花鲈(Lateolabrax maculatus)是中国重要的水产养殖品种，其隶属于鲈形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鲈属(Lateolabrax)。花鲈对环境适应能力强，适合海水网箱、海淡水池塘及工厂化养殖[1]，据《2022中国渔业统计年鉴》[2]，2021年其年产量超19.9 万t，其中，广东省珠海市花鲈生产量占全国总产量的一半以上。随着养殖规模和密度的不断提高，花鲈养殖过程中的病害问题愈发严重。流行病学调查显示，咸淡水养殖的花鲈病害种类多[3]，其中维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是其养殖过程中的主要致病菌[4-5]。非特异性免疫在鱼类抵御病原微生物的侵染中发挥重要作用。目前，对花鲈养殖中病害防控的有效途径是提高鱼体自身免疫力，减少抗生素及化学药物的使用。《水产养殖用药明白纸2022年1、2号》规定，多种抗生素不允许用于水产养殖过程，抗生素的禁用大大增加了生产中病害防治难度。
中草药是中国传统的医学瑰宝，历史悠久，其活性成分主要包括多糖、生物碱、有机酸和挥发油等，能够促进机体新陈代谢、提高机体免疫力和抗病能力[6]。相较于抗生素和化学药物，中草药不易产生毒副作用，也不易诱导致病菌产生耐药性，且多数中草药价格低廉，因此，其适合在水产养殖中推广应用。
石榴原产中亚地区，在中国种植范围广阔，主要分布在陕西、安徽、四川和云南等地。石榴皮(Punica granatum L.)中含有丰富的酚类和黄酮类活性成分，据《中华人民共和国药典》[7]记载，其具有抗氧化、抗菌、止血和驱虫等功效。石榴皮提取物具有多种体外抑制病原微生物的作用。罗非鱼(Oreochromis niloticus)源维氏气单胞菌的单方中草药体外抑菌试验结果显示，其对石榴皮高度敏感，抑菌圈平均直径为17 cm[8]；马玉和等[9]测定了五倍子(Rhus chinensis)、石榴皮、诃子(Terminalia chebula)、黄芩(Scutellaria baicalensis)和乌梅(Prunus mume)在不同盐度下对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的体外抑菌效果，结果表明，不同盐度下5种中草药对这两种细菌均存在抑制作用[9]；柯文杰等[10]采用琼脂扩散法测定了25种中草药对普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的体外抑菌活性，结果显示，石榴皮具有显著的抑菌作用，最小抑菌浓度(MIC)为1 mg/mL。
本课题组前期采用平板打孔法及试管二倍稀释法测定了60种中草药对花鲈源杀鱼爱德华氏菌的体外抑/杀菌作用，其中石榴皮效果最佳，MIC为15.625 mg/mL[11]。然而，体内试验数据的缺失致使石榴皮在花鲈抗杀鱼爱德华菌感染中的作用无法明晰。本研究中，通过将石榴皮水提物添加到花鲈日常饲料中，探究短期内石榴皮水提物拌饲投喂对花鲈血清生理生化、免疫相关酶活、组织免疫相关基因表达量，以及对花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌后死亡率的影响，以期为养殖生产中使用石榴皮水提物增强鱼类免疫力及抗病力提供数据支撑，为石榴皮替代抗生素防控花鲈细菌病害提供科学参考。
1 材料方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及试验动物 致病性杀鱼爱德华氏菌(E.piscicida 18BJ136)由课题组从患病花鲈中分离保存。健康花鲈购于广东省珠海市斗门区粉洲村某养殖场，体质量为(10.14±2.53)g，体长为(9.07±0.72)cm，暂养15 d后开始试验。
1.1.2 试剂 石榴皮购自广东省珠海市斗门区某药房；海水鱼配合饲料(0.8号)购自珠海市德海生物科技有限公司；脑心浸出液肉汤(BHI)培养基购自广东环凯微生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 石榴皮水提物的制备 将石榴皮在60 ℃下烘干后粉碎，称取100 g的石榴皮粉用纱布包裹，注入500 mL纯水，浸泡2 h，武火煮沸后，文火熬制30 min，用4层纱布过滤，重复过滤两次，收集滤液，将滤液在水浴锅内95～100 ℃下常压蒸发浓缩至100 mL，121 ℃下灭菌20 min，置于4 ℃下保存。得到终质量浓度为1 000 mg/mL(相当于生药质量浓度1 g/mL)的石榴皮水提物。
