长牡蛎(Crassostrea gigas)是中国重要的海水养殖贝类，2018年约占全国牡蛎总产量的四分之一[1]。近年来，夏季大规模死亡事件在长牡蛎养殖过程中时有发生，对养殖产业造成巨大损失[2]。如在2019年，山东乳山地区的养殖长牡蛎在夏季死亡率高达50%～90%[3]。长牡蛎的夏季病害及大规模死亡通常被认为是高温、浮游微藻及病原微生物大量繁殖等多种因素共同导致的结果[4]。夏季局部海域可能发生部分种类浮游微藻的暴发性增殖，导致其在水体中高度聚集并引发赤潮，对养殖贝类健康造成严重影响[2，5]。
赤潮通过竞争性消耗水体溶解氧、释放生物毒素及引发生态链式反应的三重机制，对水生生物形成“窒息性生理胁迫-毒性代谢损伤-生态位挤压”的多维危害[6]。赤潮在暴发、藻类更替和消退过程中，对长牡蛎及其养殖产业造成系统性危害[7]：首先，赤潮藻类在适宜环境下大量增殖，竞争性消耗水体溶解氧，挤压长牡蛎饵料藻类生存空间，使长牡蛎陷入相对低氧和低能量摄入状态；其次，随着赤潮暴发和演替，部分赤潮藻类会释放贝毒素，抑制长牡蛎免疫系统并破坏其生理机能，导致代谢紊乱与器官衰竭[8]。黄海是中国重要的贝类养殖海域，同时也是赤潮多发海域之一，黄海海域的赤潮灾害多发于7月—8月，主要由硅藻[如中肋骨条藻(Skeletonema costatum)]和甲藻[如链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)，东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)]等种类引发，且近年黄海赤潮持续时间和强度逐渐增加，年赤潮指数(AIP)增幅显著[9-11]。赤潮通过直接毒性作用和间接驱动环境恶化，对海域环境和长牡蛎养殖产业造成危害，如2019年福州海域赤潮事件中，米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)毒素富集导致牡蛎鳃组织溃烂并引发大规模死亡；夜光藻赤潮会消耗水体溶解氧，大量衰亡时释放氨态氮等有毒物质，造成贝类窒息和生理胁迫[12]。赤潮藻毒素(如DSP)主要由部分产毒甲藻(如Dinophysis、Prorocentrum等)产生，会干扰细胞信号传导和代谢过程[13]，通过食物链进入贝类体内后不断积累，引发贝类腹泻和缺氧等症状，影响生理功能和免疫系统，造成贝类损伤甚至死亡。类似机制在渤海赤潮高发期(如2004年夏季大连附近海域)同样可能加剧贝类夏季死亡率[14-15]。赤潮演变的过程中伴随着藻类的消亡和分解，大量衰亡的赤潮藻残体分解导致溶解氧浓度骤降(从正常值>5 mg/L降至<2 mg/L)，同时氨态氮浓度急剧升高，形成缺氧与氨态氮协同毒性环境[16]。2004年大连链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)赤潮期间，该双重胁迫造成贝类存活率下降60%以上[17]。因此，解析赤潮发生过程特征将有助于分析长牡蛎在夏季赤潮期的机体响应和应对策略，可进一步保障牡蛎养殖产业可持续发展，减少赤潮带来的损失。
目前，相关研究主要聚焦于牡蛎等贝类对赤潮藻毒素胁迫的响应，以及繁殖、发育和摄食行为的改变[12-18]，但是关于长牡蛎在赤潮胁迫过程中的能量代谢、氧化应激和免疫响应等生理状态指标的研究尚不多见。为深入了解赤潮对长牡蛎养殖的影响情况，本研究中于2022年夏季赤潮发生期间，对大连市庄河市王家岛海域及其养殖长牡蛎进行了调研和取样，包括赤潮海域水体浮游微藻的种群组成及数量、水质理化因子、病原微生物数量、长牡蛎能量和免疫指标变化等，研究并分析了赤潮发生期间北黄海的养殖环境特点、长牡蛎的健康状况及生理响应水平，以期为长牡蛎夏季大规模死亡防控提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究中分别于2022年7月12日和7月26日在辽宁省大连市庄河市王家岛镇长牡蛎浮筏养殖区(39°27′31″N，123°3′55″E)进行2次采样，该海区为大连市重要的贝类养殖区，于近年监测到多次贝类夏季大规模死亡事件[19-20]。采样的主要内容包括养殖产业调查和样品采集，取样种类主要包括海水样品、活体长牡蛎及长牡蛎组织等。
1.2 方法
1.2.1 样品采集 用水样瓶采集3 L未处理的表层海水，在常温条件下保存，在4 h内携带回实验室进行浮游微藻计数分析。另采集3 L表层海水，添加0.1%碳酸镁悬浊液，采用0.7 μm 孔径的GF/F滤膜过滤后，将滤膜包裹在锡纸内置干冰环境中保存，并在4 h内回实验室用于叶绿素分析。将采集到的3 L表层海水通过0.22 μm孔径的聚碳酸酯滤膜过滤后，储存在0 ℃～4 ℃条件下，并在4 h内送回实验室用于细菌丰度的分析。在每次调查时，随机采样18只二龄活体长牡蛎(壳长为6.23 cm±1.41 cm，体质量为39.18 g±12.39 g)，其中9只在0 ℃～4 ℃条件下储存，在4 h内送回实验室，用于微生物分析；剩余9只长牡蛎清洗干净外壳后，将鳃、血淋巴和闭壳肌等组织样品直接冷冻或用TRIzol试剂保存，并在4 h内置于干冰桶中，携带回实验室进行长牡蛎指标分析。以两次采样时间(即7月12日和7月26日)分组，将采集的水体、滤膜和长牡蛎组织等样品，分别标识为1T与2T样品组。
