随着中国海水养殖产业的快速发展，养殖过程中产生的氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮等含氮污染物的直接排放对生态环境造成了严重污染，已成为影响现代海水养殖绿色发展的主要瓶颈。目前，中国许多传统海水养殖模式未设置尾水处理设施，养殖尾水难以达到排放要求，因此，开展海水养殖尾水处理方面的研究，对于实现海水养殖绿色发展具有重要意义。

填料生物膜法是一种水质净化处理技术，具有效率高、经济成本低和无二次污染等优点。填料生物膜主要通过吸附、解吸、积累和降解等机制，影响污染物的迁移和分布，并显著消减养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮等有害物质，从而实现养殖尾水原位脱氮修复，达到水质净化与环境修复的目的[1-3]。其中，生物填料作为生物膜法处理工艺的核心部分，直接影响水质净化的处理效果、硝化性能、基建投资和运行费用等，因此，选择处理高效、价格低廉的填料，对填料生物膜技术的推广应用具有重要的现实意义[4]。

国内关于填料的研究较多，有些填料已在养殖尾水处理方面开展了应用研究。黄晓林[5]添加牡蛎壳填料用于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗试验，发现牡蛎壳填料能显著降低对虾育苗水体中氨氮、亚硝酸盐氮的含量，并提高仔虾的存活率。蔺凌云等[6]以弹性填料和流化床填料构建养殖尾水处理系统，系统运行稳定后对氨氮、亚硝酸盐氮及总氮的去除率均在90%以上。彭磊等[7]探讨了聚丙烯塑料发泡填料、悬浮球填料和海绵填料对集装箱循环水养殖尾水的净化效果，结果表明，这些填料对养殖尾水中细菌的吸附能力良好，可作为生物填料用于集装箱循环水养殖系统。

微生物是填料生物膜上实现含氮污染物去除的主要贡献者，其种类、数量及群落结构的变化直接影响尾水的脱氮处理效率，因此，了解填料生物膜上的微生物群落结构，认识功能菌在其中发挥的作用，有利于了解和判断系统的运行状态，以进一步优化尾水处理工艺[8]。近年来，关于填料生物膜已开展了大量的研究[9-11]，但不同处理系统或运行参数都会造成微生物群落结构的显著差异。本试验中，选择4种常见的填料分别构建生物滤池，比较了不同填料的挂膜性能及脱氮能力，分析了填料生物膜的微生物群落结构及多样性，以期为海水养殖尾水处理系统中填料的选择及生物膜脱氮机理的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 填料 选取牡蛎壳、珊瑚石、悬浮球填料和弹性填料4种填料用于试验。其中，牡蛎壳由尼龙绳连接成串，每串长度为1 m；弹性填料单元直径为15 cm，中心一根尼龙绳，周围呈毛刷状，每条长度为1 m；悬浮球填料球体直径为8 cm，外壳为聚丙烯材质，中空渔网状球体，里面填充聚氨酯海绵。填料投放前在121 ℃下灭菌处理30 min。填料的外形如图1所示。

1.1.2 试验装置 采用5组自制的循环水运行装置，每组装置由1个储水桶(350 L)、3个水箱及连接管道组成。水箱为PP材质的长方体(200 mm×300 mm×500 mm)，有效水体为25 L，通过水泵实现下进水上出水循环，管道上安装球阀用以调控水流速度。每组装置的3个水箱表示3个平行，水箱内投放的填料种类及数量如下：对照组(记为C)，无填料；牡蛎壳组(M)，6条牡蛎壳串；珊瑚石组(S)，3 kg珊瑚石；弹性填料(T)，2条弹性填料；悬浮球填料(F)，30个悬浮球。

1.2 方法

1.2.1 人工养殖尾水的配制 本研究中采用改良的人工配制海水养殖尾水[12]，其包含海水 300 L、NH4Cl 13.2 g、NaHCO3 33.5 g、MgSO4·7H2O 0.35 g、Na2HPO4 1.52 g和三水合乙酸钠17.0 g。其中，原海水取自厦门附近海域，初始水质指标如下：pH为 7.8，盐度为29.2，亚硝酸盐氮为0.01 mg/L，氨氮为0.01 mg/L，硝酸盐氮为0.56 mg/L，磷酸盐为0.19 mg/L。

