转录因子(transcription factor)是真核生物中一类能够与靶基因启动子区特定DNA序列(顺式作用元件)结合进而调控靶基因表达的蛋白分子[1]。典型的转录因子通常包含DNA结合区(DNA-binding domain)和转录调控区(transcription regulatory region)等功能区。按照DNA结合区共性结构的不同，转录因子可分为HLH转录因子(helix-loop-helix transcription factors)、HTH转录因子(helix-turn-helix transcription factors)和锌指转录因子(Zinc finger transcription factors)等[2-3]。
缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)属于典型的HLH转录因子家族成员，是公认的细胞缺氧(低氧)适应调节因子[4]。在缺氧(低氧)条件下，HIF-1α基因可以通过结合靶基因的启动子区调控包括葡萄糖转运蛋白(glucose transporter)、己糖激酶(hexokinase)、醛缩酶(aldolase)、6-磷酸果-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-bisphosphatase)和烯醇酶(enolase)等糖酵解相关基因的表达，调控机体的能量代谢过程[5]。一般认为，HIF-1α基因在常氧条件下的表达量相对较低[6]，因此，有关常氧条件下HIF-1α基因调控靶基因表达的报道相对较少。
GDH(glutamate dehydrogenase，GDH)是生物体内普遍存在的调控氨基酸代谢的关键酶[7]。GDH基因催化的α-酮戊二酸与谷氨酸的可逆反应被认为是三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCA)和氨基酸代谢的关键节点之一，也是影响机体能量代谢的关键生化反应环节[8]。目前，在医学研究领域，GDH基因可作为神经活性类固醇和药物的选择性靶点[9]，在增强机体的抗应激性和控制能量稳态中发挥重要作用[10]。在水产动物研究领域，GDH基因被证实在水产动物响应氨胁迫[11-12]、盐度胁迫[13]、病毒感染[14]及高温胁迫过程中发挥重要作用[15]。但是，目前在水产动物中有关GDH基因参与机体能量代谢的研究仍然相对较少。
中间球海胆(Strongylocentrotus intermedius)又称为虾夷马粪海胆，是海洋浅海生物的代表性物种，也是重要的经济渔业资源，自1989年从日本引入中国以来，已在辽宁大连、山东等沿海形成较大的养殖规模，是中国目前最重要的经济海胆种类[16]。前期数据显示，课题组克隆获得的HIF-1α序列(GenBank ID：MN094787.1)与人(Homo sapiens)的HIF-1α基因在保守结构域结构上相似度较高(经典结构域bHLH一致性：68.52%)。值得注意的是，研究显示，人的HIF-1α基因可通过结合GDH基因启动子区在缺氧压力下通过调节肺癌细胞谷氨酰胺代谢影响机体的ATP水平[6]，由于中间球海胆基因组尚未公布，因此，利用NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)“Change region shown”中的“Selected region”程序，从已公布的中间球海胆近源种——紫球海胆(Strongylocentrotus purpuratus)基因组(NCBI reference Sequence：NW_022145595.1)中挖掘和预测出紫球海胆GDH基因(Gene ID：584300)上游1～2 kb序列为潜在的启动子区，进一步将预测的中间球海胆GDH基因启动子区序列和海胆的HIF-1α序列提交至生工生物工程(上海)股份有限公司技术部进行生物信息学分析，初步判定中间球海胆的GDH基因启动子区与HIF-1α基因可能存在潜在的结合位点，由此推测HIF-1α基因可能通过靶向结合GDH基因启动子相关位点调控GDH基因的转录，从而影响GDH的相对表达及酶活力，并导致中间球海胆体内ATP水平发生变化。
为了证实上述推测及阐明中间球海胆GDH基因表达及其功能受转录因子HIF-1α基因调控的分子机制，本研究中首先利用基因步移法克隆获得了GDH基因的启动子序列，并对其结构特征进行了生物信息学分析，随后，利用双荧光素酶报告基因检测技术验证了中间球海胆中GDH基因启动子区与转录因子HIF-1α基因的结合位点及调控关系，最后，利用RNA干扰等技术解析了GDH基因表达受HIF-1α基因调控进而对海胆能量产生的影响。在获取GDH基因启动子序列的基础上，对GDH基因与转录因子HIF-1α基因之间的调控关系进行探究，以期为深入掌握和了解常氧条件下海胆HIF-1α基因的分子调控功能及海胆乃至棘皮动物转录因子调控靶基因表达的分子机制提供一定的科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究中所用中间球海胆采自大连旅顺龙王塘养殖场，平均湿体质量为(20.0±2.0)g，平均壳径为(34.1±3.3)mm。试验前一周，暂养于农业农村部北方海水增养殖重点实验室控温循环水槽中，持续通气以保持水体溶氧充足，水温为15.0 ℃，pH为8.10±0.03，盐度为31.21±0.20，溶氧为7.88 mg/L，换水周期为2 d，暂养期间不投喂。
1.2 方法
