淡水养殖池塘经常会发生水体富营养化的现象，同时在外界环境、放养密度等综合作用下，极易引起水体蓝藻生物量升高从而暴发蓝藻水华[1]。蓝藻水华是世界范围的水环境问题，其本身会产生大量有害的蓝藻毒素，能引起水环境恶化进而降低水生态系统生物多样性[2]。微囊藻毒素(microcystins，MCs)是蓝藻毒素中危害最大、分布最广的一类环状七肽化合物，具有明显的肝毒性，可通过有机阴离子转运蛋白使MCs进入肝细胞，并在肝脏中蓄积[3]。有研究表明，MCs能诱导机体活性氧含量升高[4]，并对生物膜磷脂造成影响，产生脂质过氧化反应，从而促进丙二醛(MDA)等脂质过氧化物形成[5]，同时会造成抗氧化酶活性变化，最终引起细胞损伤[6]。Lin等[7-8]研究发现，雄性斑马鱼(Danio rerio)暴露于慢性MC-LR(0、0.4、2、10 μg/L)30 d后，会诱导血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1β(IL-1β)两种促炎因子水平较清水组显著提高，同时成年斑马鱼暴露于慢性MC-LR 60 d后，配对产生的F1代胚胎中TNF-α、IL-1β等促炎因子水平表达较清水组F1代上升。MCs能引起肝细胞过磷酸化，从而导致肝细胞处于过氧化状态，同时会诱发慢性炎症并伴有跨代效应。因此，当鱼体或环境中MCs达到一定浓度时，会降低鱼类的产量与品质，破坏鱼类栖息地，影响鱼类群落结构与物种多样性，甚至会通过食物链对人体造成损害[9]。
大鳞副泥鳅(Paramisgurnus dabryanus)是中国淡水养殖鳅类的主要种类之一。高密度集约化养殖环境下，极易暴发蓝藻水华产生MCs污染，而泥鳅作为底栖杂食性鱼类，可通过摄食沉入水底的有毒蓝藻或捕食以有毒蓝藻为食的浮游动物等方式导致MCs在体内蓄积[10]。目前，MCs暴露对泥鳅的危害研究主要集中在胚胎发育、幼鱼毒害效应，以及成鱼口服亚慢性微囊藻水华浮沫对其生长、肝脾损伤和肌肉毒素蓄积等方面[10]，但未见关于泥鳅抗氧化防御及致炎因子表达对MCs胁迫响应的报道。
连翘脂素(phillygenin，PHI)又称连翘苷元，是传统中药连翘的主要有效成分之一，并被用作连翘质量控制的标志物[11]。已有研究发现，PHI对肝脏具有抗氧化、抗炎等药理作用。Wang等[12]研究发现，PHI能够维持小鼠肠道菌群微生物多样性，并对CCl4诱导的小鼠炎症及肝纤维化具有保护作用。Hu等[13]研究发现，脂多糖(LPS)可诱导人肝星状细胞(LX-2)出现炎症和纤维化现象，PHI可以降低LX-2细胞的TNF-α、IL-1β等促炎症因子水平，减缓LX-2细胞活化，抑制纤维化细胞因子及TLR4/MyD88/NF-КB信号通路中的蛋白表达。Ma等[14]研究发现，PHI能够通过抑制m125巨噬细胞外分泌体miR-1b-125p的过表达及M1巨噬细胞极化来降低肝星状细胞(HSC)活化，从而减轻肝纤维化。冯芹等[15]研究发现，PHI对CCl4诱导大鼠急性肝损伤具有保护作用，该作用与其增加肝组织中抗氧化酶活性、减轻脂质过氧化水平及降低TNF-α、IL-8等促炎因子水平有关。Zhou等[16]研究发现，PHI能改善小鼠的肝损伤，抑制脂肪变性和炎症反应。以上研究表明，PHI在人及小鼠、大鼠等动物上均有肝脏保护作用，但PHI在水产养殖业中的应用未见相关报道。
本研究中，以大鳞副泥鳅为试验对象，从肝脏组织病理与生理功能损伤、氧化损伤和炎症反应等方面探究了PHI对亚慢性毒性浓度MCs暴露诱导肝脏损伤的保护作用，以期为寻找安全、健康、绿色和有效的MCs解毒剂提供有益参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用大鳞副泥鳅体质量为(100.13±5.23)g，体长为(20.39±1.91)cm，购自北京市平谷区某泥鳅养殖场。泥鳅放入暂养池前用10 g/L聚维酮碘溶液浸泡消毒25 min，暂养7 d后用于后续试验。以微囊藻(Microcystis)为优势属的水华蓝藻采自天津某水产养殖有限公司大口黑鲈养殖池塘，使用孔径为75 μm的筛绢网收集藻泥，将藻泥冷冻干燥处理获得藻粉，藻粉中MCs的提取与测定参照王雪莹等[17]的底泥中毒素测定方法。将含有3种主要MC异构体(MC-LR、MC-YR和MC-RR)粗提液配制成质量浓度为200 μg/mL的MCs母液用于攻毒。PHI购自北京索莱宝科技有限公司(HPLC≥98%)，选用体积分数为10%的HS-15(15-羟基硬脂酸聚乙二醇脂)作为PHI的助溶剂，Kolliphor®HS 15购自上海协泰化工有限公司。
