趋化因子(chemokine)是一类相对分子质量仅为8 000～12 000的小分子细胞因子，在先天和适应性免疫中均发挥重要作用。趋化因子可通过结合位于细胞膜表面的趋化因子受体，激活并诱导淋巴细胞迁移参与机体抗感染、组织发育和血管生成等生物学过程[1]。同时，部分趋化因子成员具有不依赖于受体的直接抗感染作用，可直接结合并杀灭病原微生物，具有这样“双重作用”的趋化因子也被称为“kinocidin”[2]。
白介素-8(Interleukin-8，IL-8)是CXC型趋化因子家族成员，也被称为CXCL8[3]。哺乳类IL-8是一种kinocidin，其可通过受体CXCR1和CXCR2介导的信号通路，诱导中性粒细胞的定向趋化和激活[4-5]，也可直接杀灭病原(如白色念珠菌)，促进机体抗感染[2]。目前，IL-8在鱼类中已有广泛的研究，其趋化作用已在多种鱼类中被证实。如斑马鱼IL-8可趋化中性粒细胞移动至机体损伤部位[6]；牙鲆IL-8可激活外周血白细胞，促进其趋化、增殖和吞噬，并诱导IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达[7]。在机制层面的分析发现，鱼类IL-8的趋化作用及对炎症因子的诱导调控均依赖于受体CXCR1/CXCR2介导的信号通路，这与哺乳类IL-8类似[6，8]。然而，关于鱼类IL-8直接抗感染作用的研究目前并不多见。在线鳢、虹鳟和大西洋鲑中发现，IL-8的C末端α螺旋区具有直接的抗菌活性[9-11]，而IL-8完整蛋白的直接抗菌作用则在最新的两项研究中被发现，即尖吻鲈和牙鲆IL-8能够直接抑制或杀灭病原菌，然而其抗菌机制尚不清楚，有待进一步解析[7，12]。
鳜(Siniperca chuatsi)，隶属鲈形目，是中国重要的淡水经济鱼类。随着鳜养殖规模的扩大，病害发生日渐频繁，严重影响鳜养殖业的健康发展[13-15]。因此，对鳜抗病免疫机理的研究具有重要的产业意义。鳜IL-8(SCIL-8)已被报道对头肾白细胞具有趋化能力，并能促进IL-1β等炎症因子的表达，在鱼体抗感染炎症反应中发挥作用[16]。然而，SCIL-8是否具有直接的病原杀伤作用，目前还不清楚。本研究中对鳜IL-8的理化性质和结构特征展开分析，并通过原核表达制备蛋白，检测了其对多种鱼类致病菌的直接抗菌作用，并探讨了相关抗菌机制，以期丰富对SCIL-8多样的抗感染方式的认识，为鳜病害防控提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用鳜购自湖北省荆州市某养殖场。抗菌试验中使用的大肠杆菌(Escherichia coli ATCC11775)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、中间气单胞菌(Aeromonas media)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)为本实验室保藏。
载体和试剂：总RNA提取使用TRIzol试剂盒，购自Invitrogen；cDNA合成使用反转录试剂盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit，质粒构建使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit，均购自南京诺唯赞公司；荧光定量PCR使用2×SYBR Green qPCR Mix试剂，购自山东思科捷公司；采用Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)进行基因扩增；采用His-tag蛋白纯化磁珠(ATGCTM)进行蛋白纯化；采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(索莱宝公司)测定蛋白浓度；碘化丙啶(propidium iodide，PI)和DiBAC4(3)探针均购自索莱宝公司。
1.2 方法
1.2.1 鳜IL-8的理化性质和结构分析 由于鳜IL-8序列已报道[16]，根据已知信息，将其成熟肽区域进行净电荷和等电点预测(https：//www.novopro.cn/tools/calc_peptide_property.html)，并使用Swiss-model进行同源建模(https：//swissmodel.expasy.org/)，所得模型在Pymol软件中进行三维结构和表面电势展示。
