海鲈(Lateolabrax japonicas)隶属于鲈形目(Percoidei)鮨亚科(Serranidae)花鲈鮨属(Perch Serranae)，是中国第三大养殖鱼类，广泛分布在广东、浙江和山东等沿海地区[1]。海鲈肉质雪白细腻，骨刺少，营养价值高，口感柔软鲜嫩，深受广大消费者青睐[2-3]。据《2022中国渔业统计年鉴》显示，2021年中国海鲈养殖产量累计达19.9万t，比2020年增长了1.98%[4]。然而，海鲈的工业加工方式主要以冷冻加工和干制为主，产品形式单一，严重制约了海鲈产业的发展[5]。腌干发酵鱼是中国重要的传统盐渍水产品，但由于传统腌干鱼生产自动化水平较低，而靠传统手工作坊进行生产，会造成腌干鱼产品品质不稳定、成本高和生产周期长等问题，导致腌干发酵鱼的发展远远滞后于其他发酵食品。相关研究表明，微生物外源接菌发酵技术可缩短发酵周期和改善产品品质[6]，可有效解决海鲈快速发酵及标准化生产需求。
目前，在发酵肉制品中普遍通过添加发酵剂的方法来推动发酵过程朝预期方向发展，同时也能限制腐败微生物生长，进而改善产品质地、风味和感官特性[7-8]。Wen等[9]研究发现，乳酸菌发酵剂可以抑制牛肉干的脂质和蛋白质氧化，且嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)可以较好地改善风味的形成。Xu等[10]将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)接种至草鱼中，发现其明显降低了草鱼中的pH、有害微生物和生物胺，丰富了草鱼的风味并提高其安全质量。吴燕燕等[11]研究表明，添加戊糖片球菌(Pediococcu pentosaceus)及清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)与肉葡萄球菌(Staphylococcus carnitinus)复合发酵剂可以缩短发酵鳜鱼的生产周期，提高其产品安全性。此外，通过工艺优化可以设计出最佳工艺方法，这对产品品质的改变具有重要影响。解万翠等[12]优化了虾头酱发酵工艺，提升了虾头酱品质。刘安齐等[13]优化了发酵香糟大黄鱼的发酵工艺条件，与新鲜大黄鱼相比，发酵后的大黄鱼风味更加丰富。
本研究中，以海鲈为研究对象，以戊糖片球菌和植物乳杆菌为外加复合菌株，采用单因素试验和响应面试验设计方法对发酵海鲈工艺进行优化，并对终产品的理化指标进行分析，以期为优化海鲈发酵工艺提供科学依据和技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
原料：鲜活海鲈购自广东省广州市华润万家超市，体质量为(450±50)g；戊糖片球菌和植物乳酸杆菌为中国水产科学研究院南海水产研究所农业农村部水产品加工重点实验室贮藏菌株。
试剂：发酵粗盐、MRS液体培养基、0.01 mol/L氢氧化钠溶液、甲醛标准溶液、无水乙醇和无菌生理盐水。
仪器与设备：T50型自动均质机(德国IKA公司)；CR-400型全自动色差校正仪(日本柯尼卡美能达控股公司)；CT3质构仪(美国Brookfield公司)等。
1.2 方法
1.2.1 发酵剂的制备 将戊糖片球菌和植物乳杆菌接入到MRS液体培养基(在121 ℃灭菌15 min)中活化两次，在37 ℃下以180 r/min 培养24 h。之后取出菌液并按所需比例混合，于4 ℃下以10 000 r/min离心5 min，弃上清液，菌体用无菌生理盐水洗涤2～3次，并稀释1 000倍，使最终菌液浓度为105～106 CFU/mL。
1.2.2 工艺流程及主要步骤
工艺流程：接菌发酵海鲈，鲜活海鲈宰杀清洗→擦干表面水分→喷淋发酵菌液→晾干表面水分→涂抹发酵盐→发酵→成品→冷冻保藏；自然发酵海鲈，鲜活海鲈宰杀清洗→擦干表面水分→晾干表面水分→涂抹发酵盐→发酵→成品→冷冻保藏。
步骤：敲击鲜活海鲈的头部使其致晕，然后开背去除鱼头、鱼尾和内脏，鱼背上开花刀，再用超纯水将鱼清洗干净并擦干表面水分。将配制好的菌液按喷淋的方法喷洒至鱼全身，悬置2～3 h以减少鱼体表的水分。待鱼表面水分晾干后用一定量的发酵盐均匀涂抹在鱼身上，再将鱼吊挂在恒温恒湿(温度为25 ℃±1 ℃，相对湿度为55%±2%)培养箱内发酵。到一定时间将样品取出置于-20 ℃冰箱中贮藏。自然发酵海鲈步骤与上述相同。
1.2.3 单因素试验设计
1)菌种配比影响试验。将戊糖片球菌与植物乳杆菌分别按体积比1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1的比例混合，发酵盐添加量和接种菌量分别为3%和1.0%，在室温(25 ℃±1 ℃，下同)下发酵30 h，对发酵海鲈进行感官评价。
2)接种菌量影响试验。戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比为2∶1，发酵盐添加量为3%，接种菌量分别设为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%(均为质量分数，下同)，在室温下发酵30 h，对发酵海鲈进行感官评价。