1.2 方法
1.2.1 大鳞副泥鳅MCs亚慢性毒性浓度的测定 参考李效宇等[10]方法，以96 h LD50浓度的1/10作为MCs亚慢性毒性浓度。96 h LD 50浓度的测定方法：以腹腔注射染毒方式观察泥鳅对不同剂量MCs(0、25、63、158、398、1 000 μg/kg体质量，下同)的敏感性，每组7尾鱼。急性毒性试验为期4 d，每天记录泥鳅的死亡情况。参照寇氏法(Karber)[18]计算泥鳅的96 h LD50浓度，即
lgLD50=Χa-i(∑p-0.50)。
式中：Χa为试验组最大剂量的对数(lg)；i为相邻组浓度对数之差；p为各组的死亡率。
1.2.2 PHI对MCs攻毒后泥鳅肝脏损伤影响的试验 试验共分6组，每组3个网箱，每个网箱放置10尾鱼。具体分组如下：对照组[生理盐水+1 mL/(kg·d) HS-15]、MCs组[MCs粗提液+1 mL/(kg·d) HS-15]、0.3 mg/kg PHI组[MCs粗提液+0.1 mg/(kg·d) PHI]、0.6 mg/kg PHI组[MCs粗提液+0.2 mg/(kg·d) PHI]、1.2 mg/kg PHI组[MCs粗提液+0.4 mg/(kg·d)PHI]和2.4 mg/kg PHI组[MCs粗提液+0.8 mg/(kg·d) PHI]。攻毒及给药方法如下：将泥鳅分别放入养殖网箱(1 m×1 m×1 m，网目孔径为425 μm)中空腹暂养1 d；入网箱第2天，除对照组腹腔注射10 mL/kg生理盐水外，其余各组均腹腔注射17 μg/kg MCs粗提液；入网箱第3、4、5天给药组分别注射不同浓度的PHI，累积剂量分别为0.3、0.6、1.2、2.4 mg/kg，对照组和MCs组每天注射1 mL/kg体积分数为10%的HS-15。试验期间，养殖水温为22.0 ℃，pH为7.9～8.0，DO为6～7 mg/L。
1.2.3 样品采集及指标分析 入网箱第6天时，从每个网箱取7尾泥鳅，将泥鳅放入滴有丁香油(30滴/100 L)的水中麻醉后，置于冰块上解剖取出肝脏，用预冷的生理盐水冲洗肝脏样品后吸干水分，称重后除用于切片的样本外，其余样品均置于低温液氮中保存。其中，从每组取3尾鱼用于制作切片，取9尾鱼用于酶活性测定，取9尾鱼用于炎性因子水平测定。
肝脏组织切片的制备：肝脏经固定(质量分数为4%多聚甲醛)，脱水与透明，浸蜡与包埋，切片、展片与烤片，脱蜡与HE 染色，制备组织切片，在扫描显微镜(Motic BA600Mot)下观察肝脏的组织病理学变化。
肝脏丙二醛含量及相关酶活性的测定：向肝脏组织中加入9倍量预冷的生理盐水进行充分冰浴匀浆，以2 000 r/min离心10 min后取上清液，采用南京建成生物工程研究所相应试剂盒测定总蛋白(TP，考马斯亮蓝法)含量、ALT活性(赖氏法)、MDA含量(TBA法)、SOD活性(WST-1法)、GSH-PX活性(紫外吸收法)和GR活性(紫外吸收法)。
肝脏炎性因子水平测定：向肝脏组织中添加10倍量预冷的PBS缓冲液(pH 7.4)进行充分冰浴匀浆，以2 000 r/min 离心20 min，取上清液，采用上海酶联生物科技有限公司试剂盒(双抗体夹心法)测定IL-1β和TNF-α水平。
1.3 数据处理
试验结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 不同浓度MCs攻毒下泥鳅的症状及死亡情况
腹腔注射MCs 12～24 h时，除对照组和25 μg/kg MCs组外，其余MCs剂量组泥鳅均出现无规则游动和鳃部呼吸加快现象；24～96 h时，部分泥鳅行动变慢、呼吸减缓，失去平衡并出现垂直静置或仰卧状态，同时伴有短时间上下窜跃、翻转现象。除对照组和25 μg/kg MCs组外，其余MCs剂量组泥鳅不同程度地出现死亡。泥鳅死亡后，体表发黑，出现黏液脱落，个别鱼体腹部出现红肿溃烂症状。解剖后发现，腹部肿胀有积水现象，肝脏失去光泽，其颜色从中心向边缘逐渐变浅。计算得MCs对泥鳅的96 h LD50为169.82 μg/kg(表1)，将96 h LD50的1/10即17 μg/kg作为PHI对MCs诱导大鳞副泥鳅肝脏损伤保护作用研究的亚慢性毒性浓度进行后续试验。