1.2.2 鳜头肾白细胞的分离和LPS刺激 鳜头肾白细胞的分离方法参考笔者前期研究成果[17]。将所得细胞密度调整为5×106 cells/mL，种于12孔板(1 mL/孔)，置于含5% CO2的28 ℃培养箱中。细胞静置培养2 h后，向孔内加入LPS(用PBS配置为母液)至终浓度为50 μg/mL，对照孔加入等体积PBS，静置培养6 h后用TRIzol试剂盒收样。
1.2.3 总RNA提取、cDNA制备和荧光定量检测 TRIzol试剂盒收取细胞后，按试剂盒说明书提取总RNA，采用NanoDrop仪器检测RNA浓度，并按照反转录试剂盒操作说明进行cDNA模板制备。合成SCIL-8的荧光定量引物(表1)，根据2×SYBR Green qPCR Mix试剂操作说明进行荧光定量反应体系配置，并采用CFX96 Real-Time PCR Detection System仪器进行荧光定量检测。
表1 试验用引物序列
Tab.1 Primer sequence used in experiments
引物 primer 序列 (5'-3') primersequence (5'-3') 用途 application SCIL8qF ACCTCTATTGTGGTGCTCCTG 荧光定量 SCIL8qR CAGTGGGAGTTGGCAGGAAT 荧光定量 SCactinqF GAGAGGGAAATCGTGCGTGA 荧光定量 SCactinqR CATACCGAGGAAGGAAGGCTG 荧光定量 SCIL8hrF ATGGGTCGCGGATCCGAATTC- ATGAGCCTGAGAAGCCTGGG 质粒构建 SCIL8hrR CTCGAGTGCGGCCGCAAGC- TTTCAGCGTCTTTTGTTGGA 质粒构建
1.2.4 引物设计 根据鳜IL-8序列(JQ513375.1)及鳜β-actin序列(FJ436084.1)，采用Primer Premier软件分别设计引物用于荧光定量检测(表1)，其中，β-actin为内参。根据ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit操作说明，设计原核表达重组质粒构建所需引物。
1.2.5 原核表达和蛋白纯化 按照Ex Taq DNA聚合酶说明书，使用SCIL8hrF/R引物(表1)扩增SCIL-8基因成熟肽区域。将所得片段纯化后，使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit与pET-28a(+)载体连接，连接产物命名为pET-28a-SCIL-8。所得产物转化入DH5α感受态，PCR确定阳性克隆。从阳性克隆中提取重组质粒，转化入BL21感受态中，构建表达菌株，并进行测序验证。将验证正确的菌株用于目的蛋白表达和纯化，操作方法参考笔者已发表论文[18]。所得产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行条带验证，BCA试剂盒测定蛋白浓度。
1.2.6 抑菌试验 将受试菌培养至对数生长期，另将SCIL-8蛋白(溶解于50 mmol/L的Tris缓冲液)进行梯度稀释。将5 μL菌液与45 μL梯度稀释的蛋白溶液混合，在所得的50 μL混合液中，细菌终浓度为105 CFU/mL，蛋白终浓度分别为4、8、16、32 μmol/L。对照组为5 μL菌液与45 μL Tris缓冲液的混合。混合液转移至96孔板，于酶标仪中检测600 nm处的吸光度值，作为初始吸光度。板子静置培养至对照孔有明显的细菌生长后，再次测定吸光度值，作为最终吸光度。细菌生长情况的计算公式为
细菌生长百分比
(1)
1.2.7 流式试验 将受试菌培养至对数生长期，离心去除培养基，用Tris缓冲液重悬。取100 μL菌液与400 μL SCIL-8蛋白溶液(或BSA蛋白溶液，作为对照)混合，所得500 μL混合液中，细菌终浓度为108 CFU/mL，SCIL-8蛋白终浓度为16 μmol/L(BSA蛋白终浓度与SCIL-8的最终质量浓度相同)。混合液静置孵育2 h后，离心去除蛋白，分别使用碘化丙啶(终浓度为10 μmol/L；用于检测菌膜通透性)或膜电位探针DiBAC4(3)(终浓度为5 μmol/L；用于检测菌膜去极化)避光染色30 min。离心去除探针，500 μL PBS重悬菌体，流式检测染色情况，后使用Flowjo软件分析流式结果。
