鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus，AngHV)是感染鳗鲡并引起鳗鲡病毒性疾病脱黏败血综合征的高致病性病原[1-2]，最早于1990年从养殖的日本鳗鲡(Anguilla japonica)中分离鉴定[3]，在全球各个国家和地区均有发现[4-7]。自20世纪90年代中国开展鳗鲡规模化养殖以来，该病就在鳗鲡养殖场中常年发生，具有发病率高、传染性强和死亡率高等特点[8-9]，给养殖者造成了巨大的经济损失[10-11]。同时，AngHV在鳗鲡体内存在潜伏感染，使部分病鱼难于从体表症状判断其患病情况[12-13]，因此，建立快速有效、简便灵敏的AngHV检测方法，对于AngHV的早期诊断和防控具有极其重要的意义。
AngHV是一种具有囊膜的线性双链DNA病毒[14]，隶属于疱疹病毒目(Herpesvirales)异疱疹病毒科(Alloherpesviridae)鲤疱疹病毒属(Cyprinivirus)[15]，可感染日本鳗鲡、欧洲鳗鲡(A.anguilla)和美洲鳗鲡(A.rostrata)等养殖鳗鲡品种[16]。目前，对AngHV的检测主要依赖于实时荧光聚合酶链式反应(qPCR)[17]、 PCR[18]等常规分子生物学检测方法，但上述方法对检测人员和设备要求较高，且程序烦琐、耗时较长，限制了其在基层的推广应用。重组酶辅助扩增 (recombinase-aided amplification，RAA) 是一种利用重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶等在等温条件下进行核酸扩增的技术。该技术的主要原理是重组酶与引物形成复合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，在等温条件下，15～30 min内完成目的DNA的快速扩增[19-20]。该技术具有反应快速、灵敏度高、特异性强及对仪器依赖程度低等优点，特别适用于基层和现场即时检测使用。
前期研究表明，ORF95基因编码AngHV病毒粒子的囊膜结构蛋白[21]，序列保守且基因丰度较高[22]，适合作为病毒检测的靶位点。本研究中，基于ORF95基因保守区序列设计特异性引物和探针，以鳗鲡疱疹病毒DNA为模板，建立了鳗鲡疱疹病毒实时荧光RAA检测方法，并评价其灵敏度、特异性和重复性及应用效果，以期为精准防控AngHV提供技术支持。
鳗鲡疱疹病毒、美洲鳗鲡腺瘤病毒 (American eel adomavirus，AEAdoV)、蛙虹彩病毒 (Rana grylio virus，RGV)、鲤疱疹病毒 (Koi herpesvirus，KHV)及对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV) 基因组DNA均由福建省农科院生物技术研究所保存。疑似感染鳗鲡疱疹病毒的鳗鲡组织样品由本课题组于2022—2023年在福建省各鳗鲡养殖场采集并保存。
主要试剂：2×Taq master Mix(Dye Plus)、DNA Marker和pCE2-TA/Blunt载体购自诺唯赞(南京)生物科技股份有限公司；病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒和血液/细胞/组织DNA提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；RAA核酸扩增试剂(基础型和荧光型)购自众测(杭州)生物科技股份有限公司。引物合成和测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2.1 引物及探针的设计 根据AngHV的ORF95序列，利用Lasergene 7.1生物学软件，按照RAA引物设计原则设计引物，同时设计ORF95的PCR引物，序列和目的片段长度见表1，引物和探针浓度均稀释至10 μmol/L使用。将AngHV接种于EO细胞系中，待细胞产生典型病变后，收集细胞，离心取上清液，用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取总DNA。以提取的病毒DNA为模板，利用RAA核酸扩增试剂盒(基础性)对候选引物进行RAA扩增，确定获得单一扩增条带后，将其作为实时荧光RAA的候选引物，并根据引物设计相应的检测探针(表1)。
表1 实时荧光RAA和 PCR扩增的引物及探针
Tab.1 Primers and probes used for real-time fluorescence RAA and PCR amplification
