低眼巨鲶(Pangasianodon hypophthalmus)隶属于鲶形目(Siluriformes)鱼芒鲶科(Pangasiidae)鱼芒鲶属(Pangasianodon)，俗称“巴沙鱼”(Basa )，20世纪90年代引进到中国[1]，是中国华南地区常见养殖鱼类。低眼巨鲶生长性能优越，蛋白质含量高，常被用作酸菜鱼、冷冻鱼片和预制菜的原材料[2]。低眼巨鲶富含维生素D，也适用于鱼油营养产品的制作[3]。此外，低眼巨鲶也是一种优良的鱼油提取源，具有良好的热氧化稳定性，可作为普通棕榈油的有效替代品[4]。近年来，因其在水产养殖、健康营养品和食品加工等方面的显著经济价值，中国对低眼巨鲶需求日益增长，目前进口量已超过30万t，位列全球之首[5]。以低眼巨鲶为代表的巴沙鱼产业在中国不断壮大，已经形成了个性化产业链[6]。

然而，中国低眼巨鲶养殖业仍处于初级阶段，目前，尽管已经初步掌握了苗种培育技术[7-8]，并在海南等地进行了小规模的苗种生产和养殖，但尚未形成规模化发展局面。低眼巨鲶种鱼主要从越南引进，其苗种质量参差不齐，存在种质混乱的问题，这也成为制约低眼巨鲶养殖产业发展原因之一。因此，为解决当前低眼巨鲶市场上种质混乱的问题，需要对其养殖群体开展准确的资源评估，深入研究低眼巨鲶养殖群体的遗传背景，这对于提升中国低眼巨鲶种质资源保育和管理具有重要意义。

微卫星技术(simple sequence repeat，SSR)[9]常用于分析鱼类群体遗传多样性。微卫星等位基因间呈现共显性遗传，具有高度多态性、分布广泛且易于扩增的特点，在分子生物学领域中逐渐被广大研究者所关注。这一分子标记技术广泛应用于鱼[10]、虾[11]和蟹[12]等水生生物群体遗传多样性相关研究，是研究者深入了解各种生物群体遗传结构的强有力工具。从20世纪起，许多常见鱼类的相关研究中已经开始使用微卫星技术[13-15]，目前微卫星技术已广泛应用于鲶形目鱼类的群体遗传多样性研究[16-18]，为相关鱼类群体遗传多样性研究方面提供了丰富的参考数据。

本研究中选用东南地区4处低眼巨鲶养殖群体作为试验对象，通过10个微卫星分子标记对其进行遗传变异分析，研究了低眼巨鲶养殖群体的遗传多样性及遗传结构。旨在筛选出优质种质材料，理清其间亲缘关系，以期为探明低眼巨鲶养殖群体的遗传背景提供有益参考，也为低眼巨鲶养殖种质资源的保育提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验从百荣水产良种有限公司(广东省湛江市)、翔泰渔业股份有限公司(海南省文昌市)、佛山三水白金水产种苗有限公司 (广东省佛山市)和广东罗非鱼良种场(广东省广州市)4处低眼巨鲶养殖场采集商品鱼规格的低眼巨鲶，采集鱼鳍保存在无水乙醇中。最终有效样本113 尾，将4个区域分别标记为广东湛江YJ(n=30)、海南文昌HN (n=30)、 广东佛山GYQB (n=26)和广东广州GYZJ (n=27)(下同)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 利用MicroElute Genomic DNA Kit(Omega Biotek，Inc.Norcross，Georgia，USA)试剂盒提取样品DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度及完整性。通过 NanoQTM微型分光光度计检测DNA浓度。

1.2.2 微卫星引物设计及筛选 参考本实验室引物设计及筛选方法[19-20]，通过低眼巨鲶转录组数据得到SSR位点40 000多个，针对3、4核苷酸重复引物序列进行引物设计选取得到低眼巨鲶微卫星位点1 920 对SSR引物，并进一步筛选，从中得到96 对引物用于下一步筛选。引物采用接头法合成。