1.2.2 水质指标分析 使用美国维赛YSI多参数水质分析仪(YSI professional plus)对表层海水的温度(T，±0.1 ℃)、溶解氧浓度(DO，±0.01 mg/L)、pH(±0.01)及盐度(Sal，±0.01)进行现场监测。根据《海洋监测规范》GB 17378.4—2007[21]，采用次溴酸盐氧化法、萘乙二胺分光光度法、锌-镉还原法和磷钼蓝分光光度法分别测定表层海水样品中的氨态氮
亚硝态氮
硝态氮
及无机磷
的浓度。
1.2.3 浮游微藻分析与鉴定 把GF/F膜放入装有10 mL 90%丙酮溶液的离心管中，于4 ℃温度条件下静置24 h后，采用分光光度法测定叶绿素a(Chl-a)的浓度[22]。将1 L未过滤的表层海水样品加入10 mL Lugol’s溶液，进行固定和浓缩，然后用于浮游微藻的鉴定和计数[23]。
1.2.4 细菌丰度分析 利用EZNATM Water DNA Kit和EZNATM Soil DNA Kit(OMEGA Bio-Tek，美国)分别提取表层海水样品和长牡蛎鳃组织样品的DNA，作为模板进行qPCR试验。提取好的DNA，经NanoDrop 2000(丹麦)测定质量合格后再进行qPCR分析。参照细菌总数和弧菌的绝对定量PCR设计标准曲线，构建待测基因标准质粒，经过测序验证后，测出标准质粒的浓度，计算出拷贝数并构建标准曲线。用于细菌丰度分析的引物见表1，该引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表1 引物信息
Tab.1 Primer information
引物名称 primer name正向引物 forward primer (5'-3')反向引物 reverse primer (3'-5')细菌总丰度CCTACGGGAGGCAGCAGATTACCGCGGCTGCTGG弧菌丰度GGCGTAAAGCGCATGCAGGTGAAATTCTACCCCCCTCTACAGCgIL17-1GCGAACGCCACAGTGTCAAAGACGCTACGAGGAAATACGGACCgIL17-2TGTTCTCGCTGCCAACCAATTTGCGGACTAAGAGCATCAGGCgIL17-3TCACTACCAACTGAACTACGACCGTGCGACAGAGCCTGAGAACCCgIL17-4ACTTGTCCCTGGGTTATGTGTAGTCCAAGAGGAACACGGAGACCgIL17-5TCTGGCTGACTCTCGTCCTTGGACCCTGTCGTTGTCCTCTACCCgIL17-6CCATTTGTCCGACCTACCGTCCACCCTGCGTAGAACCATCCgTNF-1CTTCTCGTCTGCGGCTTCTTTCAGGGCTGCGGTCTTTCCCgTNF-2CCACTACGCCCACTAAGAAACTGAAGCGACCATTGCGAAACTCCATCgTGF-βAGTCACACGGGGCACATTTGCTGGGACTGACCATCACgIFNLPAGACTGGGAGGATGTCCTGGAGGTCAAAAACTTCTGGCTGTCAC
1.2.5 组织糖原和葡萄糖含量分析 取长牡蛎的闭壳肌组织0.1 g，在磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline，PBS)中完全浸泡，于冰水浴条件下使用匀浆机制备成质量体积比为10%的组织匀浆，于4 ℃下以2 500 r/min离心10 min后，取出上清液测定糖原和葡萄糖含量。采用索莱宝生化检测试剂盒(BC0345)测定糖原含量，采用南京建成生化检测试剂盒(F006-1-1)测定葡萄糖含量。
1.2.6 氧化应激相关指标分析 取长牡蛎的鳃组织0.1 g置于PBS中，在冰水浴条件下，采用匀浆机制备成质量体积比为10%的组织匀浆，然后在4 ℃下以2 500 r/min离心10 min，取上清液进行测定。采用南京建成生化检测试剂盒(编号为A001-3-2、A007-1-1、A003-1-2、A015-1-2)分别测量总超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、丙二醛(MDA)含量和总体抗氧化能力(T-AOC)。
1.2.7 免疫相关细胞因子mRNA绝对表达量 长牡蛎血淋巴细胞总RNA采用TRIzolTM Reagent(Invitrogen，美国)提取后，采用电泳检测分析RNA的完整性，采用NanoDrop 2000进一步测量样品A260/A280比值，以检验RNA纯度。采用TransScript®反转录试剂盒(AT311-03，北京全式金生物技术股份有限公司)，将RNA反转录成cDNA并用cDNA作模板进行RT-qPCR分析(表1)。参照已有报道确定细胞因子的绝对定量标准曲线[24]，将CT值代入上述标准曲线，获得CgIL17-1、CgIL17-2、CgIL17-3、CgIL17-4、CgIL17-5、CgIL17-6、CgTNF-1、CgTNF-2、CgTGF-β和CgIFNLP的mRNA绝对表达量[25-26]。
1.3 数据处理
