两种壳色中华绒螯蟹成蟹的相关种质性状分析

中华绒螯蟹(Eroicheir sinensis)，俗称“河蟹”，是中国特有的水产经济动物和深受消费者喜爱的高档水产品，因其“青背、白肚、金爪、黄毛”的标志性特征而被产业界和消费者所熟知。近年来，中华绒螯蟹的一些壳色突变体，如红壳蟹(红色头胸甲)和白壳蟹(白色头胸甲)不断出现，并已开始了人工选育和养殖。当前，不同壳色蟹的表型与遗传学特性已越来越受到研究者和养殖者关注。司永国等[1]研究发现，红壳蟹在稻田围隔养殖的成活率和室内单体养殖的生长率显著低于正常壳色蟹，而室内群体养殖的存活率和生长率无显著性差异，但红壳蟹不喜移动，易受天敌侵袭。左炳楠等[2]研究表明，红壳仔蟹的存活率高于正常壳色仔蟹，而体质量和头胸甲的特定增重率低于正常壳色仔蟹，但无显著性差异(P>0.05)，且绿光和黄光分别有利于红壳蟹和正常壳色仔蟹的生长；同时，红壳蟹的遗传多样性也低于正常壳色蟹。在白壳蟹方面：邓燕飞等[3]在构建的2个白壳蟹全同胞家系中，发现子代的白壳蟹比例仅为1.70%～3.03%；张冬冬等[4-5]报道指出，白壳蟹与正常壳色蟹具有相似的繁殖性能和胚胎质量，白壳和正常壳色蟹的蟹壳色泽和类胡萝卜素含量存在显著差异，而可食率与可食组织的常规生化成分、主要类胡萝卜素含量、脂肪酸组成和氨基酸含量接近。

类胡萝素在甲壳动物中通过与蛋白质结合形成色素蛋白复合物，从而使机体呈现多种颜色。甲壳类的壳色，与鱼类的体色一样，是重要的表型性状，具有多种生物学功能，与生长发育、生存及繁殖等生物学特性密切相关，如有的鱼类的体色与生长性状存在关联[6-8]。由于类胡萝卜素具有抗氧化功能，基于类胡萝卜素沉积而增强的着色也意味着更好的健康状况，因此着色较少的个体可能具有较大的生存压力。有研究表明，一些对虾通过改变身体颜色强度来更好地适应周围环境，从而保护自己免受捕食者的攻击，而另一些对虾则利用透明的身体结合复杂的颜色来掩盖身体轮廓，以躲避捕食者的追踪[9]。同时，相关研究也表明L*、a*和b*色泽参数值是评价水生动物色泽的重要指标，其大小与组织中的类胡萝卜素含量密切相关[10]。

红壳蟹和白壳蟹的出现时间较短，对其研究才刚开始，国内至今公开的文献尚较少。因而，红壳蟹与白壳蟹的种质特性与生产应用潜力尚待研究和评估。此外，从相关报道看，红壳蟹出现在辽河水系，白壳蟹出现在长江水系，其壳色产生是否存在地理因素尚不得而知。

本研究中通过同池饲养比较探讨了白壳蟹与青壳蟹在成蟹阶段的养殖性能、外部形态、色泽参数和类胡萝卜素含量、消化酶活性等方面的差异，以期了解白壳蟹的种质特点和产生白壳的内在原因，为中华绒螯蟹的种质资源利用和保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用样本均来自上海海洋大学水产动物种质试验站同一池塘中饲养的性成熟中华绒螯蟹。2022年3月，取健康活泼，规格一致的正常青壳(简称“G”，平均体质量为17.9 g±2.3 g)和变异白壳(简称“W”，平均体质量为17.5 g±1.9 g)的中华绒螯蟹蟹种各170只，混养于面积为1 200 m2的鲢鳙试验鱼养殖池塘中，池内种植覆盖率约40%的伊乐藻，饲养管理与基地内的其他河蟹养殖池塘相同。同年10月底，起捕池中所有试验蟹统计成活率后，随机取样用于后续试验分析。