引物primer 序列(5'-3')sequence(5'-3')用途functionAngHV RAAF:CTCATAGACTCCACATCTTCCGATCTCAT-CATCR:TAACACCTCTCAAACTACGACCACG-CAGAC实时荧光RAAAngHVRAA-ProbeACACCGCTGCAATTTTCTCCGACCACAA[FAM-dT]C[THF]C[BHQ-dT]GACAGACT-GAGATTGGT/C3-spacerORF95SF:CTCATAGACTCCACATCTPCRR:AACACCTCTCAAACTACG
1.2.2 实时荧光RAA方法的扩增条件优化 以提取的病毒DNA为模板，利用RAA核酸扩增试剂(荧光型)、引物及探针进行实时荧光RAA扩增。
扩增反应体系：荧光缓冲液25 μL，上、下游引物各2 μL，探针0.6 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 16.9 μL。将上述溶液与冻干酶粉混匀，最后加入激活剂(醋酸镁溶液)2.5 μL，分别在 37、39、42、45 ℃ 下反应 20 min，使用实时荧光定量 PCR仪检测荧光强度，每隔 30 s采集一次荧光信号，根据荧光信号强度确定最佳反应温度。同时，观察荧光信号的起峰和进入平台期时间，确定实时荧光RAA的反应时间。
1.2.3 实时荧光RAA方法的灵敏度检测 以提取的病毒DNA为模板，以设计的PCR引物ORF95S-F/ORF95S-R(表1)进行PCR扩增。将PCR扩增获得的单一片段产物进行胶回收，参考试剂盒说明书，与含有pCE2-TA/Blunt载体的反应缓冲液在室温下进行连接反应5 min，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用质粒小量抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取质粒，经PCR鉴定后，对阳性克隆测序[生工生物工程(上海)股份有限公司]验证，获得质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S；用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，用DNA/RNA Copy Number Calculator (http：//www.endmemo.com/bio/dnacopynum. php) 计算每μL提取DNA样品中质粒的拷贝数，并作为标准品，置于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。
以梯度稀释的阳性质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S为模板，利用RAA核酸扩增试剂(荧光型)与筛选后的引物及探针进行实时荧光RAA检测，分析所能检测的最低鳗鲡疱疹病毒浓度。
1.2.4 实时荧光RAA方法的特异性检测 将保存的AngHV、AEAdoV、RGV和KHV菌株分别接种于细胞中，待多数细胞发生典型细胞病变后，收集细胞，提取病毒DNA，以此DNA为模板，以上述质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S为阳性对照，ddH2O为阴性对照，用建立的实时荧光RAA方法进行检测，评价检测方法的特异性。
1.2.5 实时荧光RAA检测方法的重复性检测 分别取浓度为1×104、1×105、1×106 copies/μL的阳性标准品重组质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S作为模板进行实时荧光RAA检测，每个浓度设置3个重复，根据阈值循环数 (cycle threshold value，CT) 的变异系数分析实时荧光RAA的组内重复性；重复试验3次，分析其组间重复性。
1.2.6 实时荧光RAA检测方法的应用 取本实验室采集并保存的疑似鳗鲡脱黏败血综合征病料组织样品25份，提取其总DNA，以DNA为模板，用建立的实时荧光定量qPCR检测方法确认AngHV的感染情况[17]，用建立的实时荧光RAA和普通PCR方法进行检测，比较各组织样品鳗鲡疱疹病毒的检出情况，计算阳性样品检出率。
利用设计的引物对AngHV RAA-F/R，从AngHV基因组中扩增出约240 bp的单一条带(图1(a))，经测序验证，确定其为目标序列，以此设计相应探针(表1，图1(b))，用于后续构建实时荧光RAA检测方法。
M—DL600 DNA marker；N—阴性对照；1—目的片段。
M—DL600 DNA marker；N—negative control；1—target fragment.