试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，对所有的采样试验均设置3个样本重复。并且将本试验数据与已发表的研究数据进行对比[27]，并通过IBM® SPSS statistics版本25.0软件进行方差分析(ANOVA)和基于LSD法的多重比较或独立样本t检验。显著性差异设为0.05，极显著性差异设为0.01。
2 结果与分析
2.1 浮游微藻组成与丰度变化
表层海水Chl-a浓度在两次调查时呈显著性差异，分别为3.55、2.07 μg/L(表2)。通过对表层海水浮游微藻种类鉴定和计数(图1)，发现1T组浮游微藻的种类主要包括夜光藻、膨胀色球藻和小球藻等，其中夜光藻为显著优势种类，丰度为3 000～5 000个/L。2T组夜光藻丰度下降至500～1 000个/L，多数会出现萎缩、破碎和死亡(图2)，其他浮游微藻主要包括渐尖鳍藻、海洋原甲藻、辐射圆筛藻、小球藻和膨胀色球藻等，其中海洋原甲藻、渐尖鳍藻和辐射圆筛藻为优势藻。
图1 采集样本中主要浮游微藻种类及显微镜像
Fig.1 Main floating microalgae species and microscopic images in the samples
图2 2T组样本中夜光藻形态变化
Fig.2 Morphological changes of Noctiluca scintillans in the 2T samples
表2 表层海水Chl-a浓度和浮游微藻丰度变化
Tab.2 Variation of Chl-a concentration and planktonic microalgae abundance in surface seawater
Chl-a浓度和浮游微藻丰度Chl-a concentration and planktonic microalgae abundance1T2TChl-a (μg/L)3.552.07夜光藻( Noctiluca scintillans)++++小球藻( Chlorella vulgaris)++++膨胀色球藻( Chroococcus turgidus)+++海洋原甲藻 (Prorocentrum micans)—+++渐尖鳍藻( Dinophysis acuminata)—++辐射圆筛藻( Coscinodiscus radiatus)—++
注：—，+，++，+++表示浮游微藻丰度。—表示未检出；+表示500～1 000个/L；++表示1 000～3 000个/L；+++表示3 000～5 000个/L。
Note：—，+，++，+++ means indicate planktonic microalgae abundance.— means not detected；+ means 500-1 000 PCS/L；++ means 1 000-3 000 PCS/L；+++ means 3 000-5 000 PCS/L.
2.2 水质理化因子变化
两次采样的水质理化因子变化数据显示(表3)，海区表层水温从1T组的22.9 ℃升至2T的24.0 ℃(P<0.05)，盐度由22.46增加至26.39。溶解氧浓度(DO，6.57～6.83 mg/L)和pH值(7.52～7.81)保持相对稳定。营养盐分析显示：氨态氮
浓度显著升高，由0.245 mg/L升高至0.396 mg/L(P<0.01)，亚硝态氮浓度
mg/L)、硝态氮浓度
mg/L)和无机磷浓度
mg/L)维持在较低水平。氮磷比(N/P)由1T组的7.514升至2T组的14.868。
表3 表层海水水质理化因子变化
Tab.3 Water quality variation in surface seawater
水质理化因子 water quality1T2TT (℃)22.9±0.324.0±0.5DO (mg/L)6.836.57pH7.817.52Sal22.4626.39NH+4-N (mg/L)0.245±0.0830.396±0.169NO-2-N (mg/L)0.031±0.010.021±0.003NO-3-N (mg/L)0.323±0.1140.439±0.164PO3-4-P (mg/L)0.036±0.0040.026±0.006N/P7.51414.868
2.3 水体与长牡蛎鳃中细菌丰度变化
水体及长牡蛎鳃组织细菌群落结构和弧菌丰度呈现显著差异(图3)。表层水体细菌总丰度从1T组的2.98×1011 copies/L降至2T组的1.32×109 copies/L(P<0.01)。表层水体中弧菌属丰度呈现下降趋势，从4.84×108 copies/L显著下降至1.06×108 copies/L(P<0.05)。长牡蛎鳃组织菌群结构发生显著改变，细菌总丰度由5.19×109 copies/L降至1.96×108 copies/L(P<0.01)。值得注意的是，在水体环境中总菌和弧菌丰度均显著下降的情况下，长牡蛎鳃组织弧菌丰度由6.19×105 copies/L激增至5.33×108 copies/L(P<0.01)。
注：*表示有显著性差异(P<0.05)；**表示有极显著性差异(P<0.01)，下同。
Note：*means significant difference(P<0.05)；**means very significant difference(P<0.01)，et sequentia.