从每个群体中各选取8个样本，用引物扩增样本，反应在Veriti 384 PCR仪上进行。PCR反应体系为10 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，上下游引物混合物2 μL (10 μmol/L)，基因组DNA 1 μL (50～200 ng)，去离子水4.5 μL。PCR 扩增程序为96 ℃下预变性3 min，96 ℃下变性30 s，最适温度下退火30 s，72 ℃下延伸1 min，共进行30 个循环，最后在72 ℃下再延伸10 min，在12 ℃下保存。PCR反应结束后，扩增产物经荧光毛细管电泳检测。采用GeneMarkerV2.20软件对结果进行分析，得到10对PIC值在0.59以上，等位基因数大于3的引物用于群体分型。

1.2.3 PCR扩增与检测 在筛选出10 对引物后，对收集样本进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，对照DNA Marker 的浓度进行定量。利用DNA 测序仪ABI 3730xl 进行毛细管电泳检测。

1.3 数据处理析

利用GenAlEx 6.501软件[21]计算观测等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、香农指数(I)、多态性信息指数(PIC)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和近交系数(Fis)。利用GenAlEx version 6.501 软件计算各群体间和群体内的变异、分化并进行显著性检验；利用STRUCTURE软件对113份低眼巨鲶样品进行群体结构分析，设置K=1～20，Burn-in周期为10 000，MarkovChain Monte Carlo(MCMC)设为100 000，每个K值运行20次，并利用在线工具STRUCTURE HARVESTER[22] 算出最佳ΔK值(即为最佳群体分层情况)。根据最佳K值结果，利用DISTRUCT 软件将CLUMMP的结果进行可视化[23]。采用Wright[24]的公式计算遗传分化系数(Fst)和基因流(Nm)，基因流(Nm)∶Nm=0.25(1- Fst)/Fst。利用GenAIex软件进行主坐标分析(PCoA)[25]。利用powermarker软件计算各群体间的遗传距离。利用UPGMA方法进行聚类分析，并绘制环状聚类图。

2 结果与分析

2.1 微卫星引物筛选及遗传多样性分析

从备选引物库中得到96 对引物，一共筛选出10 对PIC值在0.59以上、等位基因数大于3的引物用于后续分析(表1)。10 对引物对113个样本进行扩增，共检测出等位基因74个(Na)，其中，最小等位基因数目为4，最大等位基因数目为13，平均每个位点等位基因数目为7.4。有效等位基因(Ne)总数为43.225，范围为2.247(Pab013)～8.557(Pab063)，平均每个位点有效等位基因数目为4.322。香农指数(I)为1.025(Pab013)～2.251(Pab063)，平均值为1.560。观测杂合度(Ho)为0.482(Pab013)～0.841(Pab040)，平均值为0.707。期望杂合度(He)为0.555(Pab013)～0.883(Pab063)，平均值为0.741。多态信息含量(PIC)为0.504(Pab013)～0.872(Pab063)，平均值为0.702(表2)。

用10对引物评估群体的近交系数和基因流，群体内近交系数(Fis)为-0.271(Pab040)～0.008(Pab063)。整体近交系数(Fit)为-0.176(Pab040)～0.207(Pab088)，平均值为0.040。遗传分化系数(Fst)为0.071(Pab073)～0.276(Pab088)，平均值为0.023。基因流(Nm)为0.655(Pab088)～3.261(Pab073)，平均值为0.305(表3)。

2.2 低眼巨鲶养殖群体遗传多样性分析

10个微卫星位点在广东佛山、广东广州、海南文昌、广东湛江4个养殖群体中等位基因数(Na)分别为6.3、5.5、3.9、4.3，均值为5.0；有效等位基因数(Ne)分别为3.790、3.716、2.675、2.922，均值为3.276 ；香农指数(I)分别为1.431、1.393、0.981、1.149，均值为1.239；平均观测杂合度(Ho)分别为0.742、0.778、0.613、0.706，均值为0.710；平均期望杂合度(He)分别为0.698、0.690、0.530、0.619，均值为0.634(表4)。

