克氏原螯虾3群体双列杂交群体耐高温性能比较

克氏原螯虾(Procambarus clarkii)属于甲壳纲(Crustacea)十足目(Decapoda)螯虾科(Cambaridae)，又称“小龙虾”。克氏原螯虾分布较广，是中国重要的淡水养殖品种[1-2]，具有生长快、肉味鲜美、营养价值高等优点[3]。克氏原螯虾在20世纪30年代末从日本传入中国江苏省，目前已经分布于中国长江中下游的诸多省市[4]。2022年，中国小龙虾养殖面积为186.67万hm2、产量为289.07万t，其养殖产量占全国淡水养殖总产量的8.79%，位列中国虾蟹类养殖品种第一位，其养殖模式主要为稻虾综合种养[5]。稻田为浅水环境，小龙虾的生长、存活和繁殖受温度影响较大[6]，近年来，全球气候变暖现象不断加剧，高温持续时间显著扩增[7]，高温正逐渐成为限制中国克氏原螯虾产业发展的关键环境因素，因此，亟需建立克氏原螯虾科学评价方法，并培育耐高温优良品系。

国内外对于虾类的耐高温性状研究分析主要涉及南极磷虾(Euphausua superba)[8]、罗氏沼虾(Macrochium rosenbergii)[9]、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)[10]、中国对虾(Penaeus chinensis)、长臂虾(Palaemon peringueyi)[11]及凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[12]等种类，评估方法主要是耐热性(upper thermal tolerance，UTT)[12]。心率的阿伦尼乌斯拐点温度(Arrhenius break temperatures，ABT)指标最早于1996年便被用于评估潮间带瓷蟹的高温耐受程度[13]，在贝类耐温评估中也较为常见[14-15]，截至目前，尚未见有关克氏原螯虾耐高温性状评定的报道。

本研究中，以芜湖、建湖、滆湖3个克氏原螯虾群体完全双列杂交F1群体为亲本，自交获得9个F2群体，采用UTT、ABT作为耐高温性状评定指标，并结合临界温度法(critical thermal methodology，CTM)、半致死时间(half lethal time，LT50)等方法，比较了9个群体的耐高温性能，分析了不同规格克氏原螯虾耐高温性状的差异性，发现滆湖♀×芜湖♂(GW)群体具有显著的耐高温优势，为耐高温克氏原螯虾良种选育提供了方法基础和种质资源。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验中，为培育克氏原螯虾优质耐高温品系，分别从江苏省滆湖、江苏省建湖、安徽省芜湖3个地区引进克氏原螯虾养殖群体，运往安徽省芜湖市繁昌区克氏原螯虾省级良种场后进行同期繁育。在各群体克氏原螯虾性成熟前(5月初)，分别挑选优质雌雄个体进行分开暂养(每个群体雌雄各挑选600尾)，随后按照完全双列杂交进行配组(表1)，同时使用漂白粉对新开挖的繁育池进行清塘、消杀、晒塘，最后将亲本置于繁育池中进行交配繁育，最终得到9个群体，分别为6组杂交群体[滆湖♀×建湖♂(GJ)、建湖♀×滆湖♂(JG)、滆湖♀×芜湖♂(GW)、芜湖♀×滆湖♂(WG)、建湖♀×芜湖♂(JW)、芜湖♀×建湖♂(WJ)]和3组自交群体[滆湖♀×滆湖♂(GG)、建湖♀×建湖♂(JJ)、芜湖♀×芜湖♂(WW)]，后文各群体名称均用缩写表示。

随机选取60尾5 g左右的虾苗和60尾15 g左右的商品虾作为不同规格克氏原螯虾耐热能力比较的材料，同时为分析不同群体克氏原螯虾商品虾的耐高温性状，合理构建克氏原螯虾耐高温性状的评价体系，试验考虑到不同指标对升温速率的要求，采用了慢性升温和急性升温两种升温方式，分别从每个群体中随机选取76尾不同大小、活力正常、色泽正常、体形完整的克氏原螯虾，其中每组60尾进行慢性升温试验，每组16尾进行急性升温试验。