图3 表层海水和长牡蛎鳃中细菌总丰度和弧菌丰度的变化
Fig.3 Abundance variation of total bacteria and Vibrio in the surface seawater and the gill of Crassostrea gigas
2.4 组织糖原和葡萄糖含量变化
试验检测了长牡蛎能量储存和代谢的关键指标，包括闭壳肌组织的糖原含量和葡萄糖含量(图4)。结果发现，闭壳肌糖原含量从1T组的5.53 mg/g骤降至2T组的0.76 mg/g(P<0.01)。葡萄糖含量从0.42 mg/g上升至1.11 mg/g(P<0.01)。
图4 长牡蛎闭壳肌糖原和葡萄糖含量变化
Fig.4 Content variation of glycogen and glucose in adductor muscle
2.5 氧化应激相关指标变化
试验检测了长牡蛎氧化应激过程相关指标，包括鳃组织SOD和CAT活性、T-AOC水平及MDA含量(图5)。结果发现，两次调查时长牡蛎鳃组织SOD活性分别为105.62、208.38 U/g prot，CAT活性分别为0.86、1.62 U/g prot，T-AOC分别为0.22、0.55，MDA含量分别为2.45、7.94 nmol/mg prot。2T组鳃组织SOD和CAT活性、T-AOC水平及MDA含量均极显著高于1T组(P<0.01)。
图5 长牡蛎氧化应激相关指标的变化
Fig.5 Variation of the parameters related to oxidative stress in Crassostrea gigas
2.6 细胞因子mRNA绝对表达量变化
试验检测了血淋巴细胞的细胞因子mRNA绝对表达量(表4)，结果发现，CgIL17-4表达量由2.280 lg(copies/mL)显著上升至4.379 lg(copies/mL)(P<0.001)。CgIL17-5、CgIFNLP和CgTNF-2表达量分别下降了17.2%(P<0.01)、72.5%(P<0.01)、18.8%(P<0.05)，CgIL17-5表达量由3.491 lg(copies/mL)显著下降至2.893 lg(copies/mL)(P<0.01)，CgIFNLP表达量由1.777 lg(copies/mL)显著下降至0.486 lg(copies/mL)(P<0.01)，CgTNF-2表达量由5.408 lg(copies/mL)显著下降至4.393 lg(copies/mL)(P<0.01)。CgIL17-1/2/3/6、CgTGF-β和CgTNF-1表达量无显著性变化(P>0.05)。
表4 长牡蛎血淋巴细胞中10个细胞因子mRNA绝对表达量变化
Tab.4 mRNA expression abundance of ten cytokines in the haemocytes of Crassostrea gigas
细胞因子cytokines1Tlg(copies/mL)2Tlg(copies/mL)PCgIL17-13.570±0.8763.439±0.5350.758CgIL17-22.784±0.4632.439±0.3550.196CgIL17-33.188±0.4632.731±0.2890.068CgIL17-42.280±0.3104.379±0.7120.000 06CgIL17-53.491±0.3942.893±0.2280.009CgIL17-65.080±0.2255.088±0.2950.961CgTNF-13.915±0.5764.159±0.6400.504CgTNF-25.408±0.8434.393±0.6180.039CgTGF-β3.860±0.5863.584±0.0600.278CgIFNLP1.777±0.7570.486±0.4180.004
3 讨论
本研究期间长牡蛎养殖海区出现赤潮，且优势浮游微藻种类由夜光藻向甲藻转变，部分水体理化因子出现显著变化。1T组夜光藻(丰度3 000～5 000个/L)占绝对优势，其生物量达到《赤潮监测技术规程》(HY/T 069—2005)定义的赤潮阈值(≥3×103个/L)[28]，2T组夜光藻呈现消亡期特征，丰度锐减至约500个/L，且出现大量细胞萎缩、破碎和死亡现象；而部分甲藻，如渐尖鳍藻与海洋原甲藻出现明显增殖，丰度由“未检出”上升至1 000个/L以上，成为占据主导地位的浮游微藻类群。两次调查中藻类群落结构的显著差异，揭示了赤潮演替不同阶段的环境胁迫特征。赤潮暴发和演替引发的复合生态胁迫是长牡蛎夏季大规模死亡的重要原因之一。
3.1 夏季赤潮期水体和共生微生物群落结构变化显著
首先，夜光藻暴发增殖形成赤潮时期，藻体对长牡蛎形成典型的机械性窒息风险，水环境溶解氧浓度随赤潮暴发出现下降趋势，氨态氮浓度显著上升，对长牡蛎形成氨毒胁迫，这与2019年江苏海域赤潮事件中水体溶解氧和氨态氮浓度分别出现显著下降和上升、养殖贝类发生大规模死亡高度相似[29]。其次，夜光藻细胞破裂和衰亡使养殖水体出现富营养化[30]，破败藻体释放的胞内物质可能诱发活性氧(ROS)爆发，导致牡蛎抗氧化系统过载。再次，随着衰亡藻体增多和水体营养化进程，甲藻(渐尖鳍藻/海洋原甲藻)以其较强的垂直迁移能力[31]，在营养盐再分配过程中占据生态位竞争优势，赤潮开始从夜光藻向以甲藻为优势群落的结构演替，其产生的腹泻性贝毒和溶血毒素等会加剧鳃组织损伤[32]，如在2016年夏季广西北部湾赤潮演替过程中，水体富营养化加剧，甲藻占比显著升高[33]；氨态氮浓度升高常伴随水质恶化，高浓度的氨态氮会削弱水生生物的免疫能力，并且有利于弧菌等致病微生物的增殖[34]，氨态氮升高与弧菌增殖之间具有潜在的协同致病效应。最后，水环境改变和赤潮优势藻相的更替，也可能诱导水体和长牡蛎鳃组织中微生物群落的适应性演替，鳃组织弧菌丰度的显著增加，可能进一步导致体内共生微生物失衡和免疫刺激。当贝类鳃部弧菌增殖时，弧菌作为病原胁迫引发机体触发病原识别，机体动用糖原等能量物质启动氧化应激程序，进一步驱动免疫功能的发生[35]。以上结果表明，水环境和微生物群落结构因赤潮的暴发、演替而发生改变，长牡蛎在应对赤潮带来的饵料藻类匮乏、呼吸受阻，以及赤潮藻体消解带来的氨态氮增加等环境胁迫时，抵抗病原胁迫能力下降，鳃组织中弧菌的丰度升高，健康状况发生明显变化。
3.2 夏季赤潮期长牡蛎能量储存水平显著下降
