复合载体固定化枯草芽孢杆菌对养殖池塘水质的影响

池塘养殖是中国水产养殖的主要形式，《2023中国渔业统计年鉴》显示，2022年全国淡水养殖面积为503.308万km2，其中，淡水池塘养殖面积为262.488万km2，占淡水养殖面积的52.15%[1]。目前，部分养殖场池塘养殖存在养殖密度过高、饵料投喂与渔药使用失当等情况，水产动物排泄物、残饵及残留渔药等物质的聚积导致水质恶化[2]。养殖水质恶化不仅会导致养殖产品产量减少和质量降低，还可能导致病害发生，排放的养殖尾水还会对周围环境构成威胁[3]，因此有必要对养殖池塘水质进行改善。

养殖水质改善包括物理法、化学法及生物法等，其中，生物法中的微生物修复具有环境友好、成本低和效率高等优点[4]。目前，应用于池塘水体修复的微生物种类较多，其中，以光合细菌、芽孢杆菌和硝化细菌等最为常见[5-7]。枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtillis)通过分泌淀粉酶和纤维素酶等多种胞外酶来改善水质，同时还可作为添加剂加入饲料，在水产养殖产业具有广泛的应用前景[8]。

在实际应用中，游离微生物易随水流失，需要重复添加，从而导致了养殖成本的增加[9]，而固定化微生物技术可以克服这些缺点。固定化微生物技术是一种通过物理或化学手段，将特定功能的游离细菌固定于载体材料上，以提高微生物的有效浓度的新型技术，提高其对污染物的降解能力[10]。包埋法和吸附法是最常见的微生物固定化方法。其中，包埋法操作简单，能保持多酶系统，且对微生物细胞的活性影响较小[11]。

包埋法固定化微生物所用载体包括单一载体和复合载体。以海藻酸钠作为单一载体固定微生物以净化养殖水的研究较多且有不错的效果[12-13]。但仅用海藻酸钠作为单一载体固定化微生物，存在形成的菌球机械强度和传质性较差等缺点，而如果在微生物固定化过程中，加入其他载体，如加入吸附基质，与海藻酸钠形成复合载体对微生物进行包埋，则可以改善这个问题。有研究发现，在包埋剂中添加吸附基质不仅能提高固定化菌球的通透性，增强细菌的耐冲击负荷能力，还能在作用后期营养物质浓度较低的劣势环境下有效地富集营养物质来供给细菌生长所需[14-15]。目前，国内通过包埋固定化微生物改善养殖水质的研究多集中于室内模拟试验，在养殖池塘中的实际应用尚不多见。

本研究中，首先对固定化枯草芽孢杆菌的吸附基质进行了筛选，然后确定具有最佳净化效果的复合载体固定化菌球制备优化方案，并在养殖池塘围隔中进行了固定化菌球的水质净化试验，主要目的是研发一种对养殖水质具有良好改善性能的固定化微生物制剂，为复合载体固定化微生物在水产养殖中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌购于中国工业微生物保藏管理中心。海藻酸钠(AR)、无水氯化钙(AR)和硅藻土(75 μm)等试剂购于上海麦克林生化科技股份有限公司。沸石(75 μm)和活性炭(75 μm)分别购于河南润佳净水材料有限公司和河南绿之原活性炭有限公司；营养肉汤培养基和营养琼脂培养基购于北京百欧博伟生物技术有限公司。

恒温摇床(WY-200N)，台式离心机(NF1200)，蠕动泵(BT100-2J)，紫外可见分光光度计(TU-1810DAPC)，pH计(PHS-1701)，溶氧仪(YSL)。

1.2 方法

1.2.1枯草芽孢杆菌浓缩菌液的制备从平板上挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种于50 mL灭菌的营养肉汤培养基中，30 ℃、170 r/min下摇床培养14 h；取枯草芽孢杆菌(1.21×109 CFU/mL)培养液50 mL装入50 mL离心管内，6 000 r/min下离心10 min，弃上清液，用无菌水洗涤两次菌体沉淀后，用0.9%的生理盐水稀释至10 mL得菌液(细菌浓度为6.05×109 CFU/mL)备用。

