂肪酸，进一步证实了这些脂质分子在卵黄形成和胚胎发育过程中的重要作用。

3)本研究中阐明了E2对甲壳动物性腺发育的脂代谢机制，也为优化三疣梭子蟹人工繁殖中的营养强化方案提供了科学依据。

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