1.2 方法

1.2.1 生长指标和外部形态特征的测定取青壳蟹和白壳蟹各30只，擦拭表面水分进行称重(精确到0.1 g)后，参照李晨虹等[11]发表的资料(图1)，应用游标卡尺(精确到0.01 mm)进行32个形态性状参数测量。然后，解剖试验蟹，取出肝胰腺和性腺分别称重。相关生长指标计算公式为

体质量变异系数

在进行形态性状分析时，为消除个体大小对数据分析的影响，首先将每只试验蟹的形态数据分别除以各自的背甲长(L1)，以矫正为比例性状参数。然后对校正后的31个比例参数分别进行独立样本t检验、主成分分析和聚类分析。

1.2.2 色泽和类胡萝卜素含量测定色泽测定：取“1.2.1节”中的试验蟹擦干水分，应用Lovibond-RT200手持式色差仪(Salisbury，England)在D56光源下，分别测定其头胸甲、腹甲、螯足、步足表面的色泽参数L*、a*和b*。其中，L*代表亮度，其值越大，颜色越白，反之越黑；a*代表红绿色度，正值为红色方向，负值为绿色方向；b*代表黄蓝色度，正值为黄色方向，负值为蓝色方向[12]。

总类胡萝卜素含量测定：随机选取青壳蟹与白壳蟹各6只，自来水冲洗后用干净的毛巾擦净，取头胸甲、血淋巴和肝胰腺等组织，用液氮速冻后，保存于-80 ℃冰箱。色素提取参考王小龙[13]、李巧玲等[14]和Bone等[15]的方法并进行适当改动。即称取上述组织样品0.3 g于离心管中，加入二氯甲烷∶甲醇的浸提混合液(容积比75∶25)10 mL，超声提取20 min，然后以8 000 r/min高速冷冻离心5 min，取上清液。如此重复提取至无色，合并提取液浓缩后定容，用分光光度计测量 478 nm处吸光值。最后，根据标准曲线计算各组织样品中的总类胡萝卜素含量。

类胡萝卜素组成测定：采用Agilent公司的SHISEIDO C30柱(4.6 mm×250 mm，直径=5 μm)测定头胸甲、血淋巴、肝胰腺和肠道提取液中主要类胡萝卜素的组成。方法是将提取液过0.45 μm微孔滤膜后上机检测，流速为1.0 mL/min，检测波长为450 nm，柱温为30 ℃。样品中类胡萝卜素的种类鉴定依据虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和 β-胡萝卜素5种商业标准品出峰时间，相关组成的含量根据5种标准品制备的标准曲线和样品出峰面积计算。

1.2.3 消化酶活性的测定挑选规格整齐健康活泼的青壳蟹与白壳蟹各6只，在无菌条件下，迅速取出肝胰腺和中肠组织于1.5 mL离心管中，随即置于液氮中速冻5 min，然后置于-80 ℃冰箱中保存。测定时，将组织解冻，取0.1 g置于离心管中，加9倍体积PBS缓冲液，冰水浴条件下机械匀浆，以2 500 r/min离心10min，取上清液，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定肝胰腺和肠道中的总蛋白含量(TP)，以及胰蛋白酶(TRY)、脂肪酶(LPS)和淀粉酶(AMS)活性。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，利用SPSS 22.0软件进行独立样本t检验，分析两种壳色蟹各种指标的差异显著性，显著性水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 白壳蟹与青壳蟹的生长指标和外部形态特征比较

经7个月成蟹阶段的同池饲养比较，白壳蟹的成活率为40.59%，远低于青壳蟹的67.55%。白壳蟹的平均体质量及其变异系数均低于青壳蟹，但无显著性差异(P>0.05)。白壳蟹的肥满度和肝胰腺指数略高于青壳蟹，性腺指数略低于青壳蟹，但也均无显著性差异(P>0.05)(表1)。