表1 MCs毒力评价
Tab.1 Evaluation of MCs toxicity
注:相邻浓度对数之差为0.40。
Note: The difference between adjacent concentration logarithms is 0.40.
MCs/(μg·kg-1)样本数/ind.numberlg(MCs)死亡数/ind.number of death死亡率/%mortality96 h LD50/(μg·kg-1)07—002571.40006371.8034315872.20343169.8239872.604571 00073.007100
2.2 PHI对亚慢性毒性浓度MCs攻毒后泥鳅肝脏组织结构的影响
显微观察发现，对照组泥鳅肝细胞内部形态结构完整，肝细胞排列紧密有序且轮廓清晰，细胞核大多位于细胞中央，肝脏内有轻微水样空泡现象，单位数量肝细胞水样空泡约30%(图1A)；与对照组相比，腹腔注射亚慢性毒性浓度MCs会使肝脏中单位数量肝细胞水样空泡现象提高约23%，细胞核发生偏移、固缩或溶解，肝血窦中可见血细胞等现象(图1B)；连续注射不同剂量PHI 3 d，除0.3 mg/kg PHI剂量外，注射其他剂量PHI均可不同程度地减轻泥鳅肝脏病理损伤(图1D～F)。
A—对照组；B—MCs 组；C—MCs+0.3 mg/kg PHI；D—MCs+0.6 mg/kg PHI；E—MCs+1.2 mg/kg PHI；F— MCs+2.4 mg/kg PHI。LC—肝细胞；BC—血细胞；CV—中央静脉；HS—肝血窦；HC—肝索；PN—细胞核偏移；K—核溶解；P—核固缩；HD—水样空泡。
A—control group；B—MCs group；C—MCs+0.3 mg/kg PHI；D—MCs+0.6 mg/kg PHI；E—MCs+1.2 mg/kg PHI；F—MCs+2.4 mg/kg PHI. LC—hepatocytes；BC—red blood cell；CV—central vein；HS—hepatic sinusoid；HC—hepatic cord；PN—nuclear shift；K—karyolysis；P—pyknosis；HD—hydropic degeneration.
图1 PHI对MCs暴露下泥鳅肝组织显微结构的影响
Fig.1 Effects of PHI on the microstructure in liver of Paramisgurnus dabryanus exposed to MCs
2.3 PHI对亚慢性毒性浓度MCs攻毒后泥鳅肝脏生理、生化相关指标的影响
从表2可见：与对照组相比，腹腔注射亚慢性毒性浓度MCs可显著提高泥鳅肝脏ALT活性和MDA含量(P<0.05)，显著降低SOD、GSH-PX和GR活性(P<0.05)，说明MCs可诱导泥鳅肝脏发生氧化损伤；与MCs组相比，连续注射不同剂量的PHI 3 d，可显著降低泥鳅肝脏ALT活性和MDA含量(P<0.05)，显著提高泥鳅SOD、GSH-PX和GR活性(除0.3 mg/kg PHI剂量组外)(P<0.05)，说明PHI可通过提高肝脏抗氧化酶活性减轻MCs所诱导的肝脏氧化损伤。
表2 PHI对MCs暴露下泥鳅肝脏生理、生化相关酶活性的影响
Tab.2 Effects of PHI on physiologically and biochemically related enzyme activity in liver of Paramisgurnus dabryanus exposed to MCs
注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。
Note：The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter within the same column are not significant differences，et sequentia.