2.3 低眼巨鲶养殖群体间遗传结构分析

2.3.1 分子方差分析(AMOVA)和基因流估算 分子方差分析表明，16%的遗传变异存在于种群间，84%的遗传变异存在于个体，个体的变异是低眼巨鲶总变异的主要来源(表5)。低眼巨鲶4个养殖群体之间Fst值的范围为0.030～0.130，广州与佛山两个群体间的值最小，为 0.030，小于0.05，说明两处群体间遗传分化程度较小，湛江与海南文昌群体之间的Fst值最高达到0.196，大于0.05，说明两处群体间遗传分化程度较高，其余群体间Fst值均大于0.05，证明广州、佛山群体与湛江、海南文昌群体间均存在一定的遗传分化(表6)。

2.3.2 遗传距离与聚类分析 遗传距离计算结果显示，群体间遗传距离中，广东湛江和海南文昌群体间遗传距离最大，为0.476(HN/YJ)。广东广州和广东佛山群体间遗传距离最小，为0.117(GYQB/GYZJ)(表7)。

2.4 低眼巨鲶个体间遗传结构分析

利用10个分子标记对113份低眼巨鲶样本的结构进行评估。将113份低眼巨鲶样本划分为2个亚群(图1)，根据似然值最大原则，判断最佳K值等于2(图2)。

主坐标分析(PCoA)结果显示，广州群体(GYZJ)和佛山群体(GYQB)之间并无差异，且和湛江群体(YJ)相距较近。文昌群体(HN)相对其他3个群体遗传关系较远(图3)。个体样本的UPGMA聚类结果与主坐标结果大致相近，海南群体单独聚为一支，部分广州和佛山群体聚为一小支，另一部分广州和湛江群体聚为另一小支，3个广东群体聚为一大支(图4)。

3 讨论

3.1 微卫星标记多态性及特征分析

本研究中，得到的10对引物多态信息含量(PIC)的数值范围为0.504(Pab013)～ 0.872(Pab063)，且均高于0.5，根据Boststein的研究结果[26]，PIC>0.5为高度多态性，表明本研究中选择的微卫星位点可作为低眼巨鲶遗传多样性及遗传结构分析的良好评价工具。

本研究中，采用10对引物在4个低眼巨鲶养殖群体中共检测出74个等位基因。其中，最小等位基因数目为4，最大等位基因数目为13，平均每个位点等位基因数目为7.4。有效等位基因总数为43.225，数值变化范围为2.247(Pab013)～8.557(Pab063)。香农指数(I)的数值范围为1.025(Pab013)～2.251(Pab063)。根据香农指数结果，佛山养殖群体的遗传多样性最丰富，其次是广州、湛江、文昌。物种杂合度越高，遗传多样性越高[27]。本研究中，观测杂合度高于期望杂合度，这可能意味着这个群体中的基因座存在一定程度的失衡选择或者基因漂变等现象，导致观测杂合度的数值偏离了期望值。同时，与哈代-温伯格提出的标准(Ho<0.5)相比[28]，低眼巨鲶养殖群体多数大于0.5，表示低眼巨鲶养殖群体杂合度较高。

4个养殖群体中广州群体与佛山群体等位基因与杂合度明显高于其他两个群体且数值相近(表4)，表明这两个群体种质来源相近，保留了较高的遗传多样性水平，且具有一定的选育潜力。4个养殖群体的有效等位基因(Ne)均小于观测等位基因(Na)，这种现象也存在于罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[11]、大口黑鲈(Micropterus salmoides) [29]等物种中。出现这种现象主要是等位基因不均衡导致，有些等位基因可能非常普遍，而其他等位基因则相对稀少。有效等位基因数较低意味着少数几个等位基因可能在种群遗传结构中起着主导作用。这种不均匀程度依次为佛山>广州>湛江>文昌。4个群体测得的观测杂合度(Ho)均高于期望杂合度(He)，表明4个群体内部存在较高的遗传多样性，在鳜(Siniperca chuatsi)[30]、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)[31] 等物种中也存在相近现象。实际观测到的杂合度比所预测的数量要多，意味着个体之间存在较多的遗传差异，这可能是由于存在选择压力或基因流的影响。表明该4处养殖群体遗传多样性丰富，更具生长优势，有助于群体适应环境变化，提高抗病能力和生存率。