1.3 数据处理
试验结果以平均值±标准误(mean±S.E.)表示，采用SPSS 16.0软件进行独立样本T检验分析，显著性水平设为0.05，极显著性水平设为0.01。
2 结果与分析
2.1 鳜IL-8的结构与表达分析
鳜IL-8成熟肽净电荷含量(pH=7时)为+4.1，预测等电点为9.15，分子整体携带净正电荷，呈现“阳离子性”(cationicity)(图1A)。同源建模表明，鳜IL-8具有趋化因子的典型结构：N端为无规则卷曲，中间部分为3个反向平行β折叠，C端为α螺旋结构(图1A上排)。静电势预测发现，鳜IL-8的表面静电势分布不均匀，带正电荷的氨基酸残基主要分布于C端α螺旋区，少量分布于N端无规则卷曲部分，疏水性氨基酸残基主要分布于中部β折叠区，且正电荷和疏水性氨基酸残基分别聚集于分子表面两侧，使分子整体呈现“两亲性”(amphipathicity)(图1A下排)。值得注意的是，阳离子性和两亲性特征常见于抗菌肽，是抗菌肽对细菌菌膜破坏功能的结构基础[19]。鳜IL-8具有这两个特征，暗示其可能具有类似抗菌肽的直接抗菌活性。此外，使用LPS作用于鳜头肾白细胞，荧光定量检测发现，SCIL-8具有明显的表达上调(图1B)，表明SCIL-8可能参与机体抗菌免疫。
A—鳜IL-8的三维结构(上排)及分子表面静电势分布预测(下排)。在表面静电势分布中，蓝色、红色和白色分别代表正电荷氨基酸残基、负电荷氨基酸残基和疏水性氨基酸残基；上排和下排分别以相同的角度呈现。B—荧光定量PCR检测LPS刺激鳜头肾白细胞6 h后IL-8的表达变化。**表示与对照组相比有极显著性差异(P<0.01)，下同。
A—the prediction of three-dimensional structure (top row) and molecular surface electrostatic potential distribution (bottom row) of SCIL-8.In the electrostatic potential distribution，the positive，negative and hydrophobic charges are indicated in blue，red and white respectively，the top and bottom row are presented in the same angle. B—the expression change of SCIL-8 in mandarin fish head kidney leukocytes following 6 hours of LPS stimulation is detected by real-time quantitative PCR.**means very significant difference compared with control group(P<0.01)，et sequentia.
图1 鳜IL-8的结构与表达分析
Fig.1 Structural and expression analysis of SCIL-8
2.2 鳜IL-8的蛋白制备
为了探究SCIL-8是否具有直接抗菌活性，使用pET-28a原核表达载体对其进行蛋白制备。结果表明，pET-28a-SCIL-8重组质粒在IPTG诱导后，相比于pET-28a空质粒，在相对分子质量约为12 000处有明显条带，条带大小符合鳜IL-8重组蛋白的预测分子量。重组质粒经大体积诱导和纯化后得到目的蛋白SCIL-8(图2)，所得蛋白将用于后续抗菌功能和机制研究。
1—pET-28a空质粒诱导组；2—pET-28a-SCIL-8重组质粒诱导组；3—纯化的SCIL-8蛋白。
1—induced pET-28a empty vector；2—induced pET-28a-SCIL-8 recombinant plasmid；3—purified SCIL-8 protein.