1.2.2 石榴皮水提物拌饲投喂试验 选取360尾健康花鲈，随机分为3组，每组120尾，分别暂养于2 m3水池内，连续充气，水温为(31±1)℃，每天换水1次，正式试验的前一天停止喂食。试验中花鲈的日投喂量为鱼体质量的3%，每天早、晚各1次，连续投喂7 d。其中，试验组1和试验组2拌饲投喂石榴皮水提物，按每kg配合饲料中分别添加4、8 mL终质量浓度为1 000 mg/mL的石榴皮水提物，配制成4、8 g/kg的中草药试验饲料[12]；对照组投喂正常配合饲料。
1.2.3 样品采集 在石榴皮水提物拌饲投喂3、5、7 d后，从各组取3尾鱼，将花鲈牺牲后解剖取其头肾、脾脏和鳃组织，立刻将组织样品悬浮在RNA保存液中，4 ℃下保存过夜，之后转移到-20 ℃中保存，用于免疫相关基因表达水平的测定。
在石榴皮水提物拌饲投喂3、5、7 d后，从各组取10尾鱼，使用1 mL无菌注射器快速从尾部静脉抽血，血液在4 ℃下静置12 h后，以6 000 r/min离心10 min，取上清液于-80 ℃超低温冰箱中保存，用于生理生化及免疫相关酶活的测定。
1.2.4 血清生理生化指标的检测 将血清样品送至广东省新海医院检验科，采用日本日立全自动生化分析仪(HITACHI 7180)检测花鲈血清总胆固醇(TC)、谷丙转氨酶(ALT)、谷胱甘肽还原酶(GR)、谷草转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、血糖(GLU)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)共10个指标。
1.2.5 血清中相关酶活力的检测 使用酸性磷酸酶和碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定花鲈血清样品中酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)活性。
1.2.6 脾脏、鳃和头肾组织中免疫相关基因表达的检测 采用荧光定量PCR(qPCR)检测各组织中的免疫相关基因，包括抗菌肽基因(NK-lysin)、免疫球蛋白M基因(IgM)、免疫球蛋白D基因(IgD)和溶菌酶基因(LZM)，以18S rRNA[13]作为内参基因。在NCBI上下载相关免疫基因的cDNA序列，使用在线引物设计网站(Primer3Plus)设计的特异性引物见表1。采用TRIzol Reagent提取组织RNA，分别使用TBE电泳、NanoDrop分光光度计确认RNA纯度和浓度。使用5×All-In-One RT MasterMix试剂盒将RNA逆转录合成cDNA，-80 ℃超低温冰箱中保存。荧光定量PCR在LightCycler® 480 中进行，所有反应均设置3个重复。qPCR反应体系(共10 μL)：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，SYBRTM Green PCR Master Mix 5 μL ，ddH2O 3 μL。采用两步法扩增产物，PCR反应条件：95 ℃下预变性30 s，95 ℃下变性5 s，60 ℃下退火60 s，共进行40个循环。在60～95 ℃下进行溶解曲线分析，以确定每对引物的特异性。反应结束后，采用2-ΔΔCt方法计算基因表达量，以空白对照组相应组织的表达量为基准，计算试验组各组织的相对表达量。
表1 qPCR引物
Tab.1 qPCR primers
基因gene引物序列 (5′-3′)primer sequence (5′-3′)18S rRNAF:GGGTCCGAAGCGTTTACTR:TCACCTCTAGCGGCACAANK-lysinF:AAGCTGAAGTCCGTCTGCAAR:AGCTCCTCGACCAATTTACCAIgMF:TGACCTGTACAGCCTCTGGAR:GATGGTAAACCGGCCCTGAALZMF:TCCAAGTGGGAGTCGAGCTAR:AGCGGCTGTTGATCTGGAAGIgDF:GCCAGATCAACGTCTGACCAR:TGCAGGCTGTCTGATCCAAG
1.2.7 花鲈浸泡感染杀鱼爱德华氏菌 将冻存的杀鱼爱德华氏菌接种于BHI液体培养基中，28 ℃下以180 r/min摇床培养12 h后，菌原液以5 000 r/min离心5 min，收集沉淀，用无菌生理盐水洗涤3次后重悬细菌，制成菌悬液。
用石榴皮水提物拌饲投喂3、5、7 d时，分别从各组取30尾花鲈进行浸泡感染试验，每组30尾花鲈再细分为3个平行，即每个平行用10尾花鲈进行浸泡感染，试验期间水温为(32.0±0.5)℃。在盛有8 L水的玻璃缸中进行浸泡感染试验，3次浸泡攻毒试验水体中杀鱼爱德华氏菌浓度分别为5.24×105 、6.03×105 、5.67×105 CFU/mL，每次浸泡攻毒时长30 min，之后，将花鲈转移到100 L的养殖桶中。攻毒后14 d内记录花鲈的发病症状和死亡情况。试验过程中，对濒死或死后不久的花鲈取其肝脏、脾脏和头肾进行病原平板划线分离，以及菌落PCR分子鉴定。