1.2 方法

1.2.1 慢性升温试验慢性升温试验在玻璃缸中进行，升温方法借鉴刘宝锁等[16]方法并加以改进，在正式试验前先进行预试验，克氏原螯虾在26 ℃水体中暂养1 d后，以1 ℃/2 h的速率升温直至试验虾全部死亡，找出37 ℃为死亡率较高的温度。正式试验以30 ℃为初始温度，选取经1 d暂养正常的个体放入玻璃缸中，以1 ℃/2 h的速率升温至35 ℃；35 ℃之后以0.5 ℃/4 h的速率升温直至试验虾全部死亡。水温采用精确度为0.1 ℃的温控加热器进行控制，试验中保持充气，以确保玻璃缸中各个部位温度同步。本试验中具体死亡标准为试验虾背部朝下倒于水体无法恢复正常的姿势或尾部始终保持接近90°弯曲[17]。记录死亡时间、死亡温度及每只虾的生长性状，包括全长、体长、头胸甲长、头胸甲宽、头胸甲高、腹部长、体质量等。保证每10 min捞取1次死虾并做好记录，当玻璃缸中试验虾均死亡后结束试验。

1.2.2 急性升温试验本试验借鉴贝类心率测定方法[14]，针对克氏原螯虾发明了一种无损伤性的心率测定方法，即使用蓝丁胶将红外心率探测仪的探头固定于虾头胸甲背部后侧(心脏上方)，并用夹子、铁丝将虾悬挂在水中，静置1 h后开始升温试验。心跳产生的光电流信号经放大器(AMP03，Heartbeatmonitor，Newshift，Portugal)放大过滤处理后，被记录并展示在简易示波器软件(Powerlab8/30，AD Instruments，Germany)上，利用软件(Lab Chart Version 8.0)可以计算出虾每分钟的心率(bpm)。

升温试验在玻璃缸中进行，升温方法在“1.2.1节”的基础上按照试验要求改进，正式试验前同样进行了预试验，找出克氏原螯虾心率拐点约为30 ℃。正式试验以26 ℃为初始温度，使用精确度为0.1 ℃的控温设备进行升温，升温为26～35 ℃，每次升温0.5 ℃，每次升温后待温度稳定10 min，记录该水温条件下试验虾心率的典型波形图和参数，以及每只虾的生长性状，而后再进行后续升温以及数据采集。

1.2.3 各评价指标的计算慢性升温试验中，采用耐热性UTT作为主要评定指标[10]。计算公式为

式中：i为分钟数(min)；Ti为第i分钟的温度(℃)；T0为试验初始温度30 ℃；k为个体存活的分钟数(min)。

临界温度CTMax：即为试验虾身体弯曲、运动失去平衡时记录的水温的算术平均值[18]。

半致死时间LT50：即在试验升温过程中，试验虾死亡一半时所需要的时间(min)。

急性升温试验中，采用心率拐点ABT为主要指标。利用软件LabChart分析记录每只虾不同温度下的心率数据，根据阿伦尼乌斯方程计算公式为

式中：k为每分钟周期数(bpm)；T为绝对温度(K)；Ea为活化能，与R为前因子均在该公式中被认为常数。

对温度与心率进行变换后，使用Excel软件的线性回归分析功能对试验虾心率值上升与下降阶段进行直线拟合，继而求出心率拐点ABT指标。

1.3 数据处理

试验结果以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 17.0统计分析软件进行单因素方差分析，采用Duncan多重比较法、Person相关性分析法进行各项指标的差异性或相关性分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同规格克氏原螯虾耐热性能差异

对克氏原螯虾虾苗(养殖户购苗规格约为5 g)与克氏原螯虾商品虾(成虾上市规格约为15 g)进行耐热值对比(表2)，发现克氏原螯虾虾苗的UTT值为6 795.610±911.965，而达上市规格的商品虾UTT值为6 618.470±556.223，二者差异显著(P<0.05)。对克氏原螯虾UTT与体长、体质量相关性进行分析，可知UTT与体长相关性不显著，与体质量呈负相关，相关系数为-0.045(P<0.05)。对克氏原螯虾心率拐点温度等耐高温指标与体长、体质量进行相关性分析(图1)，可知ABT与体长、体质量相关性均不显著，热胁迫前后心率均与体质量呈负相关，相关系数分别为-0.21和-0.15(P<0.05)，热胁迫前后心率呈极显著正相关，相关系数为0.66(P<0.01)。

