臭氧对水产养殖尾水嗜水气单胞菌的杀灭效果

随着中国规模化、集约化水产养殖业的迅速发展，养殖水体富营养化和病害高发成为制约水产养殖业健康发展的重要因素[1]。高密度养殖过程中产生的残饵、动物残体和代谢废物等导致养殖水体中无机盐、有机物含量增加，为水体中细菌的生长繁殖提供了有利条件[2]，细菌性病害在水产养殖中特别是在密集型养殖系统中频频发生。传统的养殖水体消毒主要依靠抗生素及消毒剂，但长期使用后会导致病菌抗药性提升，病害问题最终无法彻底解决。为更好地解决病害问题，在不损害人们身体健康的同时，亟需一种高效、清洁的消毒方式。

嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科[3]，是细菌性败血症的主要病原体，也是常见的人-兽-鱼共患病病原菌，在自然界尤其水体中广泛分布。随着抗菌药物的主动使用和被动暴露，耐药菌株迅速增加。此外，嗜水气单胞菌形成的生物膜限制了抗生素的抗菌作用，该细菌多重耐药问题日益突出[4]，由其引起的细菌性败血症已成为水产养殖业的重要问题。然而，水产养殖中对于嗜水气单胞菌杀灭效果的研究较少。

臭氧是一种高效的消毒剂，有强氧化性，臭氧灭菌具有高效性、高清洁性和高经济性的特点。臭氧消毒技术相对完善，臭氧产业具有一定规模[5]，在水产养殖尾水循环利用中前景广阔。臭氧水的灭菌速度很快[6]，通入臭氧18 min，可将养殖水体中的细菌全部杀灭，期间臭氧平均质量浓度仅为0.03 mg/L；当臭氧质量浓度稳定在(0.05±0.01)mg/L时，将鱼放入臭氧水中，发现其鳃和皮肤黏液内的细菌分别在60、90 min时被杀灭[7]。臭氧在养殖水处理中，除用于灭菌外，还可用于去除有机废物、氧化亚硝酸盐及氨氮。陈萍等[8]研究发现，臭氧在大菱鲆(Scophthalmus maximus)亲鱼养殖回用水系统中的灭菌率可达51.82%，对氨氮和亚硝酸氮的平均去除率达56.30%。然而，关于养殖生物常见致病菌，如嗜水气单胞菌的杀灭效果及剂量问题尚未见报道。利用臭氧消毒灭菌时，臭氧浓度不宜过高。张延青等[9]研究臭氧处理海水生成氧化物对小球藻(Chlorella spp.)生长的影响时发现，在臭氧生成氧化物质量浓度大于1.036 mg/L时小球藻大量死亡，质量浓度为2.364 mg/L时小球藻全部死亡。郑锦滨等[10]研究表明，高质量浓度臭氧(0.30 mg/L)对石斑鱼(Epinephelus coioide)的胚胎发育有一定影响，会造成胚胎油球数目增多、萎缩、解体和死亡，初孵仔鱼对臭氧更加敏感，0.05 mg/L的臭氧处理24 h也会导致初孵仔鱼全部死亡。此外，臭氧不易溶于水，在水中易分解，且污水中的有机物也会导致臭氧消耗增加，这些都将导致臭氧消毒成本随之升高[11]。过量的臭氧不但会使其经济效益下降，而且残留的臭氧易与再生水中的溴离子、有机物等污染物发生化学反应，产生溴酸盐等消毒副产物[12]。

本研究中探究了臭氧水浓度和胁迫时间对嗜水气单胞菌的杀灭效果，筛选适宜的臭氧消毒剂量和作用时间，以期为改善臭氧消毒工艺、优化养殖尾水高效消毒技术提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用嗜水气单胞菌购自北纳生物公司；平板计数琼脂(PCA)、营养肉汁培养基(NA/NB)均购自广东环凯微生物科技有限公司；1×PBS缓冲液(0.01 mol/L ，pH 7.2～7.4)购自北京索莱宝科技有限公司；单过硫酸氢钾消毒粉购自连云港永荣生物科技有限公司。试验用养殖尾水取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心养殖池塘。10G型 OZ-004臭氧发生器购自青岛宁鑫设备净化有限公司。

1.2 方法

1.2.1 中止剂试验在臭氧灭菌性能研究中，为了能够准确检测出规定灭菌时间内体系中残存的嗜水气单胞菌数量，需使用中止剂消除试验中残留的臭氧或过硫酸氢钾，使其失去对试验菌的抑制、杀灭作用。

臭氧水中止剂试验中，选取含10 g/L 硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲溶液作为中止剂，对6个试验组进行活菌培养计数[13](表1)。