1.3 数据处理
试验数据用Excel 2022软件进行初步处理，采用GraphPad Prism 9软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 各组花鲈血清生理生化指标的变化
从图1(a)～(j)可见：试验过程中，用石榴皮水提物混合饲料投喂的试验组花鲈，其血清中总胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、谷胱甘肽还原酶、总蛋白、甘油三酯、乳酸脱氢酶和高密度脂蛋白含量总体上较对照组显著升高(P<0.05)；试验组花鲈的血糖含量在投喂3、5 d时均显著低于对照组(P<0.05)，但在投喂7 d时血糖含量显著高于对照组(P<0.05)；试验组谷草转氨酶含量在投喂3、5 d时显著高于对照组(P<0.05)，8 g/kg试验组谷草转氨酶含量在投喂7 d时恢复至对照组水平；4 g/kg试验组低密度脂蛋白含量在投喂3 d时与对照组含量相当，之后逐渐升高，而8 g/kg试验组低密度脂蛋白含量在投喂3 d时显著低于对照组(P<0.05)，之后升高，并在投喂7 d时达到对照组水平。
标有不同字母者表示同一时间点不同组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。
The means with different letters within the same time point are significantly different between different groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter within the same time point are not significantly different，et sequentia.
图1 石榴皮水提物拌饲投喂后花鲈血清生理生化指标和相关酶活力的变化
Fig.1 Changes of serum physiological and biochemical indices and related enzyme activity after feeding Lateolabrax maculatus with Punica granatum L.water extract
2.2 各组花鲈血清免疫相关酶活性的变化
从图1(k)、(l)可见，两个试验组花鲈血清中的碱性磷酸酶活性显著高于对照组(P<0.05)，4、8 g/kg试验组酸性磷酸酶活性分别在投喂5、3 d时酶活性达到峰值，投喂7 d时酶活性恢复到对照组水平或低于对照组水平。这表明，石榴皮水提物拌饲投喂后能够显著增加花鲈血清碱性磷酸酶活性，且高剂量投喂7 d后，可降低鱼体血清内酸性磷酸酶的活性。
2.3 各组花鲈组织免疫相关基因表达量的变化
从图2可见：两个试验组脾脏组织中4个免疫基因相对表达量变化在7 d内有所差异，其中，8 g/kg试验组的4个免疫相关基因相对表达量变化在7 d内均呈现持续性上调，而4 g/kg试验组花鲈脾脏中的NK-lysin、IgD、IgM相对表达量呈现先升高后下降的趋势；两个试验组花鲈鳃组织中的NK-lysin、LZM和IgD基因的相对表达量随投喂时间的延长不断增加，8 g/kg试验组IgM基因的相对表达量也呈持续上升的变化趋势；与脾脏和鳃组织相比，头肾中免疫相关基因的相对表达量变化较小，其中，两个试验组头肾组织LZM和NK-lysin相对表达量变化在0.8以内，而IgM和IgD基因的相对表达量在5 d时达到峰值。
标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。
The means with different lettersare significantly different in the groups at the 0.05 probability level，and the means with the same letter are not significant differences.
图2 花鲈脾脏、鳃和头肾中免疫相关基因的相对表达量
Fig.2 Relative expression of immune-related genes in the spleen，gill and head kidney of Lateolabrax maculatus
2.4 石榴皮水提物对花鲈浸泡攻毒杀鱼爱德华氏菌累积死亡率的影响
从图3