3)发酵盐添加量影响试验。戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比为2∶1，接种菌量为1.0%，发酵盐添加量分别设为1%、2%、3%、4%、5%(均为质量分数，下同)，在室温下发酵30 h，对发酵海鲈进行感官评价。
4)发酵时间影响试验。戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比为2∶1，接种菌量为1.0%，发酵盐添加量为3%，发酵时间分别设为18、24、30、36、42 h，在室温下发酵，对发酵海鲈进行感官评价。
1.2.4 响应面法优化发酵海鲈工艺 基于单因素试验结果，以发酵盐添加量、接种菌量和发酵时间为自变量，感官综合评分为响应值，根据Box-Behnken中心设计原理设计试验，分析发酵盐添加量、发酵时间和接菌量及其三者间的交互作用对发酵海鲈感官的影响，以进一步优化提高复合菌发酵海鲈的工艺参数。
1.2.5 感官评定 取同一部位鱼肉蒸煮5 min，由10位具有感官评价基础知识的学生和老师(男性5名和女性5名)对产品进行打分。感官评分人员按表1评价标准对产品进行评估。
表1 海鲈感官评价标准
Tab.1 Sensory evaluation criteria for sea bass
感官指标sensory index感官得分sensory score15^20分10^15分5^10分0^5分蒸煮前气味 odor before cooking具有特殊的香味,无异味香味较淡,无异味具有腥味或有异味有明显的腥味或异味蒸煮后气味 odor after cooking有一股清香,无异味香味很淡,无异味无香味且有一点异味无香味且异味明显外观 appearance肉质完整,色泽均匀明亮,蒜瓣状很明显肉质较完整,色泽均匀较明亮,蒜瓣状较明显肉质松散,色泽较均匀正常,蒜瓣状不明显肉质很松散,色泽暗淡,不呈蒜瓣状滋味 taste咸度适中,回味甘甜,有一种清香,无腥味稍微偏咸或偏淡,回味清香,无甜味稍微偏咸或偏淡,有腥味或臭香味无回味,异味重,咸度太重或无咸味质地 character肉质细腻,熟制后鱼肉不易散肉质较细腻,熟制后鱼肉不易散肉质有点粗糙,熟制后有轻微散肉质粗糙,熟制后鱼肉易散
1.2.6 发酵海鲈理化指标测定
1)质构特性。将自然发酵和接菌发酵海鲈放置在室温下解冻后，分别切成2 cm×2 cm×1 cm的小块，并用清水浸泡10 min左右。将鱼块放在蒸煮锅中蒸煮5 min后取出，冷却至室温。使用CT3质构仪并选择TA44平底圆柱形探头对发酵海鲈鱼肉进行测定，每个样品测定6次。TPA参数设置参考徐鸣等[14]和李锐等[15]的方法并略作更改。具体参数：30%的压缩形变；触发点负载为5.0 g；测试速度为0.5 mm/s；返回速度为0.5 mm/s；循环次数为2次。
2)色差。待样品冷却至室温，使用LAB色差仪测定两种发酵鱼片色泽，结果用L*、a*和b*表示。其中，L*表示亮度，L*值越大表示颜色越明亮；a*表示红绿值，+a*表示红，-a*表示绿；b*表示黄蓝值，+b*表示黄，-b*表示蓝。
3)总酸和氨基肽氮含量。参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》和GB 5009.235—2016《食品中氨基态氮的测定》中的方法分别测定发酵海鲈肉的总酸和氨基态氮含量，并采用电位滴定法测定总酸含量[16-17]。
1.3 数据处理
试验数据以平均值±标准误(mean±S.E.)表示，采用Excel 2010软件和Origin 2021软件绘图，使用Design Expert 8.0.6和SPSS 19.0软件对试验数据进行分析。采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 菌种配比的选择 从图1(a)可见：随着戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比的增大，感官评分也随之升高，且当二者的体积比为2∶1时，发酵海鲈的各项感官指标较为突出，感官评分出现峰值(80.32分)，此时的发酵海鲈具有鱼肉发酵后的特殊气味，蒸煮后鱼肉色泽明亮且肉质细腻；当戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比继续增加至3∶1时，发酵海鲈的感官评分呈显著下降趋势(P<0.05)。因此，本试验中，选择戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比为2∶1时进行响应面优化。
标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。
The means with different letters are significantly different at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.