过硫酸氢钾中止剂试验中用1 600 mg/L过硫酸氢钾替换11.4 mg/L臭氧水，组别设计与其他操作步骤与臭氧水中止剂试验相同。

1.2.2 通过曝气时间确定臭氧浓度的试验臭氧在水相中不稳定，其浓度会受多种因素的影响而发生变化，且降解速度快，不易保存。故用臭氧曝气时间反映臭氧浓度。通过控制臭氧曝气时间制备出不同浓度的臭氧水，臭氧曝气时间分别设置为10、20、30、40、50、60 min。

臭氧水浓度的测定：根据标准GB 28232—2020，采用碘量法测定臭氧水浓度，所用试剂的制备根据标准CJ/T 322—2010进行，曝气后的臭氧水直接用于试验，现用现配。

1.2.3 臭氧浓度对嗜水气单胞菌的灭活效果试验试验分为试验组和阳性对照组。试验组：吸取1 mL菌悬液分别加入曝气10、20、30、40、50、60 min的99 mL臭氧水中混匀，此为样液A，2 min后加入中止剂终止反应，作用10 min后取0.5 mL样液A，加入4.5 mL缓冲液进行10 倍梯度倍比稀释，从每个稀释度吸取0.1 mL稀释液涂布于平板，计算细菌总数[14]。阳性对照组，用稀释液代替臭氧水完成上述操作。每组试验设置3个重复，记录每组试验的活菌浓度(CFU/mL)。

1.2.4 臭氧胁迫时间对嗜水气单胞菌的灭活效果试验根据上述试验确定臭氧水曝气时间，在此条件下设计以时间为单因素的试验，试验操作步骤同上，分别将时间控制在0、2、4、6、8、10 min 下进行臭氧水灭菌试验，由此确定最佳作用时间。平均灭菌率计算公式为

平均灭菌率=[(对照组菌落数-处理后残存菌落数)/对照组菌落数]×100%。

1.2.5 过硫酸氢钾浓度对嗜水气单胞菌灭活效果试验过硫酸氢钾溶液质量浓度分别设为50、100、200、400 mg/L。试验操作步骤与“1.2.3节”相同，灭菌时间为“1.2.4节”确定的最佳作用时间。

1.2.6 臭氧最优剂量对养殖尾水的灭菌效果配制嗜水气单胞菌含量为 1×103～3×103、1×105～3×105 CFU/mL的养殖尾水，分别模拟高致病风险养殖尾水和致病养殖尾水。试验操作步骤将“1.2.3节”菌悬液换为养殖尾水，其余相同，臭氧灭菌浓度与“1.2.4节”相同，灭菌时间为“1.2.4节”确定的最佳作用时间。

2 结果与分析

2.1 中止剂试验结果

从表2可见：第1组中的菌落数少于第2组；第2组中的菌落数少于第3、4、5组，而第3、4、5组中的菌落数差异不明显；第6、12组中无菌落生长。这表明，含10 g/L硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲溶液能够有效中和臭氧水和过硫酸氢钾溶液，并且中止剂不影响细菌的正常生长活动。因此，将10 g/L硫代硫酸钠作为本试验的中止剂使用。

2.2 不同曝气时间对臭氧浓度的影响

从图1可见，臭氧浓度随曝气时间的增加而升高，曝气10～20 min时臭氧浓度升高速度最快，由1.2 mg/L上升至4.8 mg/L，曝气20 min后臭氧浓度上升速度变缓，60 min时臭氧浓度为11.4 mg/L。

2.3 臭氧对嗜水气单胞菌的灭活效果

2.3.1 不同臭氧浓度下的灭菌效果使用不同浓度臭氧水处理平均含菌量分别为6.4×105、7.5×106、1.5×107、3.2×108 CFU/mL的嗜水气单胞菌菌悬液，作用2 min后培养计数(表3)。

在臭氧胁迫时间(2 min)一定的条件下，随着臭氧浓度的增加，其灭菌效果逐渐增强；随着含菌量的增加，灭菌效果逐渐减弱；当臭氧曝气10 min，即臭氧质量浓度为1.2 mg/L时，臭氧对4个浓度嗜水气单胞菌的灭菌率从92.66%降低至79.58%；当臭氧曝气20 min，即臭氧质量浓度为4.8 mg/L时，对4个浓度嗜水气单胞菌的灭菌率均达到100%；当臭氧质量浓度从1.2 mg/L增加到4.8 mg/L时，灭菌率最多提高20.42%(表3)，说明臭氧浓度对灭菌效果影响较大。故选用曝气10 min，即臭氧质量浓度1.2 mg/L为较佳灭菌浓度，用于后续研究臭氧胁迫时间对灭菌效果影响。