1.2.2 固定化小球的制备

1)无菌小球。称取2 g海藻酸钠，置于75 mL去离子水中，于80 ℃水浴溶解灭菌，冷却后加入25 mL无菌水充分混匀，即得到100 mL含有2%海藻酸钠(质量浓度，下同)的溶液，用蠕动泵将该溶液滴入预冷(4 ℃)的4% CaCl2溶液中，于4 ℃冰箱中交联24 h，所获小球经无菌水洗涤后保存于0.9%的生理盐水中备用。

2)无吸附基质菌球制备。称取2 g海藻酸钠，置于75 mL去离子水中，于80 ℃水浴溶解灭菌，冷却后加入25 mL菌液充分混匀，即得到100 mL质量浓度为2%海藻酸钠及细菌密度为1.51×109 CFU/mL的溶液，后续同无菌小球制作方法。

3)有吸附基质菌球制备。称取2 g海藻酸钠和2 g吸附基质(沸石、硅藻土或活性炭)，置于75 mL去离子中，于80 ℃水浴溶解灭菌，冷却后加入25 mL菌液充分混匀，即得到100 mL 2%海藻酸钠、2%吸附基质(质量浓度，下同)和细菌密度为1.51×109 CFU/mL的溶液，后续同无菌小球制作方法。

1.2.3 不同吸附基质固定化菌球对模拟养殖水的净化效果自上海市某水产养殖场凡纳滨对虾养殖塘采集池水及底泥，运至实验室内，池水通过沉降和过滤去除部分残枝及浮游植物，测定初始值后以氯化铵、亚硝酸钠、硝酸钠和葡萄糖调整

和COD值分别至2.04、0.662、0.098、22.08 mg/L。在18个容积为5 L的塑料圆桶(直径为35 cm，高度为25 cm)中，分别加入1 L底泥及3 L水，试验过程中不曝气。设1个不添加细菌的对照组(S0)和5个试验组，即无菌小球组(S1)、无吸附基质菌球组(S2)、添加以活性炭为吸附基质的菌球组(简称“活性炭组”，S3)、添加以沸石为吸附基质的菌球组(简称“沸石组”，S4)、添加以硅藻土为吸附基质的菌球组(简称“硅藻土组”，S5)，每组设置3个平行。在每个塑料圆桶内，按上述分组加入相应的无菌小球或菌球(小球投加量为2 g/L)，使小球自然沉降到装置底部，使各试验组细菌浓度为106 CFU/mL，在0、3、6、9、12、15 d的11：00—12：00在各组水面下5 cm处采集水样，测定

含量，比较各组中这些指标的去除效果。

1.2.4 菌球制备条件的优化

1)菌球制备条件的正交设计。经预试验，海藻酸钠浓度确定为1%～3%，吸附基质投加量确定为2%～4%，氯化钙浓度确定为3%～5%，交联时间确定为6～24 h。按表1进行4因素3水平的正交试验优化菌球制备条件，具体制作方法参照“1.2.2节”中的“有吸附基质菌球制备”。

2)不同制备条件所得菌球对模拟养殖水的净化效果。试验用水及底泥采自上海市某水产养殖场凡纳滨对虾养殖塘，水样经沉降过滤后，以氯化铵、硝酸钠、亚硝酸钠和葡萄糖分别调整水样

和COD值至2.402、0.745、0.107、23.180 mg/L，将“1.2.4节”中的“菌球制备条件的正交设计”所制得的9种固定化菌球按2 g/L的投加量加入模拟养殖水中，每组设置3个平行，试验持续15 d，每日测定

和

计算其去除率。

1.2.5 复合载体固定化菌球在养殖池塘围隔中的应用在上海市某水产养殖场面积为0.5 hm2的凡纳滨对虾养殖塘内进行围隔试验，试验池塘底泥厚度为40～60 cm，试验围隔为1 m×1 m×2 m的长方形，以高密度两面涂塑的聚乙烯编织布做围隔幔，围隔幔下部埋入池塘底泥0.5 m，上部露出水面0.4～0.5 m，以防腐竹竿为支架架设于池塘中，围隔内水深为1.0～1.1 m。设1个对照组和两个试验组，试验组添加固定化菌球组(简称“菌球组”)和添加游离细菌组(简称“游离菌组”)，每组设置3个平行。菌球组按2 kg/m3加入，按“1.2.4节”确定的最佳制备方法制得的固定化枯草芽孢杆菌，游离菌组按与菌球组相同菌量加入菌液，每组设置3个平行。试验周期为21 d，从施用操作前的当天进行第一次采样后，每隔3 d取一次水样。溶解氧(DO)和pH于现场测定，水样用采水器在水面下30 cm处采集，带回实验室测定