图1 菌种配比、接种菌量、发酵盐添加量和发酵时间对发酵海鲈感官品质的影响
Fig.1 Effects of strain ratio，inoculum，salt content and fermentation time on the sensory quality of fermented sea bass
2.1.2 接种菌量的选择 从图1(b)可见：当接种菌量为1.0%时，感官评分值达到最高(82.47分)；当接种菌量为0.5%时，体系内的菌种数量相对较少，发酵能力较弱，使海鲈在发酵结束时未生成期望的风味；当接种菌量为1.5%～2.5%时，感观评分逐渐下降，这可能是由于海鲈中菌种数量过多，导致海鲈中的营养物质(如脂质和蛋白质)被过度分解，使产品具有不良气味[18]。因此，本试验中，选择接种菌量为1.0%时进行响应面试验。
2.1.3 发酵盐添加量的选择 从图1(c)可见：感官评分随发酵盐添加量的增加呈先升高后下降的趋势；当发酵盐添加量为3%时，发酵海鲈感官评分达到最高(83.47分)且与发酵盐添加量2.0%和4.0%时相比差异显著(P<0.05)，随着发酵盐添加量的增加，感官评分逐渐下降。因此，本试验中选择发酵盐添加量为3%时进行响应面试验。
2.1.4 发酵时间的选择 从图1(d)可见：发酵18～30 h时，发酵海鲈感官评分显著上升(P<0.05)，发酵30 h时，感官评分最高(82.64分)；发酵30～42 h时，感官评分逐渐下降，尤其发酵至42 h时，感官评分骤降(P<0.05)。这可能是海鲈发酵时间相对较短导致发酵不足，影响了其风味的形成；随着发酵时间的延长，戊糖片球菌与植物乳杆菌相互作用，使海鲈形成较好的风味物质。但发酵时间过长也会造成乳酸积累[19]，影响发酵海鲈的风味和口感。因此，本试验中选择发酵时间为30 h时进行响应面试验。
2.2 响应面试验
2.2.1 响应面试验结果与方差分析 以感官综合评分(Y)为响应值，发酵时间(A)、接种菌量(B)、发酵盐添加量(C)为自变量，利用Design Expert 8.0.6设计响应面优化试验(表2、表3)，经多元拟合，得到感官评分模型的回归方程为
表2 响应面试验因素与水平
Tab.2 Factors and levels in response surface test
水平level因素 factorA:发酵时间/hfermentation timeB:接种菌量/%inoculation amountC:发酵盐添加量/%salt addition amount-1240.520301.031361.54
表3 Box-Behnken试验设计与结果
Tab.3 Design and results of Box-Benhnken
试验号text No.A发酵时间/hfermentation timeB接种菌量/%inoculation amountC发酵盐添加量/%salt addition amount感官评分sensory score1300.5475.132240.5378.363361.0475.734301.0382.755300.5276.616241.5375.477301.5274.728301.0383.129361.0277.4310241.0474.6611301.0382.5712301.0383.1213301.0383.0514241.0275.3915301.5474.7416360.5377.4317361.5377.28
Y=82.92+0.50A-0.67B-0.49C+0.68AB-
0.24AC+0.38BC-2.64A2-3.14B2-4.48C2。
用方差分析检验回归方程的有效性，结果表明，总模型方程极显著(P<0.000 1)，失拟项不显著(P>0.05)(表4)。发酵海鲈模型中的决定系数R2=0.994 2，其矫正系数为
拟合程度良好，说明该模型可靠，可用于对后续试验结果进行预测。对模型中各系数的P值进行分析，其中因子A、B、C、A×B、A2、B2、C2均呈极显著水平(P<0.01)。根据表4中的F值得出影响发酵海鲈感官评分的顺序依次为接种菌量(B)>发酵时间(A)>发酵盐添加量(C)。
表4 感官评分回归模型的方差分析
Tab.4 Variance analysis of the regression model for sensory scores
注：*表示有显著性影响(P<0.05)，**表示有极显著性影响(P<0.01)。
Note：*means significant effect(P<0.05)，** means very significant effect(P<0.01).