同时对31个形态性状比例参数(与头胸甲长之比)在白壳蟹与青壳蟹间分别进行t检验，发现A4、A6、L3、L5、C2、A2、S2、S3、B4和C1共10个性状存在显著性差异(P<0.05)，其余性状无显著性差异(P>0.05)(表2)。进而，对31个形态性状比例参数进行主成分分析发现，前5个主成分的贡献率分别为22.09%、15.37%、9.46%、6.61%和5.06%，累计贡献率为58.59%。以前两个贡献率最大的主成分绘制的散点图可见，白壳蟹和青壳蟹存在较大的性状重叠区域，说明两者的形态差异不明显(图2(a))。最后，对全部个体进行聚类分析，发现两种壳色蟹共可分为4个聚类，除聚类Ⅲ由10个白壳蟹个体组成外，其他3个聚类均为两种壳色蟹个体相互交织地聚类在一起(图2(b))。

2.2 色泽和类胡萝卜素含量比较

白壳蟹头胸甲的3个色泽参数(L*、a*和b*)均显著高于青壳蟹(P<0.05)，且白壳蟹右螯足的L*和b*，以及右第二步足L*也均显著高于青壳蟹(P<0.05)；青壳蟹的腹甲L*显著高于白壳蟹(表3)。

白壳蟹头胸甲的总类胡萝卜素含量为7.83 mg/kg，显著低于青壳蟹的35.30 mg/kg(P<0.05)。同样，白壳蟹中血淋巴和肝胰腺的总类胡萝卜素含量也显著低于青壳蟹(P<0.05)。白壳蟹无内容物的肠道组织中总类胡萝卜素含量与青壳蟹相比无显著性差异，但有内容物的肠道组织中其总类胡萝卜素含量显著高于青壳蟹(P<0.05)(表4)。进一步分析发现，两种壳色蟹的血淋巴及白壳蟹的头胸甲中未检测出虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和β-胡萝卜素等组成物，而青壳蟹的头胸甲中虾青素和角黄素较高。在肝胰腺组织中，白壳蟹的β-胡萝卜素和玉米黄素显著低于青壳蟹(P<0.05)，且叶黄素和角黄素组分未检测到。在有内容物的肠道中，白壳蟹中均检测到虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和β-胡萝卜素等组成物，且β-胡萝卜素、玉米黄素和叶黄素显著高于青壳蟹(P<0.05)(表5)。

2.3 消化酶活性比较

试验过程中对白壳蟹和青壳蟹的总蛋白含量进行了测量。其中，白壳蟹肝胰腺和肠道组织的总蛋白含量分别为11.94 U/mg和11.45 U/mg，青壳蟹的总蛋白含量分别为11.02 U/mg和11.25 U/mg，两者不存在显著性差异(P>0.05)。在肝胰腺和肠道组织中，两种壳色蟹胰蛋白酶活性均在20 000 U/mg prot以上，淀粉酶活性在1 U/mg prot以下，但不存在显著性差异(P>0.05)；白壳蟹脂肪酶活性均在 1 U/g prot以上，有高于青壳蟹的趋势，但不存在显著性差异(P>0.05)(表6)。

3 讨论

3.1 两种壳色中华绒螯蟹生长差异的比较

水产动物的成活率、肝胰腺指数、性腺指数、肥满度等是反映其生长状况的重要指标[16]。同时在鱼类中研究发现，与正常体色相比，白化个体更容易在原生环境中被捕食者发现，会表现出更差生殖力和更低的环境抗压能力[17]。如应激时白化鲶比正常体色鲶的瞳孔更小且体内产生更多的皮质醇激素[18]，同时研究发现，在实验室条件下，随着时间的推移白化鲶会被熟悉的同种有色鲶排斥[19]。本研究中，在同池混养条件下，白壳蟹的平均体质量略低于青壳蟹，但成活率比青壳蟹低26.86%，可能原因是白壳蟹体色特殊，蜕壳期间更容易受到天敌的捕食，导致数量减少，亦或是白壳蟹对环境的适应性较差，造成成活率下降。通常来说，体色突变体动物对环境的适应能力较正常个体差，白壳蟹的存活率远低于青壳蟹可能主要与体色突变有关。白壳蟹与青壳蟹在平均体质量及其变异系数、肥满度、肝胰腺指数和性腺指数等生长性能指标上均无显著性差异，同时相关消化酶活性也无显著性差异，表明两者在生长和消化生理等方面无明显差别，白壳蟹与青壳蟹一样能正常生长和成熟。然而，白壳蟹的产业应用前景和消费者的接受度尚需后续观察。