1.2.1 样本收集 选取5只健康的中间球海胆，于冰上取体腔液，做好标记后，在液氮中迅速冷冻，冻存于-80 ℃超低温冰箱中，用于后续试验。体腔细胞的收集按照Ren等[17]的方法进行，即将收集的体腔液在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min后，收集沉淀，用于后续启动子克隆试验。
1.2.2 基因组DNA和总RNA提取及cDNA合成 基因组DNA采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化有限公司)进行提取。获得中间球海胆体腔细胞基因组DNA模板，对其稀释100倍后置于-20 ℃下保存备用。总RNA的提取、RNA完整性和浓度检测，以及cDNA第一链的合成和全长扩增按照参考文献[17]进行，将获得的cDNA稀释10倍后置于-20 ℃冰箱中保存备用。
1.2.3 基因步移与测序 根据本课题组克隆获得的中间球海胆GDH基因全长序列(NCBI accession No.MN094787.1)，利用PrimerPremier 5.0软件设计步移引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用Genome Walking Kit试剂盒(北京宝日医生物技术有限公司)对GDH基因启动子序列进行片段扩增。PCR产物采用SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行回收和纯化。连接、转化与菌落PCR试验参照Ren等[17]的方法进行，将3个独立的阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
表1 试验所用引物及其序列
Tab.1 PCR primers used in this study
引物primer序列(5′-3′)sequence(5′-3′)用途usage1st-SP1GAGCATTCCCTGTAGAGACCTGCA2nd-SP2GACTACCGGCGAGTAAGAAGATCG基因步移扩增3rd-SP3GTCACCACGCCAACCAATGAGAM13F:GTAAAACGACGGCCAGTPCR克隆R:CAGGAAACAGCTATGACHIF-1α QF:GTCAACCTCAAAGCAGCCTCTR:TGTGGGAGGCATCCTGTAGC荧光定量PCR扩增GDH QF:GCGTTCTATGTTGGCTGTGCR:CTGAAGCCATGCAACCATGTβ-actinF:ACAGGGAAAAGATGGCACAGA内参序列R:AGAGGCGTAGAGGGAAAGCACsiHIF-1α正义:GAUAAGAACCUAAGGCAAATTRNA干扰反义:UUUGCCUUAGGUUCUUAUCTT
1.2.4 生物信息学分析 中间球海胆GDH基因启动子序列中的基本调控元件预测、转录起始位点预测及转录因子结合位点预测分别采用PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)软件、Promoter 2.0(https：//services.healthtech.dtu.dk/services/Promoter-2.0/)软件、hTFtarget(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget#！/)和AliBaba2.1(http：//gene-regulation.com/ pub/programs/alibaba2/index.html)软件。中间球海胆GDH基因启动子区CpG岛预测采用MethPrimer(http：//urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)软件(检索标准：Islandsize>100.0、GCPercent>50.0、Obs/Exp>0.6)。
1.2.5 实时荧光定量PCR和Western Blotting检测采用LightCycler®96实时荧光定量PCR仪(Roche Life Science，德国)对HIF-1α和GDH mRNA的相对表达情况进行荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCT)分析。以β-actin为内参基因，qRT-PCR所用引物见表1。HIF-1α和GDH mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析[18]。
HIF-1α和GDH蛋白的重组表达和多克隆抗体的制备在戴安生物科技有限公司(武汉)完成。Western Blotting的具体试验步骤按照Zhao等[19]方法进行，其中，HIF-1α和GDH抗体与5%脱脂奶粉按照1∶1 500比例加入，β-Tubulin(内参蛋白)[20]与5%脱脂奶粉按照1∶5 000比例加入。采用ECL Prime 超敏ECL化学发光试剂盒(北京赛文创新生物科技有限公司)和Amersham Imager 600(GE，美国)进行检测。采用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量灰度值。