方差来源source总偏差平方和SS自由度df平均偏差平方和MSFP模型model182.55920.28133.98<0.000 1∗∗A1.9911.9913.150.008 4∗∗B3.5413.5423.370.001 9∗∗C1.8911.8912.490.009 5∗∗AB1.8811.8812.400.009 7∗∗AC0.2410.241.550.252 7BC0.5610.563.720.095 3A229.40129.40194.18<0.000 1∗∗B241.64141.64275.06<0.000 1∗∗C284.40184.40557.53<0.000 1∗∗误差项residual1.0670.15失拟项lack of fit0.8130.274.360.094 5纯误差pure error0.2540.062所有项cor total183.6116
2.2.2 响应面交互作用分析 响应面可清晰直观地反映各相关因素及相互作用程度对发酵海鲈感官品质的影响，响应面中曲线的弯曲程度代表对应因素对响应值的影响程度[20]。等高线图若呈椭圆形，则表明各因素间的交互作用程度比较显著；等高线若呈圆形，则表明交互作用不显著[21]。从图2(a)可见，发酵盐添加量为3%时，感官综合评分曲线随发酵时间和接种菌量的增加呈先升高后下降的趋势，且其等高线呈卵形，表明发酵时间和接种菌量的交互作用程度较显著。从图2(b)可见，接种菌量固定在1.0%水平时，感官评分随发酵时间和发酵盐添加量的增加呈先升高后下降的趋势，且其等高线呈椭圆形，说明发酵时间与发酵盐添加量间的交互作用较明显。从图2(c)可见，发酵盐添加量与接种菌量间的交互作用同发酵时间与食盐添加量相似。
图2 3因素交互作用的响应面图
Fig.2 Response surface of the interaction of three factors
根据模型计算得到海鲈最佳发酵条件：发酵时间为30.5 h，接种菌量为0.95%，发酵盐添加量为2.94%，按此工艺条件得到发酵海鲈的感官评分为82.99。结合实际生产，最终选择优化生产条件：发酵时间为30 h，接种菌量为1%，发酵盐添加量为3%。
2.3 发酵海鲈品质
2.3.1 色泽 从表5可见：与自然发酵海鲈相比，接菌发酵海鲈的L*值由75.40降低至70.32，L*值降低了6.7%；接菌发酵后海鲈的红绿值a*由-1.89增加至-0.94，黄蓝值b*由1.71下降至1.48。以上结果表明，与自然发酵海鲈相比，接菌发酵海鲈鱼肉色泽得到明显改善。
表5 自然发酵及接菌发酵海鲈的色泽变化
Tab.5 Color change of sea bass fermented naturally and inoculated with bacteria
发酵方法fermentation method亮度 L∗红绿值a∗黄蓝值b∗自然 natural 75.40±0.91-1.89±0.151.71±0.86接菌 inoculation 70.32±1.56-0.94±0.131.48±0.45
2.3.2 质构 硬度和咀嚼性决定了鱼的味道，可通过TPA研究海鲈的质构特性。从表6可见，与自然发酵海鲈相比，接菌发酵海鲈硬度、咀嚼性和胶着性变化较大，而弹性、内聚力变化较小，但各指标均有所增加，表明海鲈经接菌发酵后肉质更紧实，其质地得到明显改善。
表6 自然发酵及接菌发酵海鲈的质构变化
Tab.6 Textural changes of sea bass fermented naturally and inoculated with bacteria
发酵方法 fermentation method硬度 hardness/g弹性 elasticity/mm咀嚼性 chewiness/mJ胶着性 adhesiveness/g内聚性 cohesiveness自然 natural 40.17±2.321.36±0.130.44±0.0433.27±0.780.83±0.05接菌 inoculation223.33±12.871.53±0.093.29±0.18219.30±1.770.94±0.11
2.3.3 总酸和氨基态氮含量 从表7可见，与自然发酵海鲈相比，接菌发酵海鲈的总酸含量增加23.13%，氨基态氮含量增加40.07%，说明海鲈接菌发酵可以促进蛋白质分解，从而生成更多的游离氨基酸和短肽。
