鲜味(umami)是1908年日本科学家Ikeda首次从海藻汤中发现并分离出谷氨酸后提出的，直至20世纪90年代鲜味受体的发现，才将其确定为一种基本滋味。1978年，Yamasaki等[1]从牛肉酶水解液中分离纯化出一个具有滋味的组分，并将其命名为鲜味肽，揭开了鲜味肽研究的序幕。鲜味肽既能赋予食品特殊的滋味，又能改善风味、提升味感。Kirimura等[2]发现，LLLL(Leu-Leu-Leu)和γ-LELE(γ-Leu-Glu-Leu-Glu)的呈味阈值是LL(Leu-Leu)阈值的一半，表明特定结构的肽具有比游离氨基酸更强的鲜味。目前，在肉类[3]、鱼类[4]、贝类[5]、豆类[6]、菌类[7]和发酵食品[8]等许多食材中均发现了鲜味肽，表明鲜味肽是食品中广泛存在的呈味化合物[9]。

沙蚕(Perinereis spp.)隶属于环节动物门(Annelida)多毛纲(Polychaeta)游走目(Errantia)沙蚕科(Nereidae)，中药名为海蚯蚓。沙蚕营养价值较高，粗蛋白质含量达60%以上，氨基酸种类齐全且比例协调，其中，必需氨基酸的构成比例符合FAO/WHO的标准，不饱和脂肪酸、矿物质和维生素含量丰富，其提供营养素的能力大于提供热能的能力，是典型的高蛋白、低脂肪和膳食营养价值较高的优质海洋食品[10]。沙蚕鲜味明显，但对沙蚕鲜味肽的研究目前尚未见报道。本研究中，以双齿围沙蚕(Perinereies aibuhitensis)为原料，开展了沙蚕鲜味肽制备研究，以期为沙蚕鲜味基料的研发，以及沙蚕的资源利用和产品附加值的提高提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用沙蚕为野生非生殖态双齿围沙蚕(非异沙蚕体)，2021年 9 月购自青岛明月安欣营养科技有限公司，体质量为 300～400 尾/kg，采集后清洗，用海水暂养吐沙24 h，沥水，匀浆待用。调味基料对照品为酱油粉SP，购自河南新乡科兴添加剂有限责任公司。碱性蛋白酶(20万U/g)、中性蛋白酶(20万U/g)、胃蛋白酶(30万U/g)、木瓜蛋白酶(80万U/g)和动物蛋白酶(30万U/g)均购自南宁庞博生物工程有限公司，风味蛋白酶(30万U/g)购自诺维信(中国)生物技术有限公司，其他试剂均为分析纯。

仪器与设备：Orion多参数仪(Thermo公司)；CR21N落地冷冻离心机(日本日立公司)；G20S智能滴定仪[梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司]；VICTOR-Nivo5S酶标仪(美国PE公司)；JTM1812/30-1多功能膜小型机(配有50 nm陶瓷膜和不同分子量的超滤膜)(大连屹东膜工程设备有限公司)；8400凯氏定氮仪(丹麦FOSS公司)；FD-1D-50真空冷冻干燥机(北京博医康设备有限公司)；TS5000Z仪(日本Insent公司)。

1.2 方法

1.2.1 沙蚕酶解及鲜味肽粉的制备 沙蚕匀浆样品→加入蒸馏水调配料液比→调节pH→加酶酶解→沸水浴灭酶5 min→冷却至室温，得酶解液，对酶解液进行指标测定，最优组合酶解液经陶瓷膜澄清，过相对分子质量为20 000的超滤膜，收取滤液冻干，用于产品表征。

1.2.2 总氮含量测定 参照《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》(GB 5009.5—2016)中的方法，采用凯氏定氮仪测定总氮含量。

1.2.3 氨基酸态氮含量测定 参照《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》(GB 5009.235—2016)中的酸度计法，略有改动。准确吸取5.00 mL(V1)酶解液，置于G20S智能滴定仪配套样品杯中，加入60 mL双蒸水，搅拌20 s，混匀后，用浓度为0.05 mol/L的氢氧化钠调节pH为8.2，加入10 mL甲醛(质量分数为36%～38%)，搅拌20 s混匀，再用浓度为0.05 mol/L的氢氧化钠标准滴定液(C)继续滴定至pH为9.2，记录氢氧化钠标准滴定液的体积(V2)。同时取65 mL双蒸水进行空白试验，记录空白试剂消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积(V2′)。氨基酸态氮(g/100 mL)含量计算公式为

氨基酸态氮=(V2-V2′)C×0.014/V1×100。

(1)