和COD含量。

1.2.6 水质指标测定采用纳氏试剂光度法(HJ 535—2009)、酚二磺酸光度法(GB 7480—87)、N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493—87)和碱性高锰酸钾法(HJ/T 132—2003) 分别测定

和COD含量；采用溶氧仪(YSL-1520)测定DO含量；采用pH计(PHS-1701)测定pH值。

1.3 数据处理

试验数据的统计及计算采用Excel 2020软件进行，通过极差分析法[16]对正交试验数据进行分析。采用SPSS 19.0软件进行数据的单因素方差分析(one-way ANOVA)，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同吸附基质固定化菌球对模拟养殖水的净化效果

图1为不同吸附基质固定化菌球对模拟养殖水体各指标的影响。有菌组(S2、S3、S4和S5)从3 d时开始TAN值出现较大幅度下降，且显著低于无菌组(S0和S1)(P<0.05)。15 d试验结束时，有菌组的TAN值显著低于无菌组(S0和S1)(P<0.05)；有菌组中，有吸附基质菌球组(S3、S4和S5)的TAN值显著低于无吸附基质菌球组(S2)(P<0.05)；在有吸附基质菌球组中，活性炭作为吸附基质的S3组TAN值最低，且显著低于S4组和S5组(P<0.05)，与初始值相比，TAN降低了93.65%。

试验开始后，各组

值出现不同程度地上升，从6 d时开始，有菌组(S2、S3、S4和S5)

值下降，试验结束时，有菌组的

值显著低于无菌组(S0和S1)(P<0.05)；有吸附基质菌球组(S3、S4和S5)显著低于无吸附基质菌球组(S2)(P<0.05)；在有吸附基质菌球组中，S3组的

值最低，显著低于S4和S5组(P<0.05)，与初始值相比，降低了67.35%，为试验结束时对照组

值的26.67%。

和COD的变化趋势与TAN类似，试验结束时，有菌组的

和COD值显著低于无菌组(S0和S1)(P<0.05)；有吸附基质菌球组(S3、S4和S5)显著低于无吸附基质菌球组(S2)(P<0.05)；其中，在有吸附基质菌球组中，S3组

和COD值最低，与初始值相比，分别降低了44.11%和59.99%，但S3、S4和S53组之间无显著性差异(P>0.05)。

上述结果表明，试验结束时，有菌组(S2、S3、S4和S5组)对模拟养殖水中各指标的去除效果显著大于无菌组(S0和S1组)(P<0.05)；有吸附基质菌球组(S3、S4和S5组)优于无吸附基质菌球组(S2组)，其中，以活性炭作为吸附基质的效果更佳，因此选择活性炭作为吸附基质应用于后续试验。

2.2 固定化菌球制备条件的优化

表2为按照4因素3水平正交试验设计所获得不同菌球对

的15 d去除率。比较各指标去除率的极差R可知，对TAN去除率的影响由大至小依次为A(海藻酸钠浓度)>C(氯化钙浓度)>B(活性炭投加量)>D(交联时间)；同理，对

去除率的影响依次为A>D>B>C和A>C>B>D。去除

和

的最优组合分别为A2B3C2D3、A2B3C3D3和A2B2C2D3，综合考虑每个因子出现的频率，最终选择A2B3C2D3作为最佳制备条件，即海藻酸钠浓度2%、活性炭投加量4%、氯化钙浓度4%、交联时间24 h。

2.3 复合载体固定化菌球对养殖水质的影响

从图2可见，各组围隔内水体的pH为7.5～8.0，呈微碱性，组间pH无显著性差异(P>0.05)。各组围隔内水体DO值为10～12.5 mg/L，试验过程中各组DO均呈上下波动，试验结束后各组间无显著性差异(P>0.05)。