表7 自然发酵及接菌发酵海鲈的总酸和氨基态氮含量
Tab.7 Total acid and amino nitrogen contents of sea bass fermented naturally and inoculated with bacteria g/kg
发酵方法fermentation method总酸total acid氨基态氮amino nitrogen自然 natural1.470±0.026.720±0.11接菌 inoculation1.810±0.039.413±0.15
3 讨论
3.1 混菌发酵对海鲈色泽的影响
色泽可用来衡量肉制品的品质。本研究中，海鲈经接菌发酵后L*和b*值略有减小，这可能是由于接菌发酵海鲈在发酵过程中水分流失稍多，使鱼肉颜色发生轻微变化[22]；而接菌发酵海鲈的a*值增大，这可能是因为戊糖片球菌具有硝酸还原酶活力，能促进肌红蛋形成，使鱼肉颜色发生变化。此外，加热使蛋白质发生变性生成其他衍生物，也导致鱼肉颜色发生变化[23]。总体而言，海鲈经接菌发酵后，对明暗度和黄蓝度影响不大，但对红绿度影响较明显，表明接菌发酵技术可以较好地改善海鲈品质。
3.2 混菌发酵对海鲈质构特性的影响
食品的质地是影响消费者接受度的重要方面，用TPA获得的压缩参数可用于评估肉制品品质[24]。食盐不仅赋予食品咸味，而且适当的盐浓度可以提升食品的鲜味，增加消费者感官体验[25]。发酵肉制品中盐的比例是关键，其关系到食品的味道、质量和保存时间。盐浓度太高会导致发酵制品苦咸无从下口，而且对人体有害；而盐浓度太低，则会导致食品变质有臭味。所以在海鲈发酵生产中，要严格控制发酵盐的添加量。此外，适宜的接种菌量有利于微生物利用底物进行发酵[26]，对发酵海鲈感官品质方面具有一定影响。本研究中，经接菌发酵后海鲈的硬度、咀嚼性和胶着性均明显增大，而弹性、内聚力变化较小。硬度能直接反映食品口感，经接菌发酵后鱼肉硬度增加，这可能是由于在盐和微生物的作用下，鱼肉中水分、蛋白质和脂质含量及比例发生了变化[27]。咀嚼性是综合反映硬度和弹性的指标，接菌发酵后海鲈的咀嚼性增加，说明接菌发酵能影响海鲈的质构特性。发酵时间会影响海鲈中微生物生长及其风味，故选择合适的发酵时间对海鲈发酵至关重要。此外，发酵能够促进鱼肉蛋白的凝胶化，提高发酵海鲈的胶着性。杨培周等[28]研究发现，臭鳜鱼在发酵前10 d，鱼的硬度、咀嚼性和胶着性随发酵时间延长而增加，与海鲈发酵结果一致。综上，接菌发酵能够赋予海鲈更好的口感，并提高海鲈的质构特性。
3.3 海鲈发酵过程中总酸和氨基态氮含量的变化
食品中总酸的含量不仅可以鉴别产品品质，还能确定食品理化性质的稳定性，对食品风味形成具有重要影响。本研究中，海鲈经接菌发酵后总酸含量有所增加，这可能是因为戊糖片球菌与植物乳杆菌具有较好的产酸性能，能将碳水化合物分解成各种有机酸物质。此外，在海鲈发酵过程中，微生物分泌的脂肪酶能与其他酶协同发挥作用，催化脂肪水解进而生成脂肪酸，使鱼肉中总酸含量增加[29]。
氨基态氮主要是由蛋白质经各种蛋白酶、肽酶分解而成的产物，被作为衡量氨基酸总量和蛋白质水解程度的重要指标之一[30-31]。氨基态氮含量可反映原料发酵程度，氨基态氮含量越高说明氨基酸含量越高，食品味道越鲜。本研究中，接菌发酵海鲈的氨基态氮含量比自然发酵海鲈增长了40.07%，说明接菌发酵可有效提升氨基态氮含量。据报道，微生物活动与发酵海鲈中氨基酸的代谢过程密切相关，在海鲈发酵过程中，微生物在酶的作用下将蛋白质分解成各种小分子化合物(如氨基酸、短肽)[32]，这些化合物可以极大地丰富海鲈风味。此外，有研究发现，接菌发酵有利于鱼露中氨基态氮含量增加，并能缩短发酵时间[33]。综上，接菌发酵可以形成风味较好的海鲈，此发酵工艺参数准确可靠。
4 结论
1)将戊糖片球菌和植物乳杆菌复合菌株添加到海鲈中进行发酵，得到海鲈的最优发酵条件为戊糖片球菌与植物乳杆菌体积比为2∶1混合，接种菌量为1.0%，发酵时间为30 h，发酵盐添加量为3%。
2)海鲈经接菌发酵后，海鲈鱼经接菌发酵后，鱼肉色泽和质构特性都得到改善，总酸和氨基态氮含量升高。说明采用接菌发酵有利于提升海鲈风味品质，实现发酵工艺可控，并能提高产品安全性。
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