1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 通过人工序列比对，发现了GDH基因启动子与转录因子HIF-1α基因的结合位点。野生型HIF-1α基因、野生型GDH基因启动子和一种在-683～-649 bp和-280～-264 bp位点发生突变的GDH基因启动子由生工生物科技有限公司(上海)合成。将目的片断插入到荧光素酶质粒的KpnI与XhoI位点之间构建质粒，并进行克隆，这些克隆经测序进一步证实。转染试验中，将293T细胞按30%～50%的汇合度接种于6孔板中，每组设置3个复孔。12～20 h后转染目的和对照质粒：分别配制DNA和转染试剂，24孔板转染质粒时每孔比例为DNA∶转染试剂=2 150 ng∶20 μL，转录因子∶启动子∶TK-RLUC=500 ng∶1 500 ng∶150 ng，稀释混合物，常温孵育5 min，稀释转染试剂，常温孵育5 min，将稀释好的混合物和转染试剂混匀，常温孵育20 min，添加到细胞样品中，转染6 h后换液。转染48 h后，弃去培养基，用1×PBS洗1遍，倾斜6孔板，吸干剩余的PBS，每孔加500 μL稀释好的1×PLB，摇床4 ℃条件下摇15 min，进行裂解，将白色不透光的96孔板置于冰上，每孔加20 μL 预先混好的LAR Ⅱ，将裂解好的细胞和PLB反复吹吸后加入孔板中，每孔加入水29 μL，细胞裂解液上清1 μL，2 s后，于Infinite M1000酶标仪(Tecan，瑞士)上测数据，每孔立刻添加20 μL 预先混好的Stop &Glo® Reagent(Luciferase Assay Reagent，Progema)，静止2 s后，于Infinite M1000酶标仪(Tecan，瑞士)上测定数据。
1.2.7 RNA干扰 针对HIF-1α基因的siRNA和Control-siRNA由生工生物工程(上海)股份有限公司设计和合成(表1)。然后将10 μL siRNA(20 nmol/L)或Control-siRNA、10 μL Lip 2000转染试剂和80 μL PBS混合做为转染液。选取健康中间球海胆10只，随机分为2组，每组5只(n=5)。其中，一组海胆体腔内注射100 μL siRNA混合转染液(siRNA组)，另一组海胆体腔内注射Control-siRNA混合转染液(对照组)。转染后24 h时收集siRNA组和对照组的体腔液和性腺，体腔细胞的收集参照“1.2.1节”，所有样本立即冷冻在液氮中，并在-80 ℃下保存，以备后续qRT-PCR、Western Blotting、酶活测定和ATP含量检测试验使用。
1.2.8 中间球海胆体腔细胞中总GDH酶活力和ATP含量测定 按体腔细胞质量(g)∶提取液体积(mL)为1∶9的比例向0.5 g体腔细胞里加入无菌水，进行冰浴匀浆。匀浆蛋白浓度、GDH酶活和ATP含量分别采用试剂盒(商品编号：A045-2、A125-1-1和A095-1-1；南京建成生物工程研究所)测定。采用Epoch酶标仪(Biotek，美国)对显色液的吸光度值进行测定。
1.3 数据处理
试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用Prism 9(GraphPad，USA)软件整理数据和绘制图表。采用Prism 9(GraphPad，USA)中的独立样本t检验进行统计学分析，显著性水平设为0.05，极显著性水平设为0.01。
2 结果与分析
2.1 中间球海胆GDH基因启动子序列及其结构特征
从图1可见，PCR扩增产物经凝胶电泳检测结果显示，本研究中通过基因步移法获得GDH基因启动子序列扩增片段条带单一、无明显杂带，测序鉴定结果显示，扩增片段长度为1 067 bp，进一步分析发现，转录起始位点为起始密码子ATG上游27 bp处的碱基“G”(TSS；图2)，整段启动子序列除包含转录起始位点外，还包含位于起始密码子ATG上游的1 026 bp区间的完整的启动子基本元件，如TATA-box(10个)、CAAT-box(5个)、CGTCA-motif(4个)、CAT-box(2个)、TCT-motif(2个)和ARE(1个)等(表2)。进一步的生物信息学分析结果表明，典型的真核生物启动子结构元件TATA-box结构，分别位于-984～-979、-975～-972、-929～-926、-742～-733、-722～-715、-384～-381、-370～-363 bp处(表2)。通过对转录因子进行预测，结果发现，GDH基因启动子含有多个转录因子结合位点，包括HIF-1α、TBP、C/EBPalp、SP1、MEB、GL和NF-1等(表3)。用在线软件MethPrimer对GDH基因启动子的CpG岛进行预测，结果表明，GDH基因启动子序列在-243～-141 bp处存在一个CpG岛(图3)。
M—标准分子量；1—第一次PCR扩增产物(对照模板)；2—第二次PCR扩增产物(对照模板)；3—第三次PCR扩增产物(对照模板)；4—第一次PCR扩增产物(中间球海胆体腔细胞模板)；5—第二次PCR扩增产物(中间球海胆体腔细胞模板)；6—第三次PCR扩增产物(中间球海胆体腔细胞模板)。
M—marker；1—the 1st PCR amplification product (control template)；2—the 2nd PCR amplification product (control template)；3—the 3rd PCR amplification product (control template)；4—the 1st PCR amplification product (S. intermedius coelomocytes template)；5—the 2nd PCR amplification product (S. intermedius coelomocytes template)；6—the 3rd PCR amplification product (S. intermedius coelomocytes template).