1.2.2 挂膜试验 在福建省水产研究所生态实验室进行试验。试验期间，水温为17～20 ℃，DO>5 mg/L，盐度为28～30，pH为7.8～8.2。试验前先将该装置用质量分数为0.1%的高锰酸钾溶液(市售)浸泡48 h进行消毒，再用自来水浸泡24 h，最后经自来水冲洗后往储水桶注入300 L人工配制的养殖尾水。挂膜期间水体缓慢流动循环(根据流量和时间换算，流速约12 L/h)，每5 d添加一次三水合乙酸钠(终质量浓度为50 mg/L)，每10 d更换一次尾水。每2 d测定一次生物滤池中浓度，直到生物滤池中和质量浓度均低于0.10 mg/L，视为自然挂膜成熟。挂膜(20、40、60 d)时进行填料取样，样品编码用填料缩写字母前加T表示，第N次取样编码后面加N，平行样添加后缀(-1、-2、-3)。如珊瑚石第3次取样的2号平行样，编号为TS3-2。

1.2.3 24 h脱氮能力试验 挂膜成熟后，所有生物滤池更换不含氮源的人工养殖尾水，其中，去除试验添加NH4Cl (终质量浓度为去除试验添加NaNO2(终质量浓度为10 mg/L)，去除试验添加KNO3(终质量浓度为10 mg/L)。24 h后分别取水样测定不同填料生物滤池水体中的质量浓度，分析不同填料生物膜对不同氮源的去除能力，以及不同氮源水体中无机氮的变化情况，其中，无机氮的质量浓度为水体中三者质量浓度的总和。

1.2.4 水质分析 依照《海洋监测规范》(GB 17378.4—2007)进行水质指标的检测，采用次溴酸盐氧化法、盐酸-萘乙二胺分光光度法、锌-镉还原法分别测定含量，采用WTW Multi 3430多参数分析仪测定pH、盐度、水温和溶解氧含量。

1.2.5 扫描电镜分析 用无菌方式取挂膜前和挂膜后(60 d)的填料样品置于无菌离心管中，送至自然资源部第三海洋研究所科学仪器共享平台进行扫描电镜分析。

1.2.6 微生物群落分析 填料样品加入500 mL(分两次)含0.5%吐温的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)，在漩涡振荡仪上以最大速度振荡5 min得到悬浮液，过0.22 μm无菌滤膜，将滤膜放入无菌离心管中，于-80 ℃冰箱中保存。用干冰保存并将样品运送到生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA提取和高通量测序。

对高通量测序数据，采用RDP Classifier贝叶斯算法将97%相似度水平的OTU代表序列进行分类学分析，统计各样品在门和属水平上的群落组成。基于OTU分析结果，采用Chao 1指数、Shannon指数和Simpson指数进行Alpha多样性分析。Chao 1指数越大，表明群落丰富度越高；Shannon指数越大或Simpson指数越小，表明群落多样性越高。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 22.0软件对试验数据进行单因素方差分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 挂膜期间溶解态无机氮的变化

采用每10 d换一次水的方式进行自然挂膜，以水体中检测出的和质量浓度均低于0.10 mg/L作为填料生物膜成熟标志。自然挂膜期间，水体中及三者之和的无机氮质量浓度变化趋势见图2。由于本研究中采用每10 d换一次水，故水体中的质量浓度在第10、20、30、40、50天时会重新回到初始水平。从图2(a)可见：挂膜期间(0～60 d)，对照组(C)和试验组(M、S、T、F)水体中质量浓度均不同程度地呈下降趋势；挂膜后期(40～60 d)，试验组水体中实现完全转化所需时间从早期的大于10 d缩短至4 d左右，54 d时试验组质量浓度下降至0.40 mg/L以下，同期对照组下降至1.70 mg/L，挂膜成熟时试验组质量浓度可维持在0.03 mg/L以下。从图2(b)～(d)可见：挂膜期间，对照组水体中无机氮的质量浓度均不断上升；各试验组水体中三者的质量浓度在挂膜后期总体上呈先上升后下降的变化趋势，挂膜成熟时各试验组质量浓度均低于0.05 mg/L。同时发现，珊瑚石组水体中的累积浓度和累积时间均低于对照组和其他试验组。总体上，4种填料生物膜成熟的时间依次为珊瑚石(46 d)<牡蛎壳、悬浮球填料和弹性填料(约50 d)。