组别 groupALT/(U·mg-1 prot)MDA/(nmol·mg-1prot)SOD/(U·mg-1prot)GSH-PX/(U·mg-1prot)GR/(U·mg-1prot)对照 control322.97±3.30b0.68±0.03d112.24±8.80ab285.71±8.22b16.12±2.84bMCs 390.71±9.18a1.39±0.07a88.72±9.66c210.18±6.14d10.74±0.36cMCs+0.3 mg/kg PHI232.89±31.65c0.92±0.04b103.71±3.42b235.05±1.79c13.05±1.01bcMCs+0.6 mg/kg PHI312.92±36.35b0.74±0.01d105.48±4.02b245.31±2.78c26.63±3.47aMCs+1.2 mg/kg PHI170.42±17.17d0.83±0.02c122.02±6.26a236.64±3.27c26.96±1.32aMCs+2.4 mg/kg PHI345.76±31.44b0.83±0.06c118.57±5.02a366.16±18.04a15.21±2.44b
2.4 PHI对亚慢性毒性浓度MCs攻毒后泥鳅肝脏炎性因子含量的影响
从表3可见：与对照组相比，腹腔注射亚慢性毒性浓度MCs可显著提高泥鳅肝脏IL-1β和TNF-α含量(P<0.05)，说明MCs能诱导泥鳅肝脏发生炎症反应；与MCs组相比，连续注射不同剂量的PHI 3 d，可显著降低泥鳅肝脏IL-1β和TNF-α含量(除2.4 mg/kg PHI剂量组IL-1β水平外)(P<0.05)；当PHI注射累积剂量达到0.6 mg/kg时，肝脏中IL-1β和TNF-α含量最低，此时，TNF-α含量恢复到对照组水平，IL-1β含量显著低于对照组(P<0.05)。
表3 PHI对MCs暴露下泥鳅肝脏炎性因子IL-1β和TNF-α水平的影响
Tab.3 Effects of PHI on the levels of IL-1β and TNF-α inflammatory factors in liver of Paramisgurnus dabryanus exposed to MCs
组别 groupIL-1β/(pg·mg-1prot)TNF-α/(pg·mg-1prot)对照 control15.94±1.43c10.17±0.69dMCs 31.19±0.69a22.13±0.82aMCs+0.3 mg/kg PHI18.82±1.62b12.44±0.70cMCs+0.6 mg/kg PHI9.45±0.62d9.15±0.11dMCs+1.2 mg/kg PHI21.34±1.52b17.43±1.60bMCs+2.4 mg/kg PHI31.42±2.74a17.83±1.15b
3 讨论
3.1 PHI对亚慢性毒性浓度MCs攻毒后泥鳅肝脏病理与生理功能损伤的影响
MCs暴露会对动物肝脏、肾脏等多种组织和器官造成损伤[19]，其中肝脏为MCs主要靶器官[20]。作为一种强烈的肝毒性毒素，不仅具有急性毒害效应，其亚慢性浓度暴露下也会引起动物肝脏(或肝胰腺)损伤。Li等[21]研究发现，在亚急性毒性浓度(50 μg/kg MCs)暴露下，鲤(Cyprinus carpio)肝细胞超微结构有明显变化，肝细胞出现内膜系统肿大、粗面内质网扩张等病理改变。隗黎丽[22]研究发现，在亚急性毒性浓度MC-LR(50 μg/kg)暴露下，草鱼(Ctenopharyngodon idella)肝细胞超微结构有明显改变，肝细胞出现脂肪样变，同时伴有溶酶体增多、内质网扩张和线粒体水肿等病理损伤。本研究中发现，腹腔注射亚慢性毒性浓度MCs(17 μg/kg )会造成泥鳅肝脏水样空泡增多，细胞核发生偏移、固缩或溶解，肝血窦中可见血细胞等现象，而在MCs攻毒后连续给予PHI 3 d，能够对肝脏起到一定保护作用。ALT是参与机体蛋白质代谢的重要氨基酸转氨酶，当肝脏功能受损时ALT活性会显著增加[23]。陈华等[24]进行姜黄及姜黄素对微囊藻粗毒素致小鼠急性肝损伤预防研究中发现，腹腔注射MCs 3 h后迅速损伤肝脏，使小鼠肝匀浆中ALT活性明显升高，预先给予姜黄或姜黄素能降低ALT活性。本研究中也发现，腹腔注射17 μg/kg MCs的泥鳅肝脏中ALT活性显著升高，而在MCs攻毒后连续给予PHI 3 d，能显著降低泥鳅肝脏ALT活性。由此可见，PHI能够减轻MCs引起的肝脏病理及生理功能损伤。