2.2 不同群体商品虾耐高温指标比较

为比较9个克氏原螯虾群体对高温的耐受性，本研究对测得的9个克氏原螯虾群体UTT、ABT、CTMax、LT50数据进行统计分析(表3)。发现9个克氏原螯虾群体UTT值排序为GW>GJ>WJ>JG>GG>WW>WG>JW>JJ，且GW群体UTT值显著高于其余群体(P<0.05)，GJ群体UTT值显著高于WG、JW 、JJ群体(P<0.05)，WJ群体UTT值显著高于JW 、JJ群体(P<0.05)。9个克氏原螯虾群体ABT排序为GW>WJ>WW>WG>JW>JJ>JG>GJ>GG，且GW群体ABT显著高于其余群体(P<0.05)，WJ群体ABT显著高于GJ、GG群体(P<0.05)，WW群体ABT显著高于GG群体(P<0.05)。9个克氏原螯虾群体CTMax排序为GW>WJ>GJ>GG>WW>JG>JW>WG>JJ，且GW、WJ、GJ 3个群体显著高于其他群体(P<0.05)。9个克氏原螯虾群体LT50排序为GW>GJ>WJ>JG>WW>GG>JW=JJ>WG，且GW群体半致死时间远大于其他群体。UTT、 ABT、CTMax与LT50 4种指标结果具有一定一致性，均显示GW群体耐热能力最佳(表3)。

2.3 UTT和ABT两种耐高温指标测试后个体成活率

临界温度法、半致死时间作为两种群体性指标，无法评估个体的耐高温能力，而UTT和ABT则能较为准确地评估个体或群体的耐高温能力。为了比较UTT和ABT在克氏原螯虾耐热评估上的实用性，本研究中对两种耐高温指标试验后各群体克氏原螯虾存活率进行比较(表4)。结果发现，UTT测定对试验虾伤害极大，各群体试验虾存活率为0%～3.33%，而ABT测定对试验虾伤害较小，各群体试验虾存活率为87.50%～100%。

3 讨论

3.1 耐高温评价指标适用性分析

生物的耐受温度计算方法主要有以下3种[19]：起始致死温度法(incipient lethal temperature，ILT)、临界温度法(critical thermal methodology，CTM)、慢性致死方法(chronic lethal methodology，CLM)。单独使用耐受温度无法全面评价克氏原螯虾的耐高温性状，在生产实践过程中，发现耐高温性状应该是耐受温度和耐受时间的综合反映，而 UTT 值评价方法代表的是生物存活时间与死亡温度和初始温度差值的乘积[20]，该方法成功将生物体的耐高温能力进行了精准量化，且广泛应用于多种鱼类、虾类耐温研究之中[10]。因此，本试验将UTT值作为评定指标之一，且从9个群体克氏原螯虾UTT值结果中筛选出了优良耐高温品系进行分析，也证明了这种测试方法的科学性。

心率的测定是一种重要的反映生物代谢水平变化的方法。根据阿伦尼乌斯方程，心率与温度两者之间存在线性关系即个体的心率会先随着温度上升而后再呈现下降的趋势，心率的拐点温度被称为 ABT指标，这一指标目前被广泛用于多种贝类的耐温评估中[14-15]。本研究中，首次将ABT作为克氏原螯虾耐高温性状的评定指标，其试验结果对比UTT的结果一致，证明了将ABT作为克氏原螯虾耐高温性状评定指标的可行性。

以上两种方法都具有能够量化高温耐受程度的优点，但在测定过程中UTT指标对测定个体具有不可逆的致死性，本研究中，UTT试验致死率最低的群体也达到了96.67%，且该方法测定时间较长，死亡判别误差较大。而使用ABT指标作为筛选手段，不仅快速有效，且对试验动物具有较低致死性，本试验中致死率最高的群体也仅为12.50%，因此，这一指标还可用来检测一些珍贵家系的高温耐受能力。