2.2 不同填料的挂膜效果

4种填料挂膜前后扫描电镜图如图3所示。在相同的放大倍数下，挂膜前牡蛎壳和弹性填料表面均较光滑平整(图3A、C)，珊瑚石和悬浮球填料表面粗糙且孔隙较多(图3B、D)。经60 d挂膜成熟后，牡蛎壳、珊瑚石表面微生物附着量较少(图3E、F)，弹性填料和悬浮球填料表面胶状物发达，上面均附着了大量的微生物，且微生物种类较多，以杆状细菌为主(图3G、H)。

2.3 不同填料生物膜的24 h脱氮能力

从图4可见：与不加填料的对照组去除率为15.25%±6.21%)相比，牡蛎壳和珊瑚石填料生物膜对的24 h去除能力略有提升(P>0.05)，而弹性填料和悬浮球填料生物膜对的去除能力显著提升(P<0.05)，4种填料生物膜对的去除率依次为悬浮球填料(68.66%±6.27%)>弹性填料(42.42%±4.81%)>牡蛎壳(23.01%±6.22%)、珊瑚石(20.17%±1.32%)；悬浮球填料生物膜对无机氮的24 h去除效果最显著(P<0.05)，去除率为(3.99%±3.90%)，其他试验组与对照组均无显著性差异(P>0.05)。

从图5可见：试验组对的24 h去除能力均显著高于对照组(7.33%±1.70%)(P<0.05)，4种填料生物膜对的去除率依次为珊瑚石(99.99%±0.00%)>悬浮球填料(63.70%±4.11%)>弹性填料(46.67%±8.73%)>牡蛎壳(23.33%±1.70%)；除牡蛎壳外，其他3种填料生物膜对无机氮的24 h去除率均显著高于对照组(P<0.05)，4种填料生物膜对无机氮的去除率依次为珊瑚石(22.09%±1.48%)>悬浮球填料(12.14%±3.49%)>弹性填料(7.96%±0.99%)>牡蛎壳(3.02%±0.30%)。

从图6可见：与对照组相比，珊瑚石、弹性填料生物膜对的24 h去除能力无显著性差异(P>0.05)，而牡蛎壳、悬浮球填料生物膜对的去除能力显著提升(P<0.05)，4种填料生物膜对的24 h去除率依次为悬浮球填料(6.73%±3.41%)>牡蛎壳(4.88%±3.09%)>珊瑚石(2.44%±1.98%)>弹性填料(2.34%±0.26%)；4种填料生物膜对无机氮的24 h去除率均显著高于对照组(P<0.05)，4种填料生物膜对无机氮的去除率依次为悬浮球填料(8.40%±3.29%)>牡蛎壳(6.49%±3.03%)>珊瑚石(4.48%±1.95%)>弹性填料(4.29%±0.21%)。

2.4 不同填料生物膜的微生物群落Alpha多样性

为考察挂膜期间不同填料生物膜的微生物群落变化，对挂膜(20、40、60 d)的填料生物膜样品(TM、TS、TT、TF)进行微生物多样性分析。所有样品的有效OTU数为(4 125±848)～(6 038±445)，测序覆盖度指数均大于0.99，表明样本OTU可以有效表征样本中的微生物群落结构。从表1可见：挂膜期间，弹性填料组Chao 1指数显著变大(P<0.05)，说明弹性填料生物膜的群落丰富度随着挂膜时间延长显著增加；在挂膜40 d时，牡蛎壳和珊瑚石组的Chao 1指数和Shannon指数均显著大于其他两组(P<0.05)，60 d时两组的Chao 1指数和Shannon指数有所下降，说明随着挂膜时间延长，牡蛎壳和珊瑚石生物膜上的优势种群越来越明显，从而导致微生物群落多样性降低。