2.3.2 不同臭氧胁迫时间下的灭菌效果在臭氧质量浓度(1.2 mg/L)一定的条件下，随着臭氧胁迫时间的延长，灭菌率逐步提高，灭菌效果亦越好；随着含菌量的增加，灭菌效果在2 min时逐渐减弱，4 min之后，对4个浓度嗜水气单胞菌的灭菌率均有升高且水平接近；4 min之前，臭氧灭菌率随作用时间延长而快速升高，6 min后，灭菌率最低达99.96%，灭菌率的变化趋于平缓，故选用6 min作为最佳作用时间(表4)。

2.4 过硫酸氢钾对嗜水气单胞菌的灭活效果

在作用时间(6 min)一定的条件下，随着过硫酸氢钾浓度的增加，其灭菌效果也逐渐增强；随着嗜水气单胞菌浓度的增加，低浓度的过硫酸氢钾灭菌效果逐渐降低；当过硫酸氢钾质量浓度为100 mg/L时，对低浓度菌液的灭菌率能达到100%，而对高浓度菌液的灭菌率只有2.33%；当过硫酸氢钾质量浓度为400 mg/L时，对4个浓度嗜水气单胞菌的灭菌率均达到100%(表5)。

2.5 臭氧最优剂量处理养殖尾水的灭菌效果

使用质量浓度为1.2 mg/L臭氧水处理不同浓度的含菌养殖尾水，作用6 min后，两种含菌养殖尾水中的嗜水气单胞菌从初始的(2.3±0.5)×103、(2.7±0.3)×105 CFU/mL均降为0，灭菌率皆可达100%，表明该剂量在实际应用中效果良好。

3 讨论

3.1 臭氧对嗜水气单胞菌的杀灭效果

随着养殖技术的提高及高效率大规模养殖模式的不断推广，水产养殖中的细菌和病毒数量也在逐年增长，对水产养殖业造成了较大的经济损失[15]。嗜水气单胞菌是淡水鱼细菌性败血症的主要致病菌，其所致疾病在全国各淡水养鱼地区都需重点防控[16]。在水产养殖污染治理模式中消毒是不可缺少的一环。一方面，消毒剂可杀灭水体中的病原微生物，降低鱼类感染的风险，减少鱼病的发生，并能调节水质[17]；另一方面，消毒产品对水产动物均具有一定刺激性，还会被鱼类直接或间接吸收，并对动物器官造成一定损伤，甚至功能性破坏。研究表明，暴露于次氯酸钠7 d会造成鳎多种病变，腮上皮细胞增生，杯状细胞数量和体积增大，甚至引起炎症反应[18]。二溴海因浓度的上升会使吉富罗非鱼幼鱼肝胰脏组织损伤程度加深，中央静脉淤血，肝血窦淤血逐渐加剧[19]。因此，选择合适的消毒剂并控制使用量十分重要。臭氧消毒的广谱性、高效性和清洁性，使其在生鲜蔬菜[20]、住宅供水[21]和医疗仪器[22]等领域应用广泛，而关于臭氧消毒在水产养殖尾水中的应用研究较为少见。

本研究中，通过曝气时间获得不同臭氧浓度的臭氧水，在曝气初期，臭氧浓度上升缓慢，这可能是臭氧在水相中不稳定易分解到气相中，由于是近似密闭的空间，随着曝气时间的延长，臭氧浓度上升加快，曝气10～20 min时上升速率最大，此时臭氧质量浓度为4.8 mg/L；臭氧曝气后期，臭氧上升速率下降，曝气50～60 min与初期速率相同，这可能与臭氧在水中的饱和度有关，同时也可能与不同臭氧浓度在水中分解速率不同有关[13]。用臭氧水杀灭嗜水气单胞菌的过程中，臭氧水质量浓度分别设为1.2、4.8、6.6、8.6、10.2、11.4 mg/L，胁迫时间分别设为2、4、6、8、10 min，结果表明，臭氧对不同浓度嗜水气单胞菌均有较好的杀灭效果，用1.2 mg/L的臭氧水处理嗜水气单胞菌6 min，灭菌率最低能达到99.96%。这与高梦莎[14]用1.2 mg/L臭氧水作用1 min使108 CFU/mL副溶血性弧菌全部失活的研究结果相似。灭菌率的不同可能是由于菌种的不同，也可能与菌密度有关。本研究中，随着菌液浓度的增加灭菌效果下降，随着胁迫时间的延长灭菌率逐步提高，当胁迫时间达到6 min时，对各浓度嗜水气单胞菌的灭菌率均能达到99.96%，可见臭氧短时间灭菌效果明显。在实际应用中，本研究中的臭氧最佳使用剂量灭菌效果良好，对于常见养殖尾水中嗜水气单胞菌浓度，可以达到100%的灭菌率。