赤潮引发的环境胁迫常导致生物能量储备发生变化，糖原过度消耗可能削弱机体应对环境胁迫的能力。本研究中长牡蛎闭壳肌糖原含量从1T组的5.53 mg/g骤降至2T组的0.76 mg/g(P<0.01)，显著低于该物种正常生理水平(5～12 mg/g)[27]；葡萄糖含量呈相反变化趋势，从0.39mg/g上升至1.11 mg/g(P<0.01)。糖原是长牡蛎贮存能量的主要形式，在维持机体能量平衡和应对胁迫响应等方面起着重要作用[36]。夏季长牡蛎糖原支出主要为繁殖活动和环境胁迫应答提供能量，在繁殖期会消耗基础糖原储备的30%～50%用于配子发生[37]，过低的糖原储备水平可能意味着机体在消耗和储存糖原方面出现失衡[38]，本研究中糖原消耗增加可能是长牡蛎繁殖需求和环境胁迫应答的共同结果。长牡蛎闭壳肌糖原含量在两次采样期间急剧下降，提示长牡蛎的能量储备水平发生改变，赤潮暴发所造成的环境胁迫响应生理过程可能消耗了大量糖原等能量储存物质，削弱了其应对环境胁迫的响应能力。糖原含量下降和葡萄糖含量上升的反向变化可能与糖异生激活过程有关，是生物消耗自身储能物质以应对胁迫的响应机制，提示宿主正处于赤潮消败所带来的氧化应激状态。
3.3 夏季赤潮期长牡蛎出现轻度氧化应激
氧化应激指标常与环境胁迫和病原刺激引发的抗氧化反应有关，能够反映机体的抗氧化能力和应激水平。在本研究中，2T组的SOD活性、CAT活性、T-AOC水平及MDA含量4个主要氧化应激指标均显著高于1T组，分别为1T组的1.98、1.88、2.61和3.25倍。SOD和CAT是关键的抗氧化酶，在维持体内活性氧的代谢平衡过程中发挥重要作用[39]。T-AOC可以反映机体抗氧化酶系统和非酶促系统对外部刺激的代偿能力，以及体内自由基的代谢状态[40]，因此可以作为评估机体抗氧化系统功能和状况的综合性指标[41]。SOD和CAT活性及T-AOC显著升高，表明长牡蛎的抗氧化能力增强。MDA是氧化应激的重要中间产物，往往与机体发生氧化应激和线粒体功能障碍所引发的细胞损伤有关[42]，本研究中MDA含量显著增加反映了长牡蛎体内的脂质过氧化水平升高和可能因此带来的氧化损伤[43]。这与以往研究报道一致，如2019年青岛海域赤潮事件中，甲藻(Cochlodinium polykrikoides)暴发形成的赤潮，造成长牡蛎鳃组织发生氧化应激，并出现个体损伤和死亡，长牡蛎鳃组织MDA 含量激增至正常个体的 5.3倍(P<0.01)[44]。因此，两次调研中长牡蛎抗氧化水平明显提高，2T组个体可能出现轻度氧化应激和损伤。
3.4 夏季赤潮期长牡蛎部分细胞因子表达水平变化显著
细胞因子是生物体响应病原刺激和诱发免疫反应的重要分子，也是免疫反应过程的主要指示因子。本项目组在前期研究中发现，长牡蛎CgIL17s、CgTNFs和CgIFNLP通过调控细胞增殖和炎症反应等参与免疫调节，是长牡蛎免疫反应的重要生物标志分子[24-26]。长牡蛎多种细胞因子的mRNA绝对表达量在赤潮暴发过程中出现了显著变化。如2T组CgIL17-4表达量显著上升，为1T组的1.92倍，CgIL17-4是长牡蛎进行免疫应答反应的重要指示因子，已有研究表明，当CgIL17-4的mRNA绝对表达量超过3.18 lg(copies/mL)时提示长牡蛎发生免疫应答反应[24]，本研究中2T组CgIL17-4表达量为4.379 lg(copies/mL)，已超过其阈值水平。同时，CgIL17-5、CgIFNLP和CgTNF-2的mRNA绝对表达量出现显著下降，这与前期研究报道一致。研究表明，IL17-5、IFNLP和TNF-2在贝类免疫应答中呈现动态调控，其在病原刺激后的调控作用表明其表达可能受免疫应答的负反馈调节[45]。如CgHMGB1通过MAPK/NF-κB通路诱导CgIL17-5表达，但在高浓度LPS刺激后表达下调[46]，提示这与本试验中的长牡蛎鳃组织弧菌感染显著增高相互印证，进一步提示宿主的免疫响应主要来自鳃组织显著增高的弧菌。CgTNF-2通过调控细胞周期基因促进免疫细胞增殖，但过度炎症会触发其表达抑制，TNF家族成员在过度炎症中可能通过负反馈环路下调表达，以避免组织损伤[47]。然而，长牡蛎细胞因子在免疫过程中的表达变化往往具有整体性和复杂性，其具体表达变化所提示的功能特征还有待深入研究。此外，氧化应激过程的中间产物ROS能够作为信号分子介导免疫过程，以及激活细胞因子启动下游免疫反应。如在弧菌感染初期ROS可以启动抗菌基因的表达，触发免疫反应；当感染持续，机体ROS积累突破抗氧化阈值时，会引发细胞坏死，进一步加剧氧化应激状态[48]。以上结果提示，长牡蛎在两次调查时部分细胞因子表达量变化显著，可能发生免疫应答反应。
综上，本研究中于大连市庄河市王家岛长牡蛎养殖海区赤潮发生与演替时，解析了养殖环境变化及长牡蛎的生理响应特征，研究表明，夏季养殖水体中藻类过量增殖，形成赤潮并加快水质恶化，大量增殖的赤潮藻类挤占饵料藻类生态位，同时在赤潮藻类优势藻种转变的过程中，藻类衰亡消耗水体溶解氧，促进氨态氮浓度升高，诱导病原微生物增殖。以上结果表明，在赤潮发生过程中，长牡蛎能量消耗加剧，出现氧化应激，并发生免疫应答反应，健康水平发生明显改变。本研究结果有助于深入认识夏季养殖环境的变化规律，以及长牡蛎在面对这些变化所发生的机体响应特征，为阐明长牡蛎在夏季大规模死亡的发生机制提供了理论依据，同时也为赤潮期间牡蛎健康的预警及养殖管理提供了有益参考。
4 结论
1)赤潮期水环境中浮游微藻优势种由夜光藻演替为甲藻，弧菌在鳃组织中显著富集，表明赤潮胁迫引发水环境和长牡蛎鳃组织微生物种群结构改变。
2)赤潮期长牡蛎闭壳肌糖原储备骤降，同时发生氧化应激和免疫应答反应，提示长牡蛎在赤潮期出现健康风险。
3)养殖人员可根据赤潮期的海区生态环境变化和长牡蛎响应特征，加强对相关指标监测，并通过降笼或提前出售等方式防范赤潮期养殖风险，以减少产业损失。
[1] 国家贝类产业技术体系.中国牡蛎产业发展报告[J].中国水产,2021(6):20-31. National shellfish industry technology system.China oyster industry development report [J].China Fisheries,2021(6):20-31.(in Chinese)
[2] 毛玉泽,周毅,杨红生,等.长牡蛎(Crassostrea gigas)代谢率的季节变化及其与夏季死亡关系的探讨[J].海洋与湖沼,2005,36(5):445-451. MAO Y Z,ZHOU Y,YANG H S,et al.Seasonal variation in metabolic rate of Pacific oyster,Crassostrea gigas and its implication to summer mortality[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2005,36(5):445-451.(in Chinese)