2.5 不同填料生物膜的微生物群落结构

从图7可见，在门水平上，不同填料生物膜的微生物群落组成大致相同，差异较大的是相对丰度。挂膜期间，4种填料生物膜均以变形菌门(Proteobacteria，相对丰度54.87%～79.99%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，相对丰度3.38%～19.27%)和浮霉菌门(Planctomycetes，相对丰度2.77%～7.02%)为主。除珊瑚石外，硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、硝化刺菌门(Nitrospinae)在其他3种填料生物膜上的相对丰度均随挂膜时间的延长显著增加(P<0.05)；挂膜60 d时，硝化螺旋菌门、硝化刺菌门在珊瑚石生物膜上的相对丰度(0.96%～2.13%)均显著低于其他3种填料生物膜(2.83%～12.47%)(P<0.05)；拟杆菌门在珊瑚石生物膜上的相对丰度(14.00%)显著高于其他3种填料(3.38%～7.77%)(P<0.05)。

本研究中检测到的具有硝化作用的优势菌属有4种，分别为亚硝酸菌属(Nitrosomonas)、硝化螺菌属(Nitrospira)、硝化刺菌属(Nitrospina)和未分类_亚硝化单胞菌科(unclassified_Nitrosomonadaceae)，前3种硝化细菌属在4种填料生物膜上的相对丰度随挂膜时间的延长显著升高(P<0.05)；挂膜期间(20、40、60 d)，悬浮球填料生物膜上亚硝酸菌属的相对丰度总体上显著高于其他3种填料(P<0.05)；挂膜60 d时，4种填料生物膜上硝化细菌属的相对丰度总和依次为悬浮球填料(42.53%)>牡蛎壳(30.50%)、弹性填料(29.30%)>珊瑚石(11.74%)，除牡蛎壳与弹性填料组间无显著差异外，其他组间均有显著性差异(P<0.05)(表2)。

发光杆菌属(Photobacterium，4.99%～53.93%)是填料生物膜上检测到的具有同化性硝酸盐还原作用的优势菌属，其相对丰度随挂膜时间的延长呈先上升后下降的趋势；挂膜60 d时，具有氨化作用的黏液杆菌属(Mucilaginibacter)和固氮作用的苯基杆菌属(Phenylobacterium)在珊瑚石生物膜上的相对丰度均显著高于其他3种填料(P<0.05)，在珊瑚石生物膜上还检测到多种具有反硝化作用的优势菌属，包括青枯菌属(Ralstonia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、噬几丁质菌属(Chitinophaga)和草螺菌属(Herbaspirillum)，其相对丰度均显著高于其他3种填料(P<0.05)；未分类_红杆菌科(unclassified_Rhodobacteraceae)、未分类_黄杆菌科(unclassified_Flavobacteriaceae)和未分类_腐螺旋菌科(unclassified_Saprospiraceae)是一些未归类的具有反硝化作用的菌属，其相对丰度随挂膜时间的延长总体呈下降趋势，在弹性填料生物膜上的相对丰度最高(P<0.05)(表2)。

3 讨论

3.1 不同填料挂膜性能比较

不同材质的填料对生物膜形成时间会产生一定的影响。崔云亮等[22]比较5种生物滤料的挂膜效果时发现，珊瑚砂和红色呼吸环的效果最优。李倩等[4]比较6种生物滤料在淡水养殖尾水的生物膜成熟时间时发现，珊瑚石挂膜所需时间最短(16 d)。宋奔奔等[23]研究发现，海水挂膜的启动时间较长，生物膜成熟需要40～50 d。本研究发现，4种填料在海水养殖尾水的挂膜成熟时间为46～50 d，其中珊瑚石所需时间最短(46 d)，出现该结果的主要原因是珊瑚石表面粗糙且孔隙率较高，对水体中的有机物和细菌有较强的吸附能力，因此，珊瑚石的挂膜速度相对较快[5]。

填料表面微生物群落通过聚集及其代谢产物共同形成生物膜结构，占据了膜系统微生态环境的主要生态位[24]。相关研究表明，弹性填料表面具有较多亲水性基团，适合作为吸附生长缓慢、世代时间较长的硝化细菌载体；悬浮球里面的海绵孔隙率高，比表面积大，使附着在上面的微生物能充分获得养分，从而增加生物量[8，25]。本研究结果表明，弹性填料和悬浮球填料可形成肉眼可见的生物膜，通过扫描电镜可观察到大量微生物附着在填料表面，而牡蛎壳和珊瑚石生物膜形成效果较差，推测可能是由于牡蛎壳表面光滑且表面积小，不利于生物膜的形成，珊瑚石主要是依靠孔隙结构为微生物提供生存空间。