式中：0.014表示与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液(CNaOH=1.00 mol/L)相当的氮质量(g)。

1.2.4 水解度(degree of hydrolysis，DH)的计算

水解度

(2)

1.2.5 最适蛋白酶筛选 由于蛋白酶具有作用位点专一的特点，不同蛋白酶水解的位点不同，因此，同一种蛋白使用不同的外源性蛋白酶，酶解效果有明显差异。本研究中，选择碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、动物蛋白酶和胃蛋白酶6种蛋白酶，根据各蛋白酶最适温度及pH进行酶解试验，以感官评分和水解度为指标，确定最佳酶种。酶解条件如表1 所示。

1.2.6 酶解工艺单因素试验 通过前期最适蛋白酶筛选，确定复合使用风味蛋白酶和动物蛋白酶进行单因素酶解试验，建立最适工艺参数。分别进行料液比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，g∶mL)、反应pH(6.0、6.5、7.0)、反应时间(1、2、3、4 h)、加酶量(400、600、800、1 000 U/g)及风味蛋白酶与动物蛋白酶比例(0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1)对酶解效果的单因素影响试验。

1.2.7 响应面试验 在单因素试验基础上，以感官评分、水解度为响应值，设计4因素3水平的响应面试验(Box-Benhnken)，试验因素水平及编码见表2。

1.2.8 感官评价 以质量分数为0.35%的谷氨酸钠溶液为鲜味标准[6]进行鲜味程度感官评分。感官评定小组由实验室的11 名专业评价成员(5 名男性和6 名女性)组成。评定前，进行5 种基本味感(即酸味、甜味、苦味、咸味和鲜味)的感官适应性培训(依据GB/T 16291.1—2012)[11]。感官评定在温度为(25±2)℃的感官评定室进行，评分设定为1～10 分，其中1 分代表无味，5 分代表味感适中，10 分代表味感强烈(0.35%的谷氨酸钠溶液味感)。

1.2.9 电子舌试验 称取沙蚕鲜味多肽粉和酱油粉各0.5 g，分别溶于100 mL纯净水，溶解后参考Liu等[12]的方法，利用TS5000Z仪测定。电子舌可以模拟人舌头的感知对样品进行滋味轮廓分析，是一种客观的判定方法[13]。每个样品测定6次，去掉最高值和最低值数据，取平均值。

1.2.10 顶空-气相-迁移谱(HS-GC-IMS)试验 称取沙蚕鲜味多肽粉和酱油粉各1.0 g，置于20 mL顶空瓶中，参考Liu等[12]的方法，采用气相色谱-离子迁移率光谱法(GC-IMS)(FlavourSpec，Dortmund，德国)与 CTC Analytics (2019瑞士)顶空采样单元联用进行分析。

1.2.11 游离氨基酸测定[12] 准确称取沙蚕鲜味多肽粉及酱油粉各5 mg，采用L-8900氨基酸自动分析仪PF系统测试。对样品图谱积分按标准品校正后，采用L-8900自带软件进行数据定量计算。

1.2.12 滋味活性值 滋味活性值(taste active value，TAV)[14]计算公式为

VTA=Cis/Cit。

(3)

式中：VTA为滋味活性值；Cis为某一呈味物质的浓度(mg/100 g)；Cit为该物质的味道阈值(mg/100 g)。

1.2.13 肽相对分子质量分布测定 准确称取沙蚕鲜味多肽粉及酱油粉各10 mg，溶于体积分数为30%的乙腈水溶液(含0.1%三氟乙酸)中，定容至10 mL，过0.22 μm有机滤膜后，参考《海洋鱼低聚肽粉》(GB/T 22729—2008)中高效凝胶过滤色谱法和刘天红等[15]的方法，测定肽相对分子质量分布。

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，所有试验数据除电子舌数据外均测定3次。数据处理采用响应面软件Degin Expert 12和SPSS 13，绘图软件采用GraphPad Prism 8和Origin 2021，GC-IMS 数据采用130 LAV和GC×IMS谱库处理。显著性水平设为0.05，极显著性水平设为0.01。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

在料液比为1∶1、加酶量为600 U/g时，分别添加6种蛋白酶，调节适宜的pH，酶解4 h，测定其水解度，并进行感官评分，结果显示，各蛋白酶均能不同程度地酶解沙蚕，其中风味蛋白酶的酶解效果最好，水解度达到23.90%，其次为中性蛋白酶和动物蛋白酶(图1(a))。根据鲜味程度和水解度两个指标，后续综合选用动物蛋白酶和风味蛋白酶进行复合酶解制备鲜味肽。两种酶的比例也会对复合酶解效果产生影响，如二者是否具有协同促进酶解的作用或者相互竞争抑制酶解的作用等。进一步进行4种复合酶解比例对水解度和感官评分的影响，结果显示，当风味蛋白酶和动物蛋白酶复合酶解比例为2∶1时，酶解物的水解度最高，鲜味最明显(图1(b))。