图1 中间球海胆GDH基因启动子步移法PCR扩增产物电泳图
Fig.1 Electrophoresis image of product of GDH gene promoter amplification by genome walking in Strongylocentrotus intermedius
ATG代表起始密码子；黑框标记启动子结构元件TATA-box；黄色阴影部分代表转录起始位点TSS；下划实线标记表示基本调控元件。
ATG marks the start codon；the black boxes mark the promoter structural elements TATA-box；the yellow shaded indicates the transcription initiation site (TSS)；underlines indicate the basic regulatory elements.
图2 中间球海胆GDH基因启动子基本调控元件预测
Fig.2 Prediction of cis-acting elements in GDH gene promoter in Strongylocentrotus intermedius
图3 中间球海胆GDH基因启动子CpG岛的预测
Fig.3 Prediction of CpG island of GDH gene promoter in Strongylocentrotus intermedius
表2 中间球海胆GDH基因启动子区基本调控元件
Tab.2 Prediction of basic regulatory elements of GDH gene promoter in Strongylocentrotus intermedius
区region调控元件regulatory element序列(5′-3′)sequence (5′-3′)位置/bpposition正、负链positive (+) and negative (—) chain功能functionatataa-984+核心启动子元件tata-983+核心启动子元件tata-931+核心启动子元件tataaa-742—核心启动子元件TATA-boxtatataa-741—核心启动子元件tatata-740+核心启动子元件tata-738+核心启动子元件taaagatt-722+核心启动子元件tata-384—核心启动子元件tatttaaa-370—核心启动子元件核心区MYCcaattg-912+—CAT-boxgccact-864—与分生组织表达相关的顺式调控元件gccact-613+与分生组织表达相关的顺式调控元件AT～TATA-boxtatataaa-742——tatata-740+—chs-CMA1attacttaa-727+光响应元件的一部分CGTCA-motifcgtca-663—参与MeJA反应性的顺式作用调控元件TGACG-motiftgacg-633+参与MeJA反应性的顺式作用调控元件LAMP-elementctttatca-509+光响应元件的一部分AREaaacca-499+对厌氧诱导必不可少的顺式调节元件CAAT-boxcaaat-467+启动子和增强子区中常见的顺式作用元件caaat-992+启动子和增强子区中常见的顺式作用元件CAAT-boxcaaat-205—启动子和增强子区中常见的顺式作用元件caaat-168—启动子和增强子区中常见的顺式作用元件agctcaatttca-61—启动子和增强子区中常见的顺式作用元件非核心区TCT-motiftcttac-347—光响应元件的一部分tcttac-120+光响应元件的一部分TGA-boxtgacgtaa-241—生长素反应元件的一部分cgtca-238+参与MeJA反应性的顺式作用调控元件CGTCA-motifcgtca-144+参与MeJA反应性的顺式作用调控元件cgtca-106+参与MeJA反应性的顺式作用调控元件
表3 中间球海胆GDH基因启动子区转录因子结合位点的预测
Tab.3 Prediction of transcription factor binding sites of GDH gene promoter in Strongylocentrotus intermedius
区region转录因子transcriptional factor转录因子结合区 transcriptional factor binding region/bp起始 start终止 end序列(5′-3′)sequence (5′-3′)TBP-935-926gggtataaaa-743-734tttatatacc-932-923tataaaatcaC/EBPalp-840-831tgattttttt-442-433attttttgct核心区Sp1-906-897tcccgcgcccMEB-853-844taaaaaGL-853-844taaaaaNF-1-853-844taaaaaICSBP-695-686agaagtgaaaHIF-1α-683-649ttagcatcgcctttttttttttttctcttttttttSRF-556-547cccaaagaaHIF-1α-280-264catgggtgtgcggtggcATF-240-230attacgtcacCRE-BP1-238-229ttacgtcaca非核心区NF-Y-205-196ctcattggttSRF-170-161cccatatttgOct-1-165-156atttgcatatOct-5-165-156atttgcatat
2.2 中间球海胆GDH基因启动子与HIF-1α基因的结合位点及靶向关系验证
从图4可见，生物信息学预测分析发现，中间球海胆GDH基因启动子与HIF-1α基因存在两个结合位点。为了证实中间球海胆GDH基因启动子与HIF-1α基因的结合位点及靶向关系，本研究中首先分别构建了中间球海胆野生型HIF-1α基因、野生型GDH基因启动子及突变型GDH基因启动子的表达载体，经过重组反应、转化和单菌落挑选，提取质粒后使用KpnI和XhoI限制性内切酶双酶切各表达载体，从图5可见，通过琼脂糖凝胶电泳检测，酶切产物与预期一致，经测序确认，序列正确，提示表达载体构建成功。
WT—野生型；MUT—突变型。WT—wild type；MUT—mutant.