3.2 不同填料脱氮能力比较

不同填料形成的生物膜对含氮污染物的处理能力有所差异。王琳等[26]比较白砂、珊瑚砂、陶粒和菲律宾砂4种填料的硝化速率时发现，珊瑚砂的亚硝化和硝化反应速率均最大。宋协法等[27]研究发现，相同挂膜方式下，悬浮球形滤料处理污水的效果明显优于其他滤料。李倩等[4]比较6种生物填料(火山石、珊瑚石、白色弹性毛刷、蓝色立体弹性填料、多孔组合球和聚乙烯小球)对跑道养殖水体的净化效果时发现，各填料对水体亚硝酸盐氮和氨氮的去除率均在75%以上，其中蓝色立体弹性填料对总氮的去除率最高(19.58%)。本研究发现，不同填料生物膜对氨氮的24 h去除能力依次为悬浮球填料>弹性填料>牡蛎壳>珊瑚石，对亚硝酸盐氮的24 h去除能力依次为珊瑚石>悬浮球填料>弹性填料>牡蛎壳，对硝酸盐氮的24 h去除能力依次为悬浮球填料>牡蛎壳>珊瑚石>弹性填料。总体上，珊瑚石对亚硝酸盐氮的去除效果最好，悬浮球填料对氨氮、硝酸盐氮的去除效果优于其他填料。由此可见，珊瑚石、悬浮球填料是较为理想的生物填料。

此外，本研究中还发现，各种填料生物膜的脱氮能力总体上相对较低，一方面可能与开展试验的水体温度(17～20 ℃)较低有关，另一方面可能是由于相比淡水处理系统，海水环境中的微生物脱氮效率较差。段松青等[28]研究发现，在海水养殖体系挂膜成熟后，亚硝酸盐氧化速率高于氨氧化速率。该结果与本研究结果相似，本研究中在氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮浓度相同的情况下，4种填料生物膜对亚硝酸盐氮的去除率总体上高于氨氮，硝酸盐氮。4种填料生物膜对硝酸盐氮的去除效果较弱，该结果可能与碳源不足、无严格的厌氧环境及系统运行时间较短有关。

由于氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮三者之间可以实现相互转化，因此，本研究中在考察4种填料生物膜对不同含氮污染物的去除能力时，结合无机氮的变化情况进行了分析。在对氨氮的24 h去除试验中，大部分试验组的无机氮去除率出现负值，这可能与水体中的氨氮转化为亚硝酸盐氮和硝酸盐氮，以及填料上的附着物重新溶解到水体有关，最终导致无机氮浓度升高。在对亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的24 h去除试验中，部分试验组的无机氮含量显著下降，推测可能是由于海水养殖尾水处理系统中除了有硝化过程的建立，还存在短程反硝化和同步反硝化过程；反硝化细菌将硝酸盐氮中的氮通过一系列生物化学反应将中间产物还原为含氮气体挥发到空气中，致使水体中的氮损失[28]。