试验开始后，围隔内菌球组和游离菌组TAN含量均呈下降趋势，在前6天，游离菌组的TAN含量下降速度较菌球组更快，在6 d时，与初始值相比，TAN降低了55.31%，而菌球组仅降低了44.73%；6 d后游离菌组的TAN含量上升，而菌球组则继续下降至9 d，在试验过程中菌球组的TAN含量始终低于初始水平，试验结束时菌球组的TAN含量显著低于游离菌组及对照组(P<0.05)，仅为对照组的29.14%。围隔内各组的

含量变化趋势同TAN类似，菌球组的

含量呈下降趋势，9 d时

含量达到最低(0.018 mg/L)，与初始值相比，降低了48.57%，试验结束后各组

含量均高于初始值，但菌球组

含量显著低于游离菌组及对照组(P<0.05)，仅为对照组的12.23%。各组的

含量呈波动趋势，在试验前9 d，两个有菌的试验组

含量均呈下降趋势，菌球组的下降速度高于游离菌组，9 d时

含量达到最低(0.195 mg/L)，较初始值降低了34.34%，试验结束时，菌球组

浓度显著低于游离菌组及对照组(P<0.05)，仅为对照组的69.23%。

试验结果表明，各组围隔内水体的COD在试验开始后均有不同程度地下降，9 d时菌球组COD值(6.54 mg/L)显著低于游离菌且达到最低，较初始值降低了52.16%；试验结束时，菌球组COD显著低于游离菌组和对照组(P<0.05)，仅为对照组的68.30%。

3 讨论

3.1 不同吸附基质固定化菌球对水质的改善

本研究中的室内模拟养殖水净化试验发现，有菌组在试验结束时的

和COD值显著低于无菌组，这与许多学者的研究结果类似。如刘洋等[12]利用海藻酸钠、沸石固定化枯草芽孢杆菌制剂净化养殖污水，发现15 d后

和COD的去除率分别达到了55.2%、44.7%、84.9%和90.6%；杨明容等[17]发现，枯草芽孢杆菌能显著降低泥鳅养殖水体的氨氮、亚硝酸态氮和化学需氧量；曾天宇等[18]认为，枯草芽孢杆菌能降低大口黑鲈养殖水环境的

和

水平。王怡平等[15]研究发现，包埋光合细菌过程中加入沸石不但能加强菌球的抗盐性和沉降性，而且还能改善菌球的通透性，增加了海藻酸钠中所包埋细菌与外界水环境的物质传递，从而加强了水质净化的效果。本研究中亦得到类似结果，通过添加沸石、活性炭和硅藻土这几种吸附基质后包埋菌球的净水效果明显优于未添加吸附剂基质的菌球，可能是因为添加吸附基质载体后，能够改善枯草芽孢杆菌的生长条件，增强细菌的活性，从而增强了固定化菌球的净水能力。有学者研究发现，包埋过程中活性炭的添加可以增加固定化菌球内部的孔隙结构，提高固定化菌球的传质性能，促进水中污染物与微生物的接触[19]。本试验中，以活性炭作为吸附基质的菌球对TAN和

的净化效果显著高于以沸石及硅藻土作为吸附基质的菌球，这可能是因为活性炭相对于沸石及硅藻土具有更大的比表面积，孔隙结构更发达，添加活性炭对增强小球通透性的效果更好。

3.2 固定化菌球制备条件的优化

通过正交试验优化固定化微生物的制备条件可以提高其对水体的处理效果。李思琦等[20]通过正交试验设计优化固定化低温硝化细菌的制备条件，发现最优条件下制得的固定化硝化菌对TAN和COD的去除率远高于其他各组。刘娥等[21]在正交试验中发现，海藻酸钠体积分数是制作固定化菌球时最需要关注的影响因素，其对