本研究中发现，白壳蟹和青壳蟹的31个形态比例性状参数中只有10个参数存在显著性差异，其他比例性状无显著性差异。主成分分析和聚类分析也一致表明，白壳蟹与青壳蟹不存在明显的形态差异。形态性状作为重要的表型性状，受遗传因素与环境因素的共同作用[20]。本研究中，两种壳色蟹饲养于同一池塘中，受共同的环境条件影响，而遗传因子的影响主要表现在壳色上。同时，白壳蟹作为一种壳色突变产物，出现时间较短，遗传瓶颈和选择压力等因素尚未对形态变化造成显著影响。因而，两者间不存在显著的形态差异，这是比较容易理解的。

3.2 两种壳色中华绒螯蟹壳色差异的比较

壳色在甲壳类动物的交流、繁殖、体温调节和自我保护等生理方面起到了重要作用[9]，同时表型色素差异会直接影响其市场价格和观赏价值。研究表明，类胡萝卜素是色素形成的主要原因，同时类胡萝卜素具有抗氧化和免疫功能，能够明显提高鱼类的生长性能、繁殖性能、抗疾病能力及成活率[21]。研究表明，投喂适量的类胡萝卜素对凡纳滨对虾仔虾生长有一定促进作用且可提高其成活率[22]。甲壳类动物的不同组织色泽主要和虾青素含量有关[23]，叶黄素、角黄素和虾青素是红色类胡萝卜素，而玉米黄素和β-胡萝卜素是黄色类胡萝卜素，同时不同类胡萝卜素之间的强相关性可能被其他类胡萝卜素转化[24]。本研究中，白壳蟹头胸甲的色泽参数L*、a*和b*均显著高于青壳蟹，其中，L*值越大，颜色越白，表明白壳蟹与青壳蟹的主要区别是头胸甲的色泽上。色素含量分析发现，白壳蟹的头胸甲、血淋巴和肝胰腺等组织中的类胡萝卜素总量显著低于青壳蟹，表明造成白壳蟹的原因是体内类胡萝卜素缺乏。同时，白壳蟹无内容物的肠道组织中总类胡萝卜素含量与青壳蟹相比无显著性差异，但有内容物的肠道组织中其总类胡萝卜素含量显著高于青壳蟹(P<0.05)，表明白壳蟹肠道中有大量类胡萝卜素堆积而无法向其他组织转运。进一步分析类胡萝卜素的组成，发现白壳蟹头胸甲组织中的虾青素、叶黄素、玉米黄素、角黄素和β类胡萝卜素等组分未检测到，而在有内容物的肠道中均检测到上述5种组分，且白壳蟹肠道中的β-胡萝卜素、玉米黄素和叶黄素显著高于青壳蟹，进一步表明白壳蟹能正常摄取胡萝卜素等营养组分，但吸收和转运到身体其他组织的能力较弱，特别是头胸甲。此外，张冬冬等[5]发现，将白壳蟹蟹壳煮熟后仍为白色，进一步说明白壳蟹头胸甲中缺乏类胡萝卜素组成物。综上所述，头胸甲、血淋巴、肝胰腺、背甲内膜组织和肠道总类胡萝卜素含量显著低于青壳蟹，但其肠道内容物中总类胡萝卜素含量显著高于后者。研究表明，无法正常吸收且转运肠道中的类胡萝卜素可能是造成蟹白壳的原因之一，但类胡萝卜素无法吸收和转运的遗传基础与机制(如基因变异)尚需后续研究。

4 结论

1)白壳蟹与青壳蟹不存在显著的形态差异、生长差异和消化酶活性差异，且白壳蟹能和普通蟹一样正常生长和成熟，但成活率较低，这可能与体色突变体动物对环境的适应能力较差有关。