3.3 填料生物膜上脱氮功能菌群分析

环境中的氮素主要通过氨化、硝化和反硝化三步反应实现脱氮。生物脱氮主要依靠天然脱氮微生物菌群和其他辅助微生物实现脱氮目标，脱氮生物体系复杂[29]。AOB(氨氧化细菌)和NOB(亚硝酸盐氧化菌)是养殖尾水生物脱氮过程中关键的功能性细菌，协同发挥硝化作用[30]。硝化作用分两个阶段：第一阶段为亚硝化，即将氨氮氧化为亚硝酸盐氮的阶段，主要由AOB完成，AOB包括亚硝酸菌属、亚硝化叶菌属(Nitrosolobus)、亚硝化弧菌属(Nitrosovibrio)、亚硝化球菌属(Nitrosocuccus)和亚硝化螺菌属(Nitrosospira)等；第二阶段为硝化，即将亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮的阶段，主要由NOB完成，NOB包括硝酸杆菌属(Nitrobacter)、硝化球菌属(Nitrococcus)、硝化螺菌属和硝化刺菌属[31-32]。其中，AOB的氨氧化过程通常被认为是一个由变形菌门中一小部分细菌类群所进行的专性好氧的化能自养过程，主要以亚硝酸菌属和亚硝化螺菌属这两种居多，高氨氮浓度环境下更易导致亚硝酸菌属成为占主导地位的唯一优势种[19]。NOB是硝化菌门下的菌属，具有较强的代谢活性和对基质的亲和力，是主要的硝化微生物群落和脱氮关键微生物[33]。本研究中，在4种填料生物膜上检测到的AOB为变形菌门下的亚硝酸菌属，NOB为硝化螺旋菌门下的硝化螺旋菌属及硝化刺菌门下的硝化刺菌属。挂膜期间填料生物膜上AOB的相对丰度始终高于同期的NOB，出现该结果推测可能是由于水体中氨氮浓度较高导致AOB成为优势菌属。挂膜60 d时，AOB在填料生物膜上的相对丰度从高到低依次为悬浮球填料>牡蛎壳、弹性填料>珊瑚石，结合不同填料对氨氮的24 h去除能力(从高到低依次为悬浮球填料>弹性填料>牡蛎壳>珊瑚石)分析发现，填料生物膜对氨氮的去除能力与AOB的相对丰度呈一定的正相关。

同化硝酸盐还原(ANRA)、异化硝酸盐还原(DNRA)和反硝化作用均可还原这是废水处理中生物脱氮的重要途径。ANRA途径可在有氧环境下通过同化型硝酸盐还原酶将硝酸盐氮还原成亚硝酸盐氮和氨，并转化为氨基酸供自身利用[34]。本研究中，填料生物膜上检测到的同化硝酸盐还原菌为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)下的发光杆菌属，且在挂膜期间始终维持较高的相对丰度，推测当水体中的硝酸盐氮积累到一定程度时，发光杆菌属逐渐成为优势菌属，以促进硝酸盐氮的进一步转化。

近年来，随着对反硝化菌研究的不断深入，发现具有反硝化能力的微生物种类越来越多。研究表明，变形菌门是反硝化细菌最常见的菌门，其中，α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)是最常见的nirK型反硝化细菌类群之一，β-变形菌纲(Betaproteobacteria)和γ-变形菌纲是nirS型反硝化细菌中最常见的菌纲[35]，其中，γ-变形菌纲下的假单胞菌属是已知反硝化菌中最大的分类群之一，该属中的多个种已被作为研究反硝化过程的模式菌株[36]。拟杆菌门下具有反硝化作用的菌属包含黄杆菌纲(Flavobacteria)和鞘氨醇杆菌纲(Sphingobacteria)，其中，鞘氨醇杆菌纲下的腐螺旋菌科(Saprospiraceae)是一种可分泌胞外聚合物，代谢葡萄糖、半乳糖和醋酸盐等的除磷菌，其胞外聚合物可以降低污泥的沉降性能[21]。本研究中，填料生物膜上检测到变形菌门和拟杆菌门下多种具有反硝化作用的优势菌属，其中，包含α-变形菌纲下的苯基杆菌属、未分类_红杆菌科，β-变形菌纲下的草螺菌属、青枯菌属，γ-变形菌纲下的假单胞菌属，黄杆菌纲中的未分类_黄杆菌科，以及鞘氨醇杆菌纲中的噬几丁质菌属、黏液杆菌属、未分类_腐螺旋菌科[37]。总体上，珊瑚石生物膜上的反硝化菌属种类多且相对丰度大，这进一步解释了珊瑚石生物膜对亚硝酸盐氮具有高效去除能力的原因。尽管珊瑚石生物膜上的NOB相对丰度较低，但其通过多种反硝化菌属的协同作用，将亚硝酸盐氮转为含氮气体排出水体，有效地实现了水体中氮的去除。

此外，本研究中填料生物膜上还存在许多未分类及未知的菌群，且相对丰度较大，这些菌群在维持水体氮平衡中同样可能发挥重要作用。由此可见，不同的功能微生物通过自身不同的氮代谢调控途径和生理功能特征，促进填料生物膜的形成，从而提高生物膜对海水养殖尾水的脱氮能力。

4 结论

1)本研究中考察了牡蛎壳、珊瑚石、弹性填料、悬浮球填料4种填料自然挂膜情况，挂膜成熟时间需要46～50 d，其中，珊瑚石所需时间最短(46 d)。扫描电镜结果显示，弹性填料、悬浮球填料的微生物附着量较多，且以杆状细菌为主。