[3] 宋林生.海水养殖贝类病害预警预报技术及其应用[J].大连海洋大学学报,2020,35(1):1-9. SONG L S.An early warning system for diseases during mollusc mariculture:exploration and utilization[J].Journal of Dalian Ocean University,2020,35(1):1-9.(in Chinese)
[4] 张凤娇.大连周边海域夜光藻生消变化规律及其对浮游生物群落结构影响的探究[D].大连:大连海洋大学,2024. ZHANG F J.Exploration of the growth and elimination of noctilucent algae in the waters around Dalian and its impact on plankton community structure[D].Dalian:Dalian Ocean University,2024.(in Chinese)
[5] BASTI L,NAGAI S,GO J,et al.Differential inimical effects of Alexandrium spp.and Karenia spp.on cleavage,hatching,and two larval stages of Japanese pearl oyster Pinctada fucata martensii[J].Harmful Algae,2015,43:1-12.
[6] ZHANG X,HUANG B W,ZHENG Y D,et al.Identification and characterization of infectious pathogens associated with mass mortalities of Pacific oyster (Crassostrea gigas) cultured in northern China[J].Biology,2023,12(6):759.
[7] 慕翠敏.长牡蛎净化技术及赤潮甲藻对其性成熟和早期发育的影响研究[D].青岛:中国海洋大学,2014. MU C M.Depuration of Pacific oyster Crassostrea gigas and effects of the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella on sexual maturation and early development of C.gigas[D].Qingdao:Ocean University of China,2014.(in Chinese)
[8] 李丽,马方方,翟晓辉,等.深圳湾海域赤潮生物演变及赤潮预警关键因子分析[J].生态科学,2022,41(3):82-89. LI L,MA F F,ZHAI X H,et al.Analysis on the key factors for the population evolution and early warning of harmful algal blooms based on an algal bloom in Shenzhen bay,the South China Sea[J].Ecological Science,2022,41(3):82-89.(in Chinese)
[9] 中华人民共和国自然资源部.中国海洋灾害公报(2023)[EB/OL].北京: 中华人民共和国自然资源部,2024.http://101.231.140.106/gk/gbytj/202405/t20240510_28037.shtml. Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China.Bulletin of China marine disaster (2023) [EB/OL].Beijing: Ministry of Natural Resources of the People’s Republic of China.2024.http://101.231.140.106/gk/gbytj/202405/t20240510_28037.shtml.(in Chinese)
[10] 任姝彤.中国近海突发性海洋灾害的特征分析与评分[D].青岛:中国海洋大学,2015. REN S T.Statistics analysis and grade of the accidental oceanic disasters in China Sea[D].Qingdao:Ocean University of China,2015.(in Chinese)
[11] WEI W Y,HAN Y,ZHOU Y T.Nutrients and sea surface temperature drive harmful algal blooms in China’s coastal waters over the past decades[J].Environmental Research Letters,2023,18(9):094068.
[12] BASTI L,ENDO M,SEGAWA S,et al.Prevalence and intensity of pathologies induced by the toxic dinoflagellate,Heterocapsa circularisquama,in the Mediterranean mussel,Mytilus galloprovincialis[J].Aquatic Toxicology,2015,163:37-50.
[13] MARTINS J C,DOM
NGUEZ-P
REZ D,AZEVEDO C,et al.Molecular responses of mussel Mytilus galloprovincialis associated to accumulation and depuration of marine biotoxins okadaic acid and dinophysistoxin-1 revealed by shotgun proteomics[J].Frontiers in Marine Science,2020,7:589822.