2.2 酶解条件的单因素试验

不同pH对水解度和鲜味感官评分的影响如图1(c)所示，pH为6.0时，水解度最高，鲜味最明显，因此，选择pH为6.0，作为最佳pH试验条件。酶解时间对水解度和鲜味感官评分的影响如图1(d)所示，酶解时间为4 h时效果最好，鲜味最明显。料液比对水解度和鲜味感官评分的影响如图1(e)所示，料液比为1∶1时酶解效果最好，鲜味感官评分也较高，基于实际匀浆情况，选取1∶1作为本试验的最佳料液比。不同复合酶添加量对水解度和鲜味感官的影响如图1(f)所示，添加量为800 U/g时，酶解物的鲜味最明显，但其水解度与600 U/g组间无显著性差异，结合实际生产中需考虑生产成本的情况，因此，选择600 U/g作为本试验的最佳加酶量。

2.3 响应面试验

响应面试验因素水平及结果如表3所示。通过多元化拟合，获得水解度(HD，%)对自变量pH(A)、酶解时间(B)、料液比(C)和加酶量(D)的二元多项回归模型方程为

HD=13.89+0.83A+1.07B-4.92C-0.20D-0.80AB-0.24AC+0.53AD+0.49BC+0.52BD-0.58CD-0.93A2-0.55B2+3.23C2+7.98D2。

从表4可见，水解度回归模型整体为极显著水平(P<0.01)，说明建立的模型与试验数据契合较好。模型的决定系数为0.952 4，表明模型中的数据仅有4.76%不能被模型拟合。失拟检验F=0.63>0.05，不显著，说明模型与实际情况拟合较好。因此，可用此模型对试验进行分析和预测。

从表4还可见：料液比呈极显著水平(P<0.01)，说明该因素极显著影响水解度；酶解时间呈显著水平(P<0.05)，说明酶解时间变化会对复合酶解效果产生较大影响，在试验水平范围内随着酶解时间的增加，水解程度增大；其他交互项均不显著(P>0.05)。

鲜味感官评分Y对pH(A)、酶解时间(B)、料液比(C)和加酶量(D)的二元多项回归模型方程为

Y=5.42+0.039A+0.15B-0.44C+0.16D+0.044AB+0.038AC-0.26AD+0.38BC-0.16BD+0.12CD+1.24A2-1.01B2+0.24C2+1.24D2。

从表5可见，鲜味感官评分模型整体呈极显著水平(P<0.01)，说明建立的模型与试验数据契合较好。模型的决定系数为0.818 4，表明模型中的数据仅有18.16%不能被模型拟合。失拟检验F=3.24>0.05，不显著，说明模型与实际情况拟合较好。因此，可用此模型对试验进行分析和预测。

从表5还可见，料液比显著影响鲜味感官评价(P<0.05)，酶解时间与料液比的交互项呈显著水平(P<0.05)，其他交互项均不显著(P>0.05)。

以鲜味感官评分为指标，根据响应面试验数据得出，各因素最优化组合为料液比1∶1.08、pH 6.49、加酶量601.49 U/g、酶解时间4.02 h，预计水解度为31.22%，感官评分为8.57，将条件修正为整数，即料液比1∶1、pH 6.5、加酶量600 U/g、酶解时间4 h，经试验验证，在该条件下水解度为32.64%，感官评分为8.73。表明该响应面设计模型成立，在此条件下制备的酶解液经陶瓷、超滤后冻干成沙蚕鲜味多肽粉(FA)进行后续表征。

2.4 制备的鲜味多肽产品表征

电子舌及其工作原理见图2(a)、2(b)。经电子舌分析显示：FA中有明显的鲜味，高于酱油粉(图2(c))；去除无味点后(图2(d))，鲜味及丰富性均高于酱油粉组，但其苦味值也明显高于酱油粉组(P<0.05)，苦味回味与SP组差别不大(P>0.05)。由此可见，FA组有较好的鲜味，但是也有明显的苦味，这是由于酶解过程中产生了小分子苦味肽或者疏水性氨基酸引起的。后续研究可通过复配、调味等工艺降低其苦味。