图4 中间球海胆GDH基因启动子与HIF-1α基因的结合位点预测
Fig.4 Predicted binding sites of GDH gene promoter and HIF-1α gene in Strongylocentrotus intermedius
M—标准分子量；1—HIF-1α的原始质粒电泳；2—HIF-1α的KpnI/XhoI酶切片段(预期大小：2 820 bp)；3—GDH基因启动子的原始质粒电泳；4—GDH基因启动子的KpnI/XhoI酶切片段(预期大小：1 079 bp)；5—GDH基因启动子突变体的原始质粒电泳；6—GDH基因启动子突变体的KpnI/XhoI酶切片段(预期大小：1 069 bp)。
M—marker；1—primordial plasmid electrophoresis of HIF-1α；2—enzyme—KpnI/XhoI digestion fragment of HIF-1α (Expected size：2 820 bp)；3—primordial plasmid electrophoresis of GDH promoter；4—KpnI/XhoI digestion fragment of GDH promoter (Expected size：1 079 bp)；5—primordial plasmid electrophoresis of mutant GDH promoter；6—KpnI/XhoI digestion fragment of mutant GDH promoter (Expected size：1 069 bp).
图5 中间球海胆HIF-1α基因和GDH基因启动子限制酶电泳图
Fig.5 Electrophoretic image of HIF-1α gene and GDH gene promoter restriction enzyme of Strongylocentrotus intermedius
利用构建成功的表达载体进行双荧光素酶报告基因检测分析，验证中间球海胆GDH基因启动子与HIF-1α基因的结合位点及靶向关系。从图6(a)可见，与对照组相比，野生型GDH基因启动子组和突变型GDH基因启动子组的活性显著增加(P<0.01)，说明构建的中间球海胆野生型和突变型GDH基因启动子均具有转录活性，提示克隆获得的中间球海胆GDH基因启动子序列可以结合转录因子启动GDH基因的转录。从图6(b)可见，“转录因子载体+野生型GDH基因启动子”组与“野生型HIF-1α基因+野生型GDH基因启动子”组相比，后者的活性显著增加(P<0.01)，提示转录因子HIF-1α基因可正向调控野生型GDH基因启动子，影响GDH基因的转录活性。“转录因子载体+突变型GDH基因启动子”组与“野生型HIF-1α基因+突变型GDH基因启动子”组相比，二者无显著性差异，提示转录因子HIF-1α基因与突变型GDH基因启动子无明显的相互作用关系。
pGL3-Control—阳性对照；pGL3-basic—启动子载体；pcDNA3.1—转录因子载体；WT—野生型，MUT—突变型。标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。
pGL3-Control—positive controlp；GL3-basic—promoter vector；pcDNA3.1—transcription factor vector；WT—wild type；MUT—mutant.The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter within the same column are not significant differences.