2)白壳蟹肠道中的类胡萝卜素等无法通过肠道组织吸收并转运到头胸甲，这可能是造成中华绒螯蟹白壳的主要原因，但其具体的遗传基础与机制尚需后续研究。

[1] 司永国,李晓东,姜玉声,等.红壳色中华绒螯蟹仔蟹养殖方式研究[J].大连海洋大学学报,2017,32(2):139-144.
SI Y G,LI X D,JIANG Y S,et al.Culture pattern of juvenile Chinese mitten handed crab Eriocheir sinensis with red color shell[J].Journal of Dalian Ocean University,2017,32(2):139-144.(in Chinese)

[2] 左炳楠.遮蔽物、饵料、光色对红壳色中华绒螯蟹仔蟹摄食、生长及体色的影响[D].大连:大连海洋大学,2018.
ZUO B N.Effects of shelter,feed and light color on the growth and body color of red color juvenile Chinese mitten crab Eriocheir sinensis[D].Dalian:Dalian Ocean University,2018.(in Chinese)

[3] 邓燕飞,许郑超,周军,等.中华绒螯蟹白壳蟹家系的构建及苗种培育[J].水产养殖,2022,43(5):15-17.
DENG Y F,XU Z C,ZHOU J,et al.Construction and directional culture of the white-shell families for Chinese mitten crab(Eriocheir sinensis)[J].Journal of Aquaculture,2022,43(5):15-17.(in Chinese)

[4] 张冬冬,范陈伟,姜晓东,等.中华绒螯蟹白壳和绿壳品系生殖性能、胚胎色泽和生化组成比较[J].南方水产科学,2022,18(3):102-110.
ZHANG D D,FAN C W,JIANG X D,et al.Comparison of reproductive performance,embryo color and biochemical composition of white and green carapace strains of Chinese mitten crab(Eriocheir sinensis)[J].South China Fisheries Science,2022,18(3):102-110.(in Chinese)

[5] 张冬冬,范陈伟,姜晓东,等.中华绒螯蟹白壳和绿壳品系成蟹可食率、类胡萝卜素含量和营养组成的比较[J].水产学报,2023,47(9):122-134.
ZHANG D D,FAN C W,JIANG X D,et al.Comparison of edible yield,carotenoid content and nutritional composition between the white carapace strain and green carapace strain of adult Eriochier sinensis[J].Journal of Fisheries of China,2023,47(9):122-134.(in Chinese)

[6] 陈红林,司周旋,杜金星,等.四种体色瓯江彩鲤形态性状与体质量的相关性与通径分析[J].渔业科学进展,2019,40(5):110-116.
CHEN H L,SI Z X,DU J X,et al.Correlation and path coefficient analysis of the morphometric traits and body weight for the four color patterns of Oujiang color common carp[J].Progress in Fishery Sciences,2019,40(5):110-116.(in Chinese)

[7] 钱永生,陈红林,杜金星,等.4种体色瓯江彩鲤的生长、摄食和呼吸特性差异及其相关性分析[J].中国水产科学,2019,26(4):695-702.
QIAN Y S,CHEN H L,DU J X,et al.Comparison of growth,feeding and respiration characteristics and their correlation among four color patterns in Oujiang color carp[J].Journal of Fishery Sciences of China,2019,26(4):695-702.(in Chinese)

[8] 朱丽艳,马玉清,项松平,等.不同体色瓯江彩鲤生长动态的观察与分析[J].上海海洋大学学报,2013,22(3):341-348.
ZHU L Y,MA Y Q,XIANG S P,et al.Observation and analysis of growth dynamics in Oujiang color common carp with different pigmentation types[J].Journal of Shanghai Ocean University,2013,22(3):341-348.(in Chinese)

[9] ERTL N G,ELIZUR A,BROOKS P,et al.Molecular characterisation of colour formation in the prawn Fenneropenaeus merguiensis[J].PLoS One,2013,8(2):e56920.

[10] SMITH B E,HARDY R W,TORRISSEN O J.Synthetic astaxanthin deposition in pan-size coho salmon (Oncorhynchus kisutch)[J].Aquaculture,1992,104(1/2):105-119.