3.2 低眼巨鲶群体遗传多样性分析

遗传分化指数(Fst)是评价群体间遗传分化程度的重要指标。Fst值越大，说明群体间的遗传分化程度越高。4个养殖群体间的Fst值范围为0.030～0.196(表6)，这表明群体间存在不同程度的遗传分化。广州与佛山两个养殖群体遗传分化程度最低，该结果与实际情况相符，广州与佛山地理位置相对较近，因此可能出现较多的群体苗种交换，分化程度较低。而海南文昌与广东湛江之间遗传分化程度最高，海南省与广东省由于地域的限制，基因交流较少，因此呈现出较大的遗传分化。从基因流数据看，广州和佛山群体之间基因流程度最低，而湛江养殖群体与文昌养殖群体之间基因流程度最高，说明湛江养殖群体与文昌养殖群体间基因交流相对较少，分化程度较高。Wright[24]指出，当Nm大于1时，Nm>1表示遗传分化不显著。本研究中所有位点Nm均大于1，平均值为4.011，说明研究中的4个群体各个群体间基因交流频繁，遗传分化水平较低。 Fst值较大的群体，基因流数值均偏小，证明了研究结果的准确性。

遗传距离是衡量群体间遗传分化程度的重要指标[32]。4个群体间的遗传距离最大为0.476(海南文昌和广东湛江)，最小为0.117(广东佛山和广州)。UPGMA聚类分析结果将4个群体分为了两支，一支为海南文昌，另一支为广东的3个群体。其中，佛山和广州的养殖群体单独聚为一小支。通过主坐标分析(PCoA)对遗传距离进行可视化处理，发现佛山和广州群体之间并无明显的遗传差异，其坐标点在图上几乎完全重叠。这两个群体与湛江群体的距离也相对较近。然而，海南群体在遗传上与其他3个群体的距离较远，其坐标点在PCoA图的右侧单独分布。这说明低眼巨鲶的养殖群体间存在一定的遗传分化，并且在广东省内的3个养殖群体间，遗传关系较为紧密。此外，UPGMA聚类分析结果与PCoA分析大致一致，都将广东和海南的群体分为了两大支。但在广东群体的内部分类上，存在一些差异。主坐标分析结果表明，广州和佛山群体在遗传上较为相近，而UPGMA聚类将广州群体一部分与佛山群体聚为一支，另一部分则与湛江群体为同一支。本研究结果指出，尽管佛山和湛江群体在遗传多样性上存在一定差异，广州群体与这两个群体的具体遗传关系仍需进一步研究和确认。

AMOVA分析表明，4个养殖群体的遗传变异主要是由于个体差异，占总变异的84%，与陈会娟[33]和潘秋芝[34]研究结果一致。不同养殖群体间造成的差异较小，只有16%，说明4处养殖群体之间遗传分化水平较低。通过Structure分析得出4处养殖群体的最佳K值(K=2)，群体结构结果表明，113份样本可划分为两个聚类簇：一个是海南群体聚类簇，另一个聚类簇则包括广东省的广州、佛山和湛江群体。这与PCoA分析结果吻合。这种遗传差异可能是中国从越南或东南亚不同地方引种造成的，广东省的广州、佛山和湛江群体亲缘关系较近，可能引自同一区域。此外，气候可能也是造成这种差异的原因[35]。温度是影响鱼类生长的重要因素，不同温度可能会导致群体间的遗传分化。导致低眼巨鲶的4个群体被分两个亚群的原因可能是多种因素共同作用的结果，如遗传漂变、自然选择、环境因素、养殖方式和管理措施、基因交流等。这些因素相互作用，导致这些群体间产生了差异，从而被鉴别为两个亚群。