3.2 规格和发育阶段对克氏原螯虾耐高温性状的影响

温度是影响水生生物生长、繁殖和分布的一个重要因素，超过一定适温范围，个体的行为活动及生长繁殖都将受到抑制，严重时甚至导致死亡[21]。已有研究表明，克氏原螯虾成体的耐受温度为-15～40 ℃，最适生长温度为20～32 ℃[22]。当克氏原螯虾在最适温度情况下，其摄食率随温度上升而增加，超过最适温度后则会降低摄食率，而当温度超过35 ℃后会造成死亡[23]。本研究中，克氏原螯虾的UTT值为6 970.56～5 901.36，ABT为31.32～ 28.94 ℃，CTMax为37.366～37.021 ℃，考虑到群体差异、试验升温方式及死亡判别方式的区别，在克氏原螯虾耐受温度的结果上与国内外学者较为一致。

针对个体之间的耐高温差异，本研究发现，克氏原螯虾UTT值与体质量呈负相关(P<0.05)，且克氏原螯虾虾苗UTT显著高于达上市规格的商品虾(P<0.05)。这一结果与日本囊对虾[10]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[16]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[20]个体耐高温性状与体质量相关关系的结果相一致。因此，针对克氏原螯虾高温期间的养殖管理，如选择放苗时机，需要考虑体质量因素。考虑到小规格虾苗较耐高温，可在即将进入高温期或处于高温期时，在捕捞较大规格成虾的同时放入小规格苗种混养，通过调整水草覆盖率或遮阳等控制水温的措施，提高整体养殖效益。

3.3 杂交对克氏原螯虾耐高温性状的影响

生物体的耐高温性状与其栖息地的水温息息相关，通过人工驯化或气候驯化可在一定程度上改变生物体的耐受性，即气候适应[24]。在本研究中，利用UTT、ABT、CTMax、LT50对亲本来源不同的9个群体克氏原螯虾耐高温性状进行了综合性评估，发现GW群体耐高温性状显著优于其余群体。同时，生物体的耐高温性状还与该物种或个体基因型有关[25]，同一物种中不同个体的耐高温性状或存在较大差异，本研究中克氏原螯虾UTT的差异系数为10.86%～19.46%，个体差异较大，这也反映了通过耐高温品系选育提高群体耐高温能力的可行性[26]。通过杂交育种的方法找到选育性状优势的交配组合，进而选育出优异的克氏原螯虾品种，可以从根本上解决克氏原螯虾种质问题。杂交是生物遗传育种的重要方法之一，根据杂种优势的显性学说，一般有利的性状多由显性基因控制，不利的性状多由隐性基因控制，通过杂交能够将遗传基础不同的个体或群体的基因自由组合，丰富并改变后代的基因组合，增加基因的杂合性，从而获得杂交优势，即杂交后代在生命力、生长速度、产量、质量和抗逆性等方面比其双亲有优势的现象[27]。如Hernández-Gurrola等[28]对来自加利福尼亚州(C)、塔毛利帕斯州(T)和米却肯州(M)的3个不同小龙虾群体进行杂交，发现C、T与M种群的杂交后代表现出明显的繁殖力优势以及生长优势，子代杂合度显著提高。本研究中，杂交群体GW在耐热值、心率拐点温度这两种指标上均显著高于自交群体，GW、WJ、GJ在临界高温值上也高于自交群体，证明使用杂交手段创新种质的可行性。因此，本研究中建议在后续的克氏原螯虾养殖或新品种培育过程中可选择GW杂交群体。

4 结论

1)本研究中利用完全双列杂交的方法构建了9个克氏原螯虾群体，并利用UTT、心率ABT、 CTMax、LT50等方法成功筛选出GW这一耐高温群体，在后续的耐温育种中可主要采用这一群体。

2)在对比个体耐高温能力时发现克氏原螯虾UTT值与体质量呈负相关，说明小规格虾苗更耐高温，生产过程中可利用这一结果优化克氏原螯虾夏季养殖模式。

3)对比UTT和心率ABT这两种耐高温评价方法后发现，这两种方法均能较为准确地评估个体或群体的耐高温能力，但UTT测定对试验虾伤害极大，ABT测定对试验虾伤害较小，说明ABT指标更适用于克氏原螯虾的良种选育。

4)本研究中，杂交群体GW在耐热值、心率拐点温度这两种指标上均显著高于自交群体，GW、WJ、GJ在临界高温值上也显著高于自交群体，证明了使用杂交手段创新种质的可行性。

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