[11] 李晨虹,李思发.中国大陆沿海六水系绒螯蟹(中华绒螯蟹和日本绒螯蟹)群体亲缘关系:形态判别分析[J].水产学报,1999,23(4):337-342.
LI C H,LI S F.Phylogenesis of populations of mitten crabs (Eriocheir sinensis,Eriocheir japonicus) in six river systems of China’s mainland:morphology discriminant analysis[J].Journal of Fisheries of China,1999,23(4):337-342.(in Chinese)

[12] 贺钧彬,王灵昭,钱亮亮,等.条斑紫菜颜色变化的影响因素研究[J].食品研究与开发,2021,42(23):81-85.
HE J B,WANG L Z,QIAN L L,et al.Factors affecting color change of Porphyra yezoensis[J].Food Research and Development,2021,42(23):81-85.(in Chinese)

[13] 王小龙.辣椒叶片中不同类胡萝卜素组分分离及含量测定方法研究[D].兰州:甘肃农业大学,2015.
WANG X L.Development of a separation and identification methods for carotenoids pepper leaves[D].Lanzhou:Gansu Agricultural University,2015.(in Chinese)

[14] 李巧玲,刘景艳.紫外-可见分光光度法在食品分析中的应用[J].中国食品添加剂,2005(5):113-116.
LI Q L,LIU J Y.Application of UV-vis spectrophotometry in food analysis[J].China Food Additives,2005(5):113-116.(in Chinese)

[15] BONE R A,LANDRUM J T,FERNANDEZ L,et al.Analysis of the macular pigment by HPLC:retinal distribution and age study[J].Investigative Ophthalmology &Visual Science,1988,29(6):843-849.

[16] 宋黎黎,高建操,邵乃麟,等.越冬暂养对雌性中华绒螯蟹的营养品质及风味的影响[J].上海海洋大学学报,2021,30(5):800-811.
SONG L L,GAO J C,SHAO N L,et al.Effects of overwintering cultivation on nutritional quality and flavor of female Eriocheir sinensis[J].Journal of Shanghai Ocean University,2021,30(5):800-811.(in Chinese)

[17]

K,SLAV

K O,HORKY P.Pigmentation potentially influences fish welfare in aquaculture[J].Applied Animal Behaviour Science,2023,262:105903.

[18] SLAV

K O,HORKY P,VEL width=3,height=10,dpi=110

EK J,et al.Pupil size variation as a response to stress in European catfish and its application for social stress detection in albino conspecifics[J].PLoS One,2020,15(12):e0244017.

[19] SLAV

K O,HORKY P,MACIAK M.Ostracism of an albino individual by a group of pigmented catfish[J].PLoS One,2015,10(5):e0128279.

[20] 何杰,吴旭干,龙晓文,等.长江水系中华绒螯蟹野生和养殖群体选育子一代养殖性能和性腺发育的比较[J].海洋与湖沼,2015,46(4):808-818.
HE J,WU X G,LONG X W,et al.Culture performance and gonadal development of the first generation of selectively-bred Chinese mitten crabs from wild and cultured populations[J].Oceanologia et Limnologia Sinica,2015,46(4):808-818.(in Chinese)

[21] BROWN A C,LEONARD H M,MCGRAW K J,et al.Maternal effects of carotenoid supplementation in an ornamented cichlid fish[J].Functional Ecology,2014,28(3):612-620.

[22] 刘辉.虾青素强化褶皱臂尾轮虫投喂凡纳滨对虾仔虾效果的研究[D].大连:大连海洋大学,2022.
LIU H.Effects of feeding rotifers (Brachionus plicatilis) enriched with astaxanthin on post larvae of Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[D].Dalian:Dalian Ocean University,2022.(in Chinese)

[23] 李清清.中华绒螯蟹色泽遗传参数评估及色泽形成机制研究[D].上海:上海海洋大学,2019.
LI Q Q.Estimates of genetic parameters for colour traits and colour formation mechanism in Eriocheir sinensis[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2019.(in Chinese)

[24] WADE N M,GABAUDAN J,GLENCROSS B D.A review of carotenoid utilisation and function in crustacean aquaculture[J].Reviews in Aquaculture,2017,9(2):141-156.