食物的鲜、甜味及苦味与人们是否能接纳该食物紧密相关。FA组中鲜味氨基酸占游离氨基酸总量的32.76%，与SP组中该比例相当(32.40%)(表6)，这也说明了沙蚕鲜味多肽粉具有开发呈味基料的潜力。功能性氨基酸除合成蛋白质外还有其他特殊功能，如维持动物的正常生长，调节胎儿和新生动物发育、细胞内蛋白质周转、营养代谢、肠道功能和免疫功能，合成多种生物活性物质，以及合成多胺、谷胱甘肽、核酸、激素和神经递质等[16-17]。FA组中含有13种功能性氨基酸，含量占总量的42.12%，SP组中含有11种功能性氨基酸，占比为37.85%(表6)。表明沙蚕鲜味多肽粉在功能性调味料开发方面具有明显的优势。

游离氨基酸的呈味特征对样品滋味影响较大，滋味活性值是样品中该氨基酸含量与其呈味阈值的比值，若TAV值大于1，说明该氨基酸对样品滋味贡献较大。从图3可见，FA组中所有呈味氨基酸的TAV值均大于1，SP组中Ser和Thr的TAV值小于1，这两个氨基酸对滋味的贡献均为甜味，对鲜味有促进作用，同时FA组的Glu的TAV值远高于SP组，该结果对FA组的鲜味影响较大，这与电子舌测定结果(图2(c))吻合。

GC-IMS可对目标样品中的挥发性成分进行定性、定量分析，是气味分析领域一项较新的技术。基于GC-IMS技术的挥发性指纹图谱显示，在FA组中鉴定出32种(不包含二聚体)挥发性成分，在SP组中鉴定出27种(不包含二聚体)挥发性成分，包括醛类、烯类、醇类和酯类等(图4)。FA组和SP组共有的挥发性成分中具有较多富含香气的成分，如芳樟醇、α-蒎烯、乙酸乙酯和香茅醇等。FA组中特有的2-己醇、2-庚酮、二甲基硫醚、2，3-二甲基丁烯、乙醛、丁酸丁酯和庚酸乙酯，分别能呈现出浆果味、类似香蕉的香气，以及轻微的药香气味、咸腥味、芳香味和葡萄味等，上述物质已被证实在紫菜[18]、鱼[19]、蟹[20]和海胆[21]等海产品鲜味呈味方面具有重要贡献。因此，沙蚕鲜味多肽粉具有良好的芳香气味，在开发呈味基料时能起到增香的作用。

从图5可见，FA组中55.95%的肽相对分子质量为189～1 451(寡肽)，而SP组只有28.23%，这与图2(d)显示FA组苦味值较SP组高的结果一致，张庆春等[22]的研究也认为，苦味肽的相对分子质量为189～1 451，与本研究结果一致。

3 讨论

3.1 蛋白酶对沙蚕鲜味多肽制备工艺的影响

蛋白酶的酶切位点不同、具有专一性等特点是引起水解度不同的主要原因。同时由于酶切使蛋白中的氨基酸暴露，故酶解液呈味不同。本研究中，风味蛋白酶和动物蛋白酶的鲜味评分较高，这与蛋白酶特性有关。风味蛋白酶既是内切酶又是外切酶，可在肽链两端或者内部破坏肽键，使精氨酸和赖氨酸暴露，呈现出甜味，有助于增强鲜味。动物蛋白酶是由内切酶和外切酶复配得到，其酶解效果较好，得到的酶解液的感官评分也较高。碱性蛋白酶是外切酶，得到的酶解液中疏水性氨基酸较高[23]，呈现苦味，其鲜味评分最低。多酶复合酶解可减少苦味肽及疏水性氨基酸的生成，利于改善风味[24]。pH可直接对酶和底物蛋白分子的某些基团的结合、反应状态产生作用，从而影响蛋白酶的水解效果。蛋白质水解的速度受很多因素影响，如蛋白质本身的特性、产物的抑制或促进作用等。酶与底物的结合程度也受料液比的影响，进而影响酶解效果。料液比过低时，反应液流动性不高，酶和底物未能充分结合；料液比过高时，底物浓度过低，酶与底物的反应机会变少，不利于反应发生。加酶量直接影响酶解过程与酶解效果，加酶量太少，氨基态氮含量会过低，不能实现设定目标；加酶量过高，则会增加酶用量成本，不利于工业化生产。为此，本研究中通过单因素试验和响应面试验优化得到沙蚕鲜味多肽制备的最佳工艺条件，即风味蛋白酶和动物蛋白酶复合酶质量比为2∶1、料液比为1∶1、pH为6.5、加酶量为600 U/g、酶解时间为4 h。