图6 双荧光素酶报告基因检测GDH基因启动子与HIF-1α基因结合位点及靶向关系验证
Fig.6 Luciferase reporter assay for detection and verification of the binding sites and targeting relationship between GDH gene promoter and HIF-1α gene
2.3 中间球海胆GDH基因表达受HIF-1α基因调控进而对海胆不同组织中ATP含量的影响
为了进一步验证中间球海胆GDH基因表达受HIF-1α基因调控进而对中间球海胆不同组织中ATP含量(能量水平)的影响，本研究中首先根据HIF-1α基因序列合成其特异性siRNA序列，在确认该siRNA对HIF-1α基因的表达确有干扰作用后，利用RNA干扰技术敲降中间球海胆HIF-1α基因的表达，在此基础上，比较分析了在中间球海胆体腔细胞和性腺组织中HIF-1α基因正常表达及抑制表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺组织中GDH基因的相对表达水平、相对总酶活力及ATP相对含量的变化情况。
从图7(a)～(d)可见，注射HIF-1α基因特异性siRNA后，中间球海胆体腔细胞和性腺中HIF-1α基因的相对表达量无论是在mRNA水平还是蛋白水平均显著低于对照组(注射NC siRNA；HIF-1α基因正常表达)(P<0.01)，证实RNA干扰可显著抑制HIF-1α基因的相对表达。在本研究中进一步检测发现，与对照组相比，抑制HIF-1α基因的相对表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中GDH基因的相对表达在mRNA水平和蛋白水平均呈显著下降趋势(P<0.01；图7(e)～(h))。在试验中的酶活力检测结果显示，与对照组相比，抑制HIF-1α基因的相对表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中GDH基因的相对总酶活力也呈显著下降趋势(P<0.01；图7(i)～(j))。ATP相对含量检测发现，与对照组相比，抑制HIF-1α基因的相对表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中ATP的相对含量均呈显著下降趋势(P<0.01；图7(k)～(l))。
(a)，(b)—体腔细胞中HIF-1α mRNA和蛋白的相对表达情况；(c)，(d)—性腺中HIF-1α mRNA和蛋白的相对表达情况；(e)，(f)—体腔细胞中GDH mRNA和蛋白的相对表达情况；(g)，(h)—性腺中GDH mRNA和蛋白的相对表达情况；(i)，(j)—体腔细胞和性腺中GDH基因的相对总酶活力；(k)，(l)—体腔细胞和性腺中ATP的相对含量。**表示与对照组有极显著性差异(P<0.01)。
(a)，(b) —relative expression of HIF-1α mRNA and protein in coelomocytes；(c)，(d) —relative expression of HIF-1α mRNA and protein in gonads；(e)，(f) —relative expression of GDH mRNA and protein in coelomocytes；(g)，(h) —relative expression of GDH mRNA and protein in gonads；(i)，(j) —relative total GDH gene enzyme activity in coelomocytes and gonads；(k)，(l)—relative content of ATP in coelomocytes and gonads. **means very significant difference compared with the control(P<0.01).
图7 HIF-1α基因干扰对中间球海胆体腔细胞和性腺中HIF-1α和GDH基因相对表达、相对总GDH酶活力和相对ATP含量的影响
Fig.7 Effects of HIF-1α gene interference on relative expression of HIF-1α and GDH gene，relative total GDH enzyme activity，and relative ATP content in coelomocytes and gonads of Strongylocentrotus intermedius
3 讨论
3.1 中间球海胆GDH基因启动子结构及转录因子预测分析