3.2 臭氧水与过硫酸氢钾灭菌效果比较

单过硫酸氢钾(KHSO5)也称“过一硫酸氢钾”(PMS)，目前常以过硫酸氢钾复合盐(KMPS)的形式应用[23]。过硫酸氢钾复合物对pH有较宽的适应范围，当pH ≥ 6.5时，灭菌效率高于含氯消毒剂[24]。在给水消毒过程中，0.5 mg/L过硫酸氢钾复合盐接触30 min可杀灭水中69%的细菌[25]，投加量增至2.0 mg/L时，尽管对大肠杆菌的灭活率为99.99%，但无法杀灭悬液中枯草芽孢杆菌的芽孢[26]；而臭氧灭菌具有广谱性，可杀灭细菌繁殖体、芽孢、真菌和病毒。本研究中，50 mg/L过硫酸氢钾复合盐对各浓度嗜水气单胞菌作用6 min时的灭菌效果不明显，灭菌率为2.33%～29.69%；100 mg/L过硫酸氢钾复合盐对各浓度嗜水气单胞菌灭菌效果差异明显，灭菌率为33%～100%，这可能与菌种浓度有关，对低浓度嗜水气单胞菌有较好的灭菌效果，而对高浓度嗜水气单胞菌的灭活效果不明显；当浓度增加到200 mg/L后，灭菌效果迅速上升，灭菌率达到80.00%～100%；当浓度增加到400 mg/L 时，灭菌率均已达到100%。与过硫酸氢钾复合盐相比，臭氧灭菌展现出更强的高效性，对各浓度嗜水气单胞菌均有良好的灭菌效果，受菌种浓度影响较小。水产养殖尾水具有排放时间集中、单次排放量大的特点，随着养殖规模的扩大和尾水量的增加，制备一套臭氧消毒系统除了灭菌效果更强外，相比于一次性投加过硫酸氢钾，可以重复使用的臭氧消毒系统会有更好的经济效益。随着水产养殖模式机械化加深、尾水处理工艺一体化加快，臭氧消毒比投加过硫酸氢钾更符合绿色高质量渔业发展目标。

3.3 臭氧应用前景展望

臭氧消毒不仅能够高效杀灭致病菌，还可以降低溶解性有机碳、氨氮和亚硝酸盐，且不会形成有毒氧化剂[27]。然而，臭氧稳定性差，其消毒效果受水质影响较大，且会与尾水中悬浮物反应从而降低灭菌效果[28]。在水产养殖尾水达标排放或循环利用治理中，通常会采用过滤沉降等方式去除悬浮物，减小对臭氧消毒的影响。如采用“三池两坝”多级组合工艺处理，养殖尾水首先进入沉淀池进行沉淀预处理，以去除其中大的悬浮颗粒物[29]。紫外线/臭氧组合工艺是将臭氧(O3)和紫外(UV)相结合的一种高级氧化技术，该工艺具有强氧化性，可用于水中有机污染物的去除、微生物的灭活等[30]。但随着时间的不断推移，紫外线的去除效果会渐渐下降，主要是因为水中存在的颗粒物容易吸收紫外线，而臭氧的存在可以避免这一问题的出现，因为臭氧可以去除有机物，紫外线和臭氧有协同作用效果，去除率更高[31]。王行等[33]研究表明，在循环水养殖鳗鲡中，紫外线和臭氧工艺有效杀灭了水中微生物和细菌等，对细菌的去除率达99.9%。在紫外线和臭氧的双重作用下，可以实现较好的细菌去除效果。从长远来看，臭氧灭菌有助于建立低成本和高效率的新消毒方法，并在养殖尾水循环利用的灭菌环节中产生广阔的应用前景。

4 结论

1)臭氧对含菌量为6.4×105～3.2×108 CFU/mL的嗜水气单胞菌悬液均有一定灭菌效果，臭氧浓度越高、作用时间越长，灭菌效果越好。臭氧消毒最佳效果为臭氧质量浓度1.2 mg/L，作用时间6 min，在此条件下对低浓度嗜水气单胞菌的灭菌率为100%，对高浓度菌悬液的灭菌率也能够达到99.98%，对含菌浓度分别为(2.3±0.5)×103、(2.7±0.3)×105 CFU/mL的养殖尾水灭菌率均可达100%。

2)与消毒剂过硫酸氢钾复合盐相比较，用臭氧消毒不仅能有更强的高效性，还能提高增氧效率，这为臭氧消毒在水产养殖尾水循环利用中的实际应用提供了数据支持。

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