2)对比4种填料生物膜对氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的24 h去除能力发现，悬浮球填料对氨氮和硝酸盐氮的去除效果最好，珊瑚石对亚硝酸盐氮的去除效果最强。

3)微生物群落结构分析表明，随着挂膜时间延长，弹性填料生物膜上的细菌丰度显著增加，牡蛎壳和珊瑚石生物膜上的细菌多样性显著下降。不同填料生物膜的细菌均以变形菌门、拟杆菌门为主，亚硝酸菌属、硝化螺菌属、硝化刺菌属和未分类_亚硝化单胞菌科是填料生物膜上具有硝化作用的优势菌属，假单胞菌属、青枯菌属、噬几丁质菌属和草螺菌属等反硝化菌属在珊瑚石生物膜上的相对丰度最大。

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Analysis of denitrification capacity and microbial community of biofilms with different fillers in mariculture wastewater

CHEN Xiaohong，XU Yibin，LIN Yongqing，QIU Denggao，JIANG Shuangcheng，ZHENG Huidong*

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，National and Local Joint Engineering Research Center of Marine Biological Seed Industry Technology，Fujian Fishery Research Institute，Xiamen 361013，China)

Abstract：To investigate the nitrogen removal capacity of different filler-biofilms in mariculture tail water, biofilters were constructed by the addition of oyster shells (M), coral stones (S), suspended ball fillers (F), elastic fillers (T), and without any filler as control (C), respectively. The formation speed and the biomass of biofilms as well as the nitrogen removal capacity of the biofilms at 24 hours were compared, while the changes in microbial community structure of the biofilms on biofilters were analyzed using Illumina Miseq high-throughput sequencing technology during biofilms formation period(20th day, 40th day, and 60th day). The different filler-biofilms were found to required 46-50 days for mature, with most rapid formation of the coral stone filler biofilm. Scanning electron microscopy showed that the biofilms on elastic filler and suspended ball filler had more biomasses than the other two fillers, largely consisting of rod-shape bacteria. The analysis of nitrogen removal capacity at 24 hours showed that there was the maximal removal rate of ammonia nitrogen and nitrate nitrogen by suspended ball fillers, and that the maximal removal rate of nitrite nitrogen by coral stone, which were (68.66%±6.27%), (6.73%±3.41%), and (99.99%±0.00%), respectively. The analysis of microbial community diversity revealed that the abundance of bacteria on elastic filler biofilms was increased, while the diversity of bacteria on oyster shell and coral stone biofilms was decreased significantly with the prolongation of biofilms formation time (P<0.05). The dominant microfloras of biofilms with different fillers were shown to be Proteobacteria and Bacteroidetes at the phylum level. The relative abundances of Nitrospirae and Nitrospinae were increased with the extension of biofilms formation time. Nitrosomonas, Nitrospira, Nitrospina and unclassified_Nitrosomonadaceae were the dominant bacteria with nitrification on different filler-biofilms at the genus level. The descending order of relative abundance of nitrifying bacteria at 60th day was described as: suspended ball fillers (42.53%)> oyster shells (30.50%), elastic fillers (29.30%)> coral stones (11.74%)(P<0.05). The relative abundance of denitrification bacteria, such as Pseudomonas, Ralstonia, Chitinophaga and Herbaspirillum, were higher on the biofilms of coral stone than on other filler-biofilms. The findings indicated that coral stone and suspended ball filler as ideal fillers were favorable to enrichment of nitrogen removal bacteria, and had better denitrification ability for mariculture wastewater.

Key words：mariculture wastewater; filler; biofilm; denitrification capacity; microbial community

收稿日期：2023-06-28

基金项目：福建省海洋与渔业结构调整专项(2021HYJG12，2021HYJG08)；福建省省属公益类科研院所基本科研专项(2022R1013005)

作者简介：陈小红(1987—)，女，助理研究员。 E-mail：cxh870319@163.com

通信作者：郑惠东(1976—)，男，副研究员。E-mail：364145414@qq.com

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2023-153

文章编号：2095-1388(2024)01-0009-11

中图分类号：S 959；Q 938

文献标志码：A