图2 鳜IL-8的蛋白制备
Fig.2 Preparation of SCIL-8 protein
2.3 鳜IL-8的直接抗菌功能检测
将受试菌与梯度稀释的鳜IL-8蛋白混合培养，检测蛋白对细菌生长的影响。结果表明，鳜IL-8对3种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、嗜水气单胞菌、中间气单胞菌)和2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、无乳链球菌)均表现出明显的生长抑制作用，在4 μmol/L时即有抑菌效果，在32 μmol/L时能够完全抑制受试菌的生长(图3)，表明鳜IL-8具有直接抗菌功能。
(a)～(e)—大肠杆菌(a)，嗜水气单胞菌(b)，中间气单胞菌(c)，金黄色葡萄球菌(d)和无乳链球菌(e)在不同浓度鳜IL-8蛋白处理下的细菌生长百分比(μmol/L)。
(a)-(e)—the bacterial growth of E.coli (a)，A.hydrophila (b)，A.media(c)，S.aureus (d) and S.agalactiae (e) following the treatment of different concentrations of SCIL-8 protein (μmol/L).
图3 鳜IL-8的直接抗菌功能检测
Fig.3 Detection of the direct antibacterial function of SCIL-8
2.4 鳜IL-8的直接抗菌机制分析
由于鳜IL-8具有与抗菌肽共同的阳离子性和两亲性特征(图1A)，而这两个特征是抗菌肽对细菌菌膜破坏作用的关键[19]，推测鳜IL-8可能有类似的菌膜破坏作用。通过流式检测PI和DiBAC4(3)对鳜IL-8处理后大肠杆菌的染色情况分析可知，PI是一种核酸染料，无法透过完整的菌膜，但当膜通透性提升或膜破损时，其可通过菌膜进入细菌内部，与核酸结合而发出荧光。DiBAC4(3)是一种膜电位探针，可通过去极化的菌膜，与胞内物质结合而发出增强的荧光，荧光越强代表膜去极化程度越高。结果表明，大肠杆菌经鳜IL-8蛋白处理后，21.2%的菌体有明显的PI着色，远高于对照组(图4A)，且全部菌体平均荧光强度也与对照组有显著性差异(图4C)，表明鳜IL-8可引发大肠杆菌膜通透性提升或膜破损。同样，鳜IL-8处理后的大肠杆菌有30%菌体表现出明显的DiBAC4(3)染色，相比对照组有明显提升(图4B)，且全部菌体的平均荧光强度也显著高于对照组(图4D)，表明鳜IL-8可导致大肠杆菌菌膜去极化。上述结果表明，鳜IL-8对大肠杆菌具有膜破坏作用。
A～D—流式检测大肠杆菌经鳜IL-8蛋白处理后对PI(A，C)和DiBAC4(3)(B，D)的着色变化。其中，A和B为流式直方图，C和D为平均荧光强度分析。
A-D—flow cytometric analysis ofE.coli following treatment with SCIL-8 protein，showing changes in PI (A，C) and DiBAC4(3) (B，D) staining.Panels A and B present flow cytometry histograms，while C and D illustrate mean fluorescence intensity analysis.
图4 鳜IL-8对大肠杆菌的膜破坏作用分析
Fig.4 Analysis of membrane-disrupting effect of SCIL-8
进一步分析鳜IL-8对鱼类致病菌的抗菌机制。以中间气单胞菌和无乳链球菌为受试菌，发现鳜IL-8可分别使17.1%和35.6%的菌体对PI着色，远高于对照组(图5A、B)，且两种受试菌的平均荧光强度与对照组相比有显著性提升(图5C、D)。以上结果表明，鳜IL-8可通过破坏菌膜发挥直接抗菌作用。
A～D—流式检测中间气单胞菌(A，C)和无乳链球菌(B，D)经鳜IL-8蛋白处理后对PI的着色变化。其中，A和B为流式直方图，C和D为平均荧光强度分析。
A-D—Flow cytometric analysis of A.media (A，C) and S.agalactiae (B，D) following treatment with SCIL-8 protein，showing changes in PI staining.Panels A and B present flow cytometry histograms，while C and D illustrate mean fluorescence intensity analysis.