图1 AngHV的RAA靶序列扩增
Fig.1 Amplification of target sequence of RAA in AngHV
利用引物对AngHV RAA-F/R和探针AngHV RAA-Probe，在不同温度下进行实时荧光RAA检测。结果显示，在39 ℃条件下，实时荧光RAA反应可获得最高荧光吸收值；在所有温度条件下，从第 10个循环(5 min)开始出现稳定阳性信号；在39、42 ℃条件下，从第30个循环(15 min)进入荧光信号采集平台期(图2)。为确保反应充分，后续试验以39 ℃作为最优反应温度，以40个循环(20 min)作为最优反应时间。
图2 不同温度条件下AngHV的实时荧光RAA Fig.2 Real-time fluorescence RAA in AngHV under different temperature conditions
以10 倍倍比稀释的pCE2-TA/Blunt-ORF95S为模板进行实时荧光RAA 检测。结果显示：1×107～1×105 copies/μL的病毒，从第 10个循环开始出现稳定阳性信号；1×104～1×102 copies/μL的病毒，从第20个循环开始出现始稳定阳性信号；而1×101 copies/μL的病毒及阴性对照，在40个循环内均无明显的扩增信号(图3)。因此，实时荧光RAA方法的最低AngHV检测量为1×102 copies/μL。
1～7依次为1×107～1×101copies/μL的重组质粒；N—阴性对照(以ddH2O为模板)。
1-7 represent recombinant plasmids ranging from 1×107-1×101 copies/μL；N—represents negative control (ddH2O as template).
图3 AngHV实时荧光RAA方法的灵敏度检测
Fig.3 Sensitivity of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV
利用常见的水产动物病毒株进行特异性检测，结果显示，仅AngHV和阳性质粒pCE2-TA/Blunt-ORF95S出现扩增曲线，而AEAdoV、RGV、 KHV、WSSV和阴性对照均未出现扩增曲线(图4)。这表明，该实时荧光RAA检测方法对AngHV具有较好的特异性，且与AEAdoV、RGV、 KHV和WSSV等无交叉反应。
1—AngHV；2—pCE2-TA/Blunt-ORF95S；3—AEAdoV；4—RGV；5—KHV；6—WSSV；N—阴性对照(以ddH2O为模板)。
1—AngHV；2—pCE2-TA/Blunt-ORF95S；3—AEAdoV；4—RGV；5—KHV；6—WSSV；N—negative control (ddH2O as template).
图4 AngHV实时荧光RAA方法的特异性检测
Fig.4 Specificity of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV
用1×106、1×105、1×104 copies/μL 3个浓度的阳性标准品分别进行实时荧光RAA的重复性检测。结果显示：3个浓度样品的组内变异系数均小于5%，分别为1.7%、3.4%、4.4%；组间变异系数同样小于5%，分别为1.4%、2.9%和4.8%(表2)。这表明，该检测方法重复性好，可保证检测结果的稳定性和可靠性。
表2 AngHV实时荧光RAA检测的重复性
Tab.2 Repeatability of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV
质粒浓度/(copies·μL-1)plasmid concentration组内变异系数 coefficient of variation in the groups组间变异系数coefficient of variation among the groups组内CT值CT value in the group变异系数/%coefficient of variation组间CT值CT value among the groups变异系数/%coefficient of variation1×1065.82±0.101.75.76±0.0811.41×1057.50±0.253.47.73±0.2302.91×1048.81±0.394.48.48±0.4104.8
利用前期建立的qPCR方法对收集的25个鳗鲡脱黏败血综合征病料样品进行检测，共检出AngHV阳性样品23个，阴性样品2个。