和

去除率影响最大。周亮[22]的正交试验也发现，以

作为评价指标优化海藻酸钠固定化好氧反硝化菌的制作条件，发现对

去除率影响最大的因素为海藻酸钠体积分数。有学者研究发现，海藻酸钠浓度过高会影响固定化细胞的机械强度及传质性能，并造成颗粒拖尾[23]。本研究中也发现，对

去除率影响最大的因素均为海藻酸钠浓度，且海藻酸钠浓度为2%时得到的菌球综合性能要比浓度为3%时更好，这与其他人的研究结果相似。

本研究中亦发现，活性炭投加量及交联时间两个因素均在最高水平时，菌球的性能更好，可能是因为不同的因素相互之间存在交互作用。杜青平等[24]研究发现，在一定范围内，固定化小球的传质性能随活性炭含量的增加而提高，寇靓玮等[25]也得出类似结果，本试验在2%～4%的活性炭投加范围内，投加量为4%时小球的性能最好，与前面的结果相似。朱承余等[26]研究发现，制作固定化小球时，交联时间短则固定化菌球的机械性能较弱，随着交联时间的延长，所得到的小球机械强度提高，但传质性能降低；单晓静等[27]亦发现，交联时间越长，所得到的固定化小球的强度越高，内部结构越紧密，所对应的外观稳定性和机械强度更好。本研究中交联时间为24 h制得的小球对模拟养殖水的处理效果最好，说明交联时间长的菌球机械强度、致密性及稳定性较好，能够使菌球活性维持更久，从而对污染物的去除效果更佳。

3.3 复合载体固定化菌球对养殖水质的影响

Wu等[28]研究发现，向凡纳滨对虾养殖池中投加枯草芽孢杆菌会使养殖水体的pH下降。本研究中亦有此发现，投加菌球或游离枯草芽孢杆菌后，围隔内水的pH均有所下降，可能是因为投加枯草芽孢杆菌后其会迅速消耗水体有机质所致[29]，不过试验结束时各组间差异并不显著。围隔试验在室外养殖池塘中进行，整体养殖池塘DO较高，各组间差异不大。

环境中非离子氨、亚硝酸盐等含氮化合物会对水产养殖产生影响[30]。由生物排泄、残饵和粪便分解等产生的氨和亚硝酸盐是养殖水体的主要有毒物质和去除目标[31]。枯草芽孢杆菌可通过自养反硝化和自养亚硝化降低水中氨氮、亚硝态氮的含量[32]。王敏等[33]研究发现，海藻酸钠固定化枯草芽孢杆菌能够降低网箱养殖水的TAN及

含量。刘慧玲等[34]向罗非鱼鱼苗的养殖池中引入游离枯草芽孢杆菌，当枯草芽孢杆菌浓度为1.0×104 CFU/mL时，其TAN和

含量分别为2.72、0.15 mg/L，显著低于对照组。本研究中发现，不论是固定化菌，还是游离菌均能降低水中的TAN及

前者对二者的净化效果优于游离菌且持续作用时间更长。Song等[35]用活性炭、聚乙烯醇和海藻酸钠固定的HN-AD菌株处理黑臭水体，对于难降解有机物、游离微生物的处理效果不如固定化微生物，与本研究类似。许多学者发现，枯草芽孢杆菌可用来降低水体

浓度[12，36-37]，本研究中也发现，固定化及游离枯草芽孢杆菌均可降低水中的

但固定化枯草芽孢杆菌的净化效果优于游离细菌。此外，枯草芽孢杆菌具有高活性消化酶系，能迅速降解养殖水体中有机物，从而降低COD。在围隔试验中，固定化及游离菌均对COD呈现较好的净化效果。

本研究中基于单一细菌、围隔试验得到了明确的结论——固定化枯草杆菌可以有效改善池塘水质。但是，鉴于养殖池塘的复杂性，如不同的养殖模式、不同的过程管理、不同的底质条件等，后续还需对固定化微生物技术的应用进行更深入地探索，包括固定复合微生物、优化载体材料、开展安全性测试及进行成本效益分析等。

4 结论

1)以活性炭作为吸附基质的固定化枯草芽孢杆菌可以有效改善养殖水体水质。

2)固定化枯草芽孢杆菌的最佳制备条件为质量浓度2%海藻酸钠和质量浓度4%活性炭的海藻酸钠菌液与质量浓度4%氯化钙交联24 h。

3)在围隔试验中，复合载体固定化菌球对养殖水体的净化效果优于游离菌且持续作用时间更长。利用海藻酸钠+吸附基质的复合载体对枯草芽孢杆菌进行固定化，可以达到包埋固定和吸附固定两种方式共存的效果，这种固定化方法具有操作简单、制备出的固定化菌球抗环境因子影响能力较强等优点，无需再经常培养和投放枯草芽孢杆菌，从而降低了养殖成本并提高了养殖过程的稳定性。

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