综上所述，4处低眼巨鲶养殖群体均存在高度的遗传多样性，种质资源良好，有一定的稳定性及选育潜力。海南群体与广东群体亲缘关系较远，广东省内广州与佛山群体亲缘关系最为密切，推测两地种苗来源可能较为接近。本研究对低眼巨鲶养殖群体遗传多样性的研究有助于更好地了解低眼巨鲶的遗传结构，从而为其保护和管理提供更好的科学依据。

4 结论

1)低眼巨鲶4个养殖群体平均观测杂合度(Ho)分别为0.742、0.778、0.613、0.706，均值为0.710，表明低眼巨鲶遗传多样性处于中高水平，在生产实践中具有进一步选育的潜力。

2) 根据遗传距离，4个养殖群体被分为两个遗传群体，海南群体单独聚为一支，其余3个群体聚为一支，4个群体间遗传距离最大为0.476(海南文昌/广东湛江)，最小为0.117(广东广州/广东佛山)。海南群体与其他3个群体亲缘关系较远，有一定的遗传分化，要注意种质保存，以维持低眼巨鲶养殖种质资源的丰度。

3)低眼巨鲶4个养殖群体均具有丰富的遗传多样性，种质资源良好，具有较高的选育潜力。通过选育广州和佛山群体，可以提升群体的生长优势和抗病能力，此外，加强海南群体的独立保护，可维持整体遗传多样性和资源稳定性。

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Analysis of microsatellite genetic diversity in cultured populations of Pangasianodon hypophthalmus

NI Wei，YU Lingyun，LI Wei，CHEN Haigang，ZHU Xinping，LIU Xiaoli*，LIU Yihui*

(Key Laboratory of Tropical &Subtropical Fishery Resource Application &Cultivation，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380，China)

Abstract：To clarify the genetic background of different cultured populations of Pangasianodon hypophthalmus, 10 microsatellite markers with high amplification efficiency and specificity were identified by genetic diversity analysis, and used to analyze the genetic diversity of four cultivation populations from Guangzhou, Zhanjiang, and Foshan (Guangdong province), and Wenchang (Hainan province ). The results showed that the 10 microsatellite loci exhibited high polymorphism, with an average polymorphic information content (PIC) of 0.702. The 10 primer pairs detected a total of 74 alleles (Na) within the cultivation populations. The observed heterozygosity (Ho) was found to be ranged from 0.482 (Pab013) to 0.841 (Pab040), and the expected heterozygosity (He) from 0.555 (Pab013) to 0.883 (Pab063). Based on genetic distances, the four cultured groups were divided into two genetic populations, Hainan group forming its own branch, and the other three populations clustering together, with the most closely related in Guangzhou and Foshan populations. The maximal genetic distance between groups (0.475 686) was observed between Wenchang population in Hainan province and Zhanjiang population in Guangdong province, and the minimal (0.116 786) between Guangzhou in Guangdong province and Foshan population in Guangdong province. It was found that the four cultured populations have a medium to high level of genetic diversity, showing potential for further selective breeding. The Hainan population exhibited significant genetic differentiation from the other three populations, enriching the genetic resources of P. hypophthalmus. The finding provides essential data for the conservation and scientific management of P. hypophthalmus aquaculture genetic resources.

Key words：Pangasianodon hypophthalus; cultured population; microsatellite; genetic diversity

中图分类号：S 917.4

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2024-090

文章编号：2095-1388(2024)06-0977-09

收稿日期：2024-04-28

基金项目：中国水产科学研究院院级基本科研业务费专项(2020XT11)；广东省现代农业产业技术体系创新团队建设项目(2019KJ150)；中国-东盟海上合作基金资助(CAMC-2018F)

作者简介：倪未(1997—)，男，硕士研究生。E-mail：nidawei31@163.com

通信作者：

刘晓莉(1988—)，女，博士，副研究员。E-mail：liu_xiaoli1988@126.com

刘毅辉(1973—)，男，副研究员。E-mail：34576015@qq.com(并列通信作者)