[14] 福建省海洋与渔业局.福建省赤潮灾害信息 [EB/OL].(2019-05-27).https://hyyyj.fujian.gov.cn/xxgk/tzgg/201905/t20190527_4885388.htm. Ocean and Fisheries Agency of Fujian Province.Report of Red Tide Disaster in Fujian Province.[EB/OL].(2019-05-27) https://hyyyj.fujian.gov.cn/xxgk/tzgg/201905/t20190527_4885388.htm.(in Chinese)
[15] 张善发,王茜,关淳雅,等.2001—2017年中国近海水域赤潮发生规律及其影响因素[J].北京大学学报(自然科学版),2020,56(6):1129-1140. ZHANG S F,WANG Q,GUAN C Y,et al.Study on the occurrence law of red tide and its influencing factors in the offshore waters of China from 2001 to 2017[J].Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis(Natural Science Edition),2020,56(6):1129-1140.(in Chinese)
[16] 孙颖颖,徐深圳,张静,等.浒苔和紫菜等2种海藻干体对3种赤潮微藻生长的抑制作用[J].海洋通报,2012,31(4):433-440. SUN Y Y,XU S Z,ZHANG J,et al.Inhibition of Enteromorpha prolifera and Porphyra yazoensis powders on the growth of three species of the red tide microalgae[J].Marine Science Bulletin,2012,31(4):433-440.(in Chinese)
[17] 马金华,孟希,张淑,等.链状亚历山大藻赤潮衰亡的生理调控[J].生态学报,2013,33(13):3978-3986. MA J H,MENG X,ZHANG S,et al.Physiological regulation related to the decline of Alexandrium catenella[J].Acta Ecologica Sinica,2013,33(13):3978-3986.(in Chinese)
[18] ROLTON A,VIGNIER J,SOUDANT P,et al.Effects of the red tide dinoflagellate,Karenia brevis,on early development of the eastern oyster Crassostrea virginica and northern quahog Mercenaria mercenaria[J].Aquatic Toxicology,2014,155:199-206.
[19] ZHAO Z F,SUN J Q,YIN Z Q,et al.Analysis of the ecosystem structure and energy flow in the waters of the Wangjiadao islands[J].Sustainability,2023,15(5):4104.
[20] 董婧,刘海映,李培军,等.海洋岛与王家岛周围海域赤潮生物夜光藻生态初探[J].海洋环境科学,1999,18(4):48-51. DONG J,LIU H Y,LI P J,et al.Preliminary study on the ecology of red tide organism Noctiluca scientillans around near Shicheng Island and Wangjia Island[J].Marine Environmental Science,1999,18(4):48-51.(in Chinese)
[21] 国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.海洋监测规范 第4部分:海水分析:GB 17378.4—2007[S].北京:中国标准出版社,2008. General Administration of Quality Supervision,Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China,Standardization Administration of the People’s Republic of China.The specification for marine monitoring:Part 4:Seawater analysis:GB 17378.4—2007[S].Beijing:Standards Press of China,2008.(in Chinese)
[22] LORENZEN C J.Determination of chlorophyll and pheo-pigments:spectrophotometric equations1[J].Limnology and Oceanography,1967,12(2):343-346.
[23] LIANG Y,ZHANG G T,WAN A Y,et al.Nutrient-limitation induced diatom-dinoflagellate shift of spring phytoplankton community in an offshore shellfish farming area[J].Marine Pollution Bulletin,2019,141:1-8.
[24] ZHANG Z Y,GAO L,LI Q S,et al.The different expression patterns of cytokines in Pacific oyster Crassostrea gigas response against bacterial stimulation[J].Aquaculture,2023,575:739743.
[25] ZHAO J Y,ZHAO B,KONG N,et al.Increased abundances of potential pathogenic bacteria and expressions of inflammatory cytokines in the intestine of oyster Crassostrea gigas after high temperature stress[J].Developmental and Comparative Immunology,2023,141:104630.
[26] 张子杨.长牡蛎细胞因子的免疫响应状态评价研究[D].大连: 大连海洋大学,2023. ZHANG Z Y.Evaluation of immune response status of cytokines in Crassostrea gigas [D].Dalian: Dalian Ocean University,2023 (in Chinese).
[27] 高磊,孔宁,刘冉阳,等.夏季北黄海贝类养殖区环境因子、长牡蛎糖原和免疫指标变化的调查[J].水产学报,2024,48(4):167-178. GAO L,KONG N,LIU R Y,et al.Investigation on the variation of environmental factors,glycogen and immune parameters of Pacific oyster (Crassostrea gigas) in the North Yellow Sea shellfish farming area in summer[J].Journal of Fisheries of China,2024,48(4):167-178.(in Chinese)
[28] 中华人民共和国国家海洋局.赤潮监测技术规程:HY/T 069—2005[S].北京:中国标准出版社,2005. State Oceanic Administration of the People’s Republic of China.Technical specification for red tide minitoring:HY/T 069—2005[S].Beijing:Standards Press of China,2005.(in Chinese)
[29] 曹兵,高清清,何佩东,等.江苏海域赤潮发生消亡与水文气象因子关系研究[J].海洋湖沼通报,2019,41(3):36-42. CAO B,GAO Q Q,HE P D,et al.Study on the relationship between occurrence and extinction of red tide and the hydrological and meteorological factors in Jiangsu Sea area[J].Transactions of Oceanology and Limnology,2019,41(3):36-42.(in Chinese)
[30] 黎慧玲,徐轶肖,吴淼,等.北部湾首次记录到的大规模夜光藻赤潮期间浮游植物与细菌群落分析[J].海洋学报,2023,45(5):39-52. LI H L,XU Y X,WU M,et al.Analysis of phytoplankton and bacterial community during the first recorded massive Noctiluca scintillans bloom in the Beibu Gulf,China[J].Haiyang Xuebao,2023,45(5):39-52.(in Chinese)
[31] 赵越,于仁成,张清春,等.北部湾海域微型、微微型浮游植物类群季节变化及其与棕囊藻赤潮的关系初探[J].海洋与湖沼,2019,50(3):590-600. ZHAO Y,YU R C,ZHANG Q C,et al.Relationship between seasonal variation of pico-and nano-phytoplankton assemblages and Phaeocystis red tides in Beibu gulf[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2019,50(3):590-600.(in Chinese)
[32] 陈夕,吴彪,王岩,等.测定牡蛎糖原含量的微量反应体系的建立与优化[J].南方水产科学,2021,17(4):126-132. CHEN X,WU B,WANG Y,et al.Establishment and optimization of micro-reaction system for determination of oyster glycogen content[J].South China Fisheries Science,2021,17(4):126-132.(in Chinese)
[33] 刘文广,李琪,高凤祥.饥饿对长牡蛎能量储存和配子发生的影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版),2008,38(4):567-572. LIU W G,LI Q,GAO F X.Effect of starvation on energy reserves and gametogenesis in the Pacific oyster Crassostrea gigas[J].Periodical of Ocean University of China(Natural Science Edition),2008,38(4):567-572.(in Chinese)
[34] GAO N,SHU Y,WANG Y,et al.Acute ammonia causes pathogenic dysbiosis of shrimp gut biofilms[J].International Journal of Molecular Sciences,2024,25(5): 2614.