图5 鳜IL-8对中间气单胞菌和无乳链球菌的膜破坏作用分析
Fig.5 Analysis of membrane-disrupting effect of SCIL-8 on Aeromonas media and Streptococcus agalactiae
3 讨论
3.1 鳜IL-8具有直接抗菌相关结构基础
抗菌肽是一类具有直接杀菌活性的天然小分子肽，其杀菌机制主要表现为对细菌菌膜的破坏作用[19]。抗菌肽通常富含阳离子氨基酸，如精氨酸、赖氨酸和组氨酸，分子携带净正电荷，呈现“阳离子性”。由于细菌菌膜表面常携带负电荷基团，如磷壁酸和脂多糖，抗菌肽可凭借其阳离子性，通过静电吸引与细菌表面基团结合。抗菌肽也含有一定比例的疏水性氨基酸，且阳离子与疏水性氨基酸分别聚集分布于空间结构的两侧，分子呈现“两亲性”。而细菌菌膜的基本组成单位为磷脂分子，也具有两亲性。抗菌肽可凭借其阳离子聚集区，与磷脂分子中携带负电荷的磷酸头部发生静电相互作用，同时凭借其疏水区，与磷脂分子的脂肪链尾部发生疏水相互作用，从而插入菌膜磷脂分子层中。抗菌肽凭借其阳离子性和两亲性特征与菌膜相互作用，形成跨膜孔洞或引发菌膜局部瓦解，导致细菌内含物外流及死亡[20-21]。因而，阳离子性和两亲性特征为抗菌肽的直接抗菌活性提供了结构基础。
鳜IL-8的分子净电荷含量为+4.1，且阳离子与疏水性氨基酸残基在分子表面的不同区域聚集分布，因而具有阳离子性和两亲性，这样的结构特征将有利于鳜IL-8破坏细菌菌膜及发挥直接抗菌作用。因而，鳜IL-8具有直接抗菌相关结构基础。
3.2 鳜IL-8通过破坏菌膜发挥直接抗菌作用
将鳜IL-8蛋白与受试菌共孵育后，检测发现细菌生长受到明显抑制，表明鳜IL-8具有直接抗菌作用。分别使用PI和DiBAC4(3)对鳜IL-8处理后的菌体染色，发现细菌着色均远高于对照组，表明鳜IL-8可破坏细菌菌膜，使其通透性提升或造成膜破损，并促使菌膜发生去极化。在对抗菌肽的机制研究中发现，其插入细菌菌膜后，可破坏磷脂双分子层的规则排列，增加膜结构的不稳定性，形成孔道或引发膜局部瓦解，导致膜通透性提升或膜破损。而膜的不完整会进一步干扰细菌的离子平衡，如引发质子内流及钾离子外流，造成菌膜去极化，继而影响菌膜呼吸链的正常功能，导致ATP合成受阻，从而影响细菌的各项耗能反应[21-22]。可见，菌膜的破坏对细菌的影响十分广泛。鳜IL-8对大肠杆菌及致病菌的菌膜均有破坏作用，膜破坏是其抗菌机制。
事实上，不同kinocidin成员对菌膜的破坏作用均有报道。如虹鳟CK11，一种CC型趋化因子，具有阳离子性和两亲性特征，能够破坏细菌菌膜及寄生虫的细胞膜，从而发挥直接的抗感染作用[23]。草鱼CXCL20a，一种硬骨鱼特有的CXC型趋化因子，也具有阳离子性和两亲性特征，能够在菌膜上打孔而介导细菌死亡[24]。因此，对菌膜的直接破坏可能是kinocidin的共有抗菌机制。
4 结论
1)鳜IL-8具有阳离子性的理化性质和两亲性的结构特点，表明其具有直接抗菌相关的结构基础。
2)鳜IL-8对模式菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)及鱼类致病菌(嗜水气单胞菌、中间气单胞菌、无乳链球菌)均表现出明显的直接抗菌功能。
3)鳜IL-8能够引发菌膜通透性提升及菌膜去极化，表明其可通过破坏菌膜而抗菌。
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