3.2 游离氨基酸与小分子肽对呈味的影响

食品中游离氨基酸或小分子肽会影响感官风味，因此，酶解产物中游离氨基酸和肽的组成对风味具有重要影响。本研究表明，FA组中甜味氨基酸和芳香族氨基酸分别占总游离氨基酸的8.64%、12.63%，明显高于SP组中对应的比例(1.37%、8.97%)。但FA组中苦味氨基酸占氨基酸总量的27.98%，略高于SP组(26.03%)，与南极磷虾粉在酶解过程中因疏水性氨基酸增多导致产物苦味(苦味氨基酸占总量的27.83%)增加的研究结果[24]较为接近。鲜甜味氨基酸能掩盖苦味，FA组中鲜味和甜味游离氨基酸比例之和(67.39 mg/g)高于SP组中两类氨基酸之和(35.48 mg/g)，故在感官试验时苦味并不明显。SP组中58.92%的肽相对分子质量为1 451～12 355，是FA组(4.43%)该分子质量段含量的13.30倍，这主要是因为酱油粉在美拉德反应时，寡肽除自身会发生热降解外，还会与糖类发生羰氨缩合，或与中间产物发生反应，进而改变分子量分布[22]。唐霄等[25]研究认为，酶解液中氨基酸组成为2～6个的寡肽(相对分子质量<1 000)含量与呈味肽含量成正比，且侯钰柯等[26]研究发现，相对分子质量为200～1 000的寡肽有独特的增味作用。FA组未经过美拉德反应，故相对分子质量为189～1 451的寡肽完整地得以保留，可用于开发多肽呈味基料。

4 结论

1)利用风味蛋白酶和动物蛋白酶复合酶(质量比为2∶1)酶解沙蚕，通过响应面法优化酶解条件，各因素最优化组合为料液比1∶1、pH 6.5、加酶量600 U/g、酶解时间4 h，在此条件下可得到水解度为32.64%、感官评分为8.73的沙蚕鲜味多肽。

2)利用电子舌分析、游离氨基酸组成和气味指纹图谱分析等手段，表征沙蚕鲜味多肽冻干粉滋味和气味等风味，认为该鲜味多肽具有明显的鲜味和芳香气味，且含有丰富的功能性氨基酸，可用于开发功能性海鲜呈味基料。

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Optimization of enzymatic hydrolysis process and sensory characterization for rag worm (Perinereis aibuhitensis) umami hydrolysate

LIU Tianhong1，2，JI Lei1，2，YU Xiaoqing1，WANG Qi1，WANG Ying1，2*，JIANG Xiaodong1，2，LI Hongyan1，2，SUN Yuanqin1，2，LI Xiao1，2

(1.Marine Science Research Institute of Shandong Province，Qingdao 266104，China；2.Municipal Engineering Research Center of Aquatic Biological Quality Evaluation and Application，Qingdao 266104，China)

Abstract：In order to improve the utilization scope and economic value of rag worm (Perinereis aibuhitensis) effectively, the optimal complex enzymatic hydrolysis process of the umami polypeptide and the flavor characterization of the product from the rag worm with body weight of 300-400 individuals/kg were investigated by using response surface methodology and various characterization methods. The hydrolysate umami peptides powder was prepared and lyophilized by ceramic membrane and ultrafiltration membrane. The results showed that the flavor protease and animal protease were used as the best enzymes for preparing the flavoring peptide. The optimum technological conditions were obtained by response surface methodology: flavor protease and animal protease complex (m∶m=2∶1), material-liquid ratio of 1∶1 (g∶mL), pH 6.5, enzyme concentration of 600 U/g, and enzymatic hydrolysis in 4 h. There was hydrolysate DH of 32.64% and the sensory score of 8.73. The electronic tongue detection indicated that the peptide had obvious umami taste. The free amino acid analysis revealed that the umami amino acids accounted for 32.76% of the total free amino acids, and contained 13 kinds of functional amino acids, with the better taste and smell in the peptide than that in the traditional seasoning soy sauce powder. In conclusion, the hydrolyzed peptides from rag worm had obvious umami and aromatic odors, which could be used to develop functional seafood flavor substrates.

Key words：Perinereis aibuhitensis; enzymatic hydrolysis; umami peptide; sensory characteristics

中图分类号：S 985.9；TS 254.4

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2023-013

文章编号：2095-1388(2023)05-0857-09

收稿日期：2023-01-20

基金项目：山东省重点研发计划项目(2016YYSP014)；山东省现代农业虾蟹产业技术体系项目(SDAIT-13-07)

作者简介：刘天红(1982—)，女，副研究员。E-mail：oucthl@126.com

通信作者：王颖(1971—)，女，研究员。E-mail：food_rc@sina.com