启动子是决定基因转录活动的“开关”，其序列结构也是决定基因转录效率的关键[21]。本研究中获得了长度为1 067 bp的中间球海胆GDH基因启动子序列，其中，转录起始位点为翻译起始密码子ATG上游27 bp处的碱基“G”，这与现已报道的刺参(Apostichopus japonicus)骨髓细胞瘤癌(myelocytomatosis viral oncogene)基因和凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)血蓝蛋白大亚基(hemocyanin subunit)基因的转录起始位点相同[22-23]，而与脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)DNA甲基转移酶2(DNA methyltransf-erase2)基因和大黄鱼(Larimichthys crocea)神经突触相关蛋白3(SLIT and NTRK-like family，member 3)基因不同[24-25]，由此推测，在不同水产动物中，不同基因的转录起始位点碱基选择的偏好性具有一定差异，具体的偏好选择机制仍有待进一步研究和探索。
本研究中，生物信息学分析结果显示，中间球海胆GDH基因启动子序列中包含12种基本调控元件、14种不同转录因子的结合位点及1个CpG岛，其核心序列区位于-984～-363 bp，存在TATA-box和CAAT-box等10种高度保守的基本调控元件，与现已报道的水产生物启动子完整序列结构组成相一致[23-25]。其中，TATA-box为真核生物启动子中存在的保守序列，通常位于核心启动子区，是保障基因准确有效转录的关键调控元件之一[26-27]。现有研究显示，在大多数生物体中的TATA-box主要位于基因转录起始位点-30～-25 bp区内[27]，而本研究中，中间球海胆GDH基因启动子序列中的TATA-box则主要位于GDH基因转录起始位点的-956～-336 bp区内，这一结果提示，中间球海胆GDH基因启动子序列中的TATA-box可在距离转录起始位点较远处就与RNA聚合酶特异性结合形成转录前起始复合物，而转录前起始复合物与转录起始位点距离较远是否意味着中间球海胆GDH基因的转录效率可受到更为复杂的调控，仍需进一步地研究和探讨。有趣的是，脊尾白虾DNA甲基转移酶2基因启动子中的TATA-box位于-35～-26 bp区内[24]，基本符合大多数生物体中的TATA-box主要位于基因转录起始位点-30～-25 bp区内这一观点[27]，本研究中，中间球海胆GDH基因启动子序列中的TATA-box(转录起始位点-956～-336 bp区)、凡纳滨对虾血蓝蛋白大亚基基因启动子中的TATA-box(转录起始位点-110～-103 bp区)[23]和刺参骨髓细胞瘤癌基因启动子中的TATA-box(转录起始位点-148～-146 bp区)[22]，却与大多数生物体中的TATA-box主要位于基因转录起始位点-30～-25 bp区内这一观点[27]并不一致，推测水产动物基因启动子序列中TATA-box的位置并不保守，存在一定基因和物种差异，当然，这一问题还有待进一步研究和分析。此外，本研究中发现，CAAT-box位于中间球海胆GDH基因转录起始位点-141 bp处。研究显示，大多数生物体中的CAAT-box主要分布在基因转录起始位点-159～-51 bp的区内[28]，在本研究中，中间球海胆GDH基因启动子序列中的CAAT-box也位于这一区间，表明不同基因启动子序列中CAAT-box的位置相对保守。此外，除上述存在于GDH核心启动子区的基本调控元件以外，在GDH基因启动子非核心区还预测到了TGA-box和TCT-motif等4种水产动物基因启动子中常见的基本调控元件，但是，目前针对中间球海胆GDH基因启动子不同区内的调控元件与转录因子间的互相作用机制仍有待进一步研究。
利用hTFtarget和AliBaba2.1等多个在线软件对中间球海胆GDH基因启动子核心区(-984～-363 bp)的潜在转录因子结合位点进行预测。结果显示，中间球海胆GDH基因启动子核心区存在TBP和C/EBPalp等12种转录因子结合位点。其中，转录因子TBP可以识别DNA序列中的TATA-box[28]，本研究中，预测的转录因子TBP的结合位点分别位于中间球海胆GDH基因启动子核心区的-935～-926 bp和-743～-734 bp，两个结合位点区内均包含中间球海胆GDH基因启动子中的TATA-box元件区。C/EBPalp(CCAAT/增强子结合蛋白α)是转录因子C/EBP家族的重要成员，其基本作用是建立和维持分化状态并抑制生长[29]，中间球海胆GDH基因启动子核心区的C/EBPα主要集中在克隆片段-932～-923 bp、-840～-831 bp和-442～-433 bp。除上述存在于GDH基因核心启动子区的转录因子结合位点以外，在GDH基因启动子非核心区还预测到了ATF和CRE-BP1等7种水产动物基因启动子中常见的转录因子结合位点。因此，系统研究转录因子对中间球海胆GDH基因转录调控效率的影响将是未来的一个重要方向。
CpG岛是真核生物基因转录起始位点附近富含GC的序列，容易发生甲基化进而影响转录因子的结合能力，从而抑制或激活基因表达[30]。现有研究显示，基因启动子区CpG岛的甲基化水平在某种程度上可以决定该基因的转录表达效率，是真核生物表观遗传修饰的常见机制之一[30]。本研究中预测发现，中间球海胆GDH基因启动子中存在1个CpG岛，但是，目前中间球海胆GDH基因启动子CpG岛甲基化水平与其表达效率之间的关系尚未明确，相关作用机制仍有待进一步的研究。