3.2 PHI对亚慢性毒性浓度MCs诱导泥鳅肝脏氧化损伤的影响
MCs能诱导机体产生大量活性氧(ROS)，使细胞处于氧化应激状态[25]。MDA是生物膜脂质过氧化反应的重要产物之一，会引起蛋白质、不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质交联聚合，加剧膜损伤，因此，MDA也是反映机体抗氧化能力及细胞损伤水平的重要指标[26]。本研究中发现，与对照组相比，MCs组泥鳅肝脏MDA含量显著升高，说明用亚慢性毒性浓度MCs暴露能够诱导泥鳅肝脏发生脂质过氧化损伤，而连续腹腔注射不同剂量PHI后能显著降低泥鳅肝脏MDA含量，可不同程度地缓解MCs诱发的氧化损伤。当氧化损伤发生后，细胞会启动抗氧化防御释放抗氧化酶来降低ROS对自身的影响，因此，这些酶活性的高低可以间接反映机体清除氧自由基的能力[25]。SOD存在于有氧代谢的细胞内，是抗氧化防御体系的第一道屏障[27]。GSH-PX与GR参与的氧化还原作用属于一对可逆反应，两者是维持机体内环境稳定的重要催化酶，机体在解毒过程中GSH会在GSH-PX的催化作用下氧化为氧化型谷胱甘肽(GSSG)，为维持GSH自身的平衡与解毒的需求，除了机体自身合成GSH外，还会通过GR的还原作用使GSH处于高水平状态[28]。腹腔注射MCs能显著降低泥鳅肝脏SOD、GR和GSH-PX活性，而注射不同剂量的PHI后能够不同程度地提高因MCs暴露而降低的这3种抗氧化酶活性。由此可见，MCs能诱导泥鳅肝脏发生氧化损伤，而PHI能够激活抗氧化防御体系进而减轻MCs诱导的氧化损伤。
3.3 PHI对亚慢性毒性浓度MCs诱导泥鳅肝脏炎症反应的影响
前期研究发现，MCs能诱发肝出血、肝炎和肝坏死等症状，触发非特异性炎症反应[29]。白细胞介素(interleukin，IL)是一种对机体具有致炎效果和调节功能的功能性蛋白家族，而IL-1β是其中一员，能参与机体免疫反应，是机体对外来化合物释放最早、效果最强的致炎因子之一[30]。TNF-α通常在免疫刺激下由NK细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞等进行表达，是参与机体获得性免疫和先天性免疫的多功能炎性因子[31]。Wei等[32]研究发现，草鱼腹腔注射50 μg/kg MC-LR，其脾脏中淋巴细胞超微结构发生变化，IL-1β、TNF-α、IgM等炎性因子基因转录水平显著降低，表明MCs对草鱼具有免疫毒性。唐功[33]研究发现，贯叶连翘提取物能降低大鼠酒精性肝脏IL-1β、TNF-α致炎因子表达，缓解炎症反应，从而达到保护肝脏的作用。Cheng等[34]研究发现，PHI能降低小鼠肺组织中IL-1β、TNF-α等炎性因子表达，减轻香烟烟雾诱导的肺损伤。本研究表明，腹腔注射MCs亦使泥鳅肝脏IL-1β和TNF-α水平升高，腹腔注射PHI能降低泥鳅因注射MCs而升高的IL-1β和TNF-α水平。由此可见，在适当剂量下，PHI能够通过降低炎性因子水平进而减轻MCs诱导产生的炎症反应。
4 结论
1)腹腔注射17 μg/kg MCs会引起泥鳅肝脏发生组织病理与生理功能损伤，降低机体抗氧化能力，诱发炎症反应。
2)注射PHI能减轻MCs诱导的泥鳅肝脏组织病理与生理功能损伤，显著降低肝脏中ALT活性、MDA含量及两种抗炎因子(IL-1β和TNF-α)含量，同时显著增强SOD、GSH-PX和GR活性，表明PHI能够提高抗氧化能力，缓解炎症反应，对MCs所致肝脏损伤具有保护作用。
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