[35] DE DECKER S,SAULNIER D.Vibriosis induced by experimental cohabitation in Crassostrea gigas:evidence of early infection and down-expression of immune-related genes[J].Fish &Shellfish Immunology,2011,30(2):691-699.
[36] WANG X X,WEI Y H,CONG R H,et al.DNA methylation-mediated energy metabolism provides new insight into the quality losses during oyster reproductive process[J].Aquaculture,2024,583:740595.
[37] 王朔,薛茗元,杨琼,等.不同育性三倍体长牡蛎性腺发育过程中的营养成分比较[J].水产学报,2021,45(1):88-97. WANG S,XUE M Y,YANG Q,et al.Comparison of nutritional components of different fertility triploid Pacific oyster (Crassostrea gigas) during gonadal development[J].Journal of Fisheries of China,2021,45(1):88-97.(in Chinese)
[38] 邢镇.高温胁迫下长牡蛎(Crassostrea gigas)氧化应激响应和评价研究[D].大连:大连海洋大学,2023. XING Z.Evaluation of the oxidative status of Pacific oyster Crassostrea gigas under high temperature stress[D].Dalian:Dalian Ocean University,2023.(in Chinese)
[39] 孟广玮,李琪,徐成勋,等.高温胁迫对长牡蛎‘海大3号’品系存活及5项免疫指标的影响[J].中国水产科学,2019,26(4):738-744. MENG G W,LI Q,XU C X,et al.Effects of high-temperature stress on survival and five immune indicators of Pacific oyster ‘Haida No.3’[J].Journal of Fishery Sciences of China,2019,26(4):738-744.(in Chinese)
[40] 葛平安,高磊,王玲,等.夏季北黄海三倍体长牡蛎的养殖环境和健康指标调查[J].水产学报,2025,49(4):129-139. GE P A,GAO L,WANG L,et al.Investigation and research on the cultivation environment and health index of triploid Crassostrea gigas in the North Yellow Sea during summer[J].Journal of Fisheries of China,2025,49(4):129-139.(in Chinese)
[41] KÖPRÜCÜ K,YONAR S M,
EKER E.Effects of cypermethrin on antioxidant status,oxidative stress biomarkers,behavior,and mortality in the freshwater mussel Unio elongatulus Eucirrus[J].Fisheries Science,2010,76(6):1007-1013.
[42] 甄静静.镉诱导文蛤鳃细胞凋亡检测及金属硫蛋白的作用机制[D].温州:温州大学,2018. ZHEN J J.Detection of apoptosis of gill cells inducedby cadmium and mechanism of action of metallothionein[D].Wenzhou:Wenzhou University,2018.(in Chinese)
[43] 朱艳青,陈素华,陈爱华,等.高温胁迫对两个文蛤群体存活、代谢和相关酶活的影响[J/OL].海洋渔业,2024:1-19.(2024-07-01).http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=HTYY20240628001&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ. ZHU Y Q,CHEN S H,CHEN A H,et al.Effects of high temperature stress on the survival,metabolism,and related enzyme activities of two Meretrix meretrix populations [J/OL].China Industrial Economics,2024:1-19.(2024-07-01).http://kns.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?filename=HTYY20240628001&dbname=CJFD&dbcode=CJFQ.(in Chinese)
[44] SHIN Y K,NAM S E,KIM W J,et al.Red tide dinoflagellate Cochlodinium polykrikoides induces significant oxidative stress and DNA damage in the gill tissue of the red seabream Pagrus major[J].Harmful Algae,2019,86:37-45.
[45] 孙洁洁,宋林生.贝类炎症及其发生机制研究进展[J].大连海洋大学学报,2023,38(3):369-379. SUN J J,SONG L S.Inflammation and its mechanism in molluscs:a review[J].Journal of Dalian Ocean University,2023,38(3):369-379.(in Chinese)
[46] LÜ X Q,YANG W W,GUO Z C,et al.CgHMGB1 functions as a broad-spectrum recognition molecule to induce the expressions of CgIL17-5 and Cgdefh2 via MAPK or NF-κB signaling pathway in Crassostrea gigas[J].International Journal of Biological Macromolecules,2022,211:289-300.
[47] WU W,SUN J J,DONG M R,et al.CgTNF-2 promotes the proliferation of haemocytes by regulating the expressions of CgRunx and cell cycle related genes in the Pacific oyster Crassostrea gigas[J].Fish &Shellfish Immunology,2023,132:108478.
[48] LI W J,LUO F L,WU X H,et al.Anti-inflammatory effects and mechanisms of dandelion in RAW264.7 macrophages and zebrafish larvae[J].Frontiers in Pharmacology,2022,13:906927.