进一步用实时荧光RAA和普通PCR方法对样品进行检测，结果显示，实时荧光RAA的检测结果与qPCR的检测结果一致，阳性检出数均为23个，而普通PCR的阳性检出数为19个，普通PCR的阳性检出率(76%)明显低于实时荧光RAA的检出率(92%)(表3)。
表3 AngHV实时荧光RAA的应用
Tab.3 Application of real-time fluorescence RAA assay for detection of AngHV
方法method 阳性样品检出数量detection number of the positive阳性检出率/%detection rate of the positive实时荧光RAA2392qPCR2392PCR1976
由AngHV感染所引起的脱黏败血综合征是鳗鲡黑仔和幼鳗阶段发生率最高、危害严重的传染性疾病[8，10]，病鳗常出现皮肤脱黏、红头、烂鳃和败血等症状，严重威胁着鳗鲡养殖业的发展[11]。AngHV的一个重要特征是可形成潜伏感染，此时病毒在鱼体中的载量较低，并不会引起典型的临床症状[5，12]。因此，对AngHV进行快速、灵敏和准确的检测，尽快采取积极的防控措施，是降低AngHV感染的关键环节，也是避免引入潜伏感染苗种的重要保障。
目前，AngHV核酸分子检测技术主要依赖于PCR和qPCR[17-18]，但上述方法对设备和操作有较高的要求，且耗时较长。RAA作为一种新型的核酸扩增技术，与PCR技术相比，可在35～45 ℃的恒温条件下进行扩增，一般在30 min内即可获得结果，且不需要昂贵的变温热循环仪，操作相对简单[19-20]。因此，RAA技术在食品安全[23]、病原微生物检测 [24]等方面均具有广泛的应用潜力。在水生动物的疫病检测方面，Kanitchinda等[25]将该技术应用在虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei)的检测上，Wang等[26]建立了针对草鱼呼肠孤病毒 (grass carpreo virus，GCRV)的实时荧光RAA检测方法，杨惠源等[27]建立了鰤诺卡氏菌(Nocardia seriolae)的RAA检测方法。上述工作为在AngHV上实现实时荧光RAA的检测提供了可靠的参考依据。
靶序列选择是影响实时荧光RAA检测效率和特异性的主要决定因素。前期研究表明，AngHV病毒粒子由核衣壳、间质层和囊膜组成[22]，囊膜蛋白与病毒入侵宿主细胞等密切相关[28]。在编码病毒囊膜蛋白的基因中，ORF95基因丰度相对较高[22]，且在不同AngHV毒株间的序列保守性较强[29]，因此，本研究中设计的引物和探针，以ORF95基因的保守区序列为模板。在对检测方法的优化中，本研究中确认了AngHV实时荧光RAA反应的最佳温度为39 ℃，且5 min左右即开始出现稳定荧光信号，15 min可到达荧光信号采集平台期。这表明，AngHV的实时荧光RAA检测方法所需时间较短。需要注意的是，由于反应速率快，在充分混匀各组分后，应尽快置入仪器采集荧光信号，避免错过起峰时间而直接进入荧光信号采集平台期，从而造成结果误判[30]。
灵敏度是影响病毒早期诊断结果的一个重要因素。病毒性疾病一般在暴发之前，存在一个低水平感染的积累期。高灵敏的方法可以更早地检测到病毒感染，以便尽早地进行预警。本研究中建立的AngHV实时荧光RAA检测方法最低可以检测到1×102 copies/μL病毒，其灵敏度为普通PCR的100倍，因此，可在较低感染水平上检测出AngHV。同时，实时荧光RAA对AngHV具有良好的特异性，对几种常见的水生动物DNA病毒无交叉反应。该检测方法的重复性较佳，组间和组内变异系数均小于5%。上述结果表明，实时荧光RAA检测方法具有较高的可靠性。而在临床样品的应用检测中，实时荧光RAA的阳性检出率(92%)远高于普通 PCR的检出率(76%)。加上实时荧光RAA在操作性能方面具有的优势，如反应体系所需的酶均以冻干粉形式保存，方便运输；反应不需要精确的热循环，只需要有限的设备支持，如便携式迷你离心机、水/金属浴和小型荧光采集仪等，因此，该检测方法更加适合基层或简易实验室对AngHV的快速检测。
1)本研究中根据AngHV的ORF95基因序列，通过引物设计、反应温度优化及反应时间确定，建立了AngHV的实时荧光RAA检测方法，该方法的阳性检出率远高于普通 PCR，与实时荧光PCR的检出率相当。
2)实时荧光RAA检测方法最佳反应温度为39 ℃，可在20 min内得到检测结果，对AngHV的最低检测量为1×102 copies/μL，且特异性强、重复性好，对于临床样品的检出率高，可用于AngHV的临床快速检测。
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