3.2 HIF-1α基因调控GDH基因转录效率对中间球海胆不同组织中ATP水平的影响
作为典型的HLH转录因子家族成员，HIF-1α基因可通过结合启动子序列中的顺式作用元件调控靶基因的转录表达，本研究中，生物信息学预测结果显示，中间球海胆GDH基因启动子的核心区和非核心区均存在HIF-1α基因的结合位点，由于启动子核心区是影响基因起始转录的关键调控序列，而启动子非核心区也可以不同程度地影响基因的相对表达[23，25]。由此推测，在中间球海胆中，HIF-1α基因是调控GDH基因转录效率的关键转录因子之一[24]。进一步的双荧光素酶报告基因检测结果显示，中间球海胆中的GDH基因启动子的-683～-649 bp和-280～-264 bp区确实可与HIF-1α基因相结合，且两者之间存在正调控关系，这一结果不仅证实了中间球海胆中HIF-1α基因与GDH基因的靶向调控关系，也进一步丰富了海胆乃至棘皮动物HIF-1α基因调控的靶基因信息。
由于GDH基因还可催化α-酮戊二酸与谷氨酸的可逆反应，又是影响机体能量代谢的关键生化反应环节[8]，结合中间球海胆中的HIF-1α基因确实与GDH基因存在实质靶向调控关系的研究结果，本研究中进一步利用RNA干扰技术，探究了中间球海胆HIF-1α基因抑制表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中GDH基因相对表达、相对总GDH活力及相对ATP含量的变化情况。与双荧光素酶报告基因检测结果相一致，与对照组相比，抑制HIF-1α基因表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中GDH基因相对表达和相对总GDH活力均呈现显著下降趋势，由于酶含量在一定程度上可以决定酶活力的高低，因此，推测抑制HIF-1α基因表达后，中间球海胆中GDH基因的转录效率减低导致GDH含量减少进而降低了相对总GDH活力，这一结果进一步证实中间球海胆中GDH基因的表达受HIF-1α基因正向调控进而影响GDH的活力，同时也提示HIF-1α基因可能通过调控GDH基因的转录效率从而调控中间球海胆的三羧酸循环和氨基酸代谢过程，这也是后续研究海胆中HIF-1α基因调控功能的重要方向之一。
能量是机体生长发育、健康状况和活动能力的重要保障，ATP含量是衡量机体能量水平的重要指标[31]。本研究中发现，抑制HIF-1α基因表达后，中间球海胆体腔细胞和性腺中的相对ATP含量呈显著下降趋势，进一步分析发现，HIF-1α基因可通过正向调控GDH基因的表达影响GDH的活力，而GDH活力增强可促进谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸进而促进三羧酸循环反应速度。众所周知，三羧酸循环是机体产能最多的代谢[31]，因此，GDH活力增强可提升机体的能量水平。因此，综合本研究中所获结果，推测HIF-1α基因可通过正向调控GDH基因的表达影响GDH的活力，改变三羧酸循环效率，并导致组织能量水平的改变。作为高等无脊椎动物的代表，海胆的体腔细胞是海胆先天免疫防御的重要组织[32]，有研究显示，增加体腔细胞ATP产量是海胆(Paracentrotus lividus)强化机体免疫防疫反应的保守机制之一[33]。研究显示，能量供应不足可导致海胆性腺发育不良，配子成熟度不高或无法成熟等问题[34-35]。本研究中也发现，抑制HIF-1α基因表达可显著降低中间球海胆性腺中的ATP含量，由此可以推测，虽然在常氧条件下，中间球海胆HIF-1α基因以较低水平表达，但其在维持中间球海胆性腺能量水平动态平衡方面可能发挥重要作用。综上可见，HIF-1α基因可能在维持中间球海胆体腔细胞和性腺能量水平动态平衡中发挥一定作用，其可能的分子机制是HIF-1α基因可通过正向调控GDH基因的表达影响GDH的活力进而影响三羧酸循环的产能量，即正向调控GDH基因的表达可能是HIF-1α基因调控中间球海胆不同组织能量稳态的共同和保守机制。
4 结论
1)中间球海胆GDH基因启动子序列长度为1 067 bp，其核心启动子区为-984～-363 bp，包含12种基本调控元件、14种不同转录因子的结合位点及1个CpG岛，与现已报道的水产生物启动子完整序列结构组成相一致。
2)中间球海胆GDH基因启动子区(-683～-649 bp；-280～-264 bp)与HIF-1α基因存在结合位点且存在正向调控关系，表明HIF-1α基因可通过靶向结合GDH基因启动子进而正向调控GDH基因的表达。
3)抑制HIF-1α基因的表达可显著降低中间球海胆体腔细胞和性腺中GDH基因的相对表达量、相对总酶活力及ATP相对含量，表明中间球海胆GDH基因的相对表达及相对总酶活力受HIF-1α基因正向调控进而影响中间球海胆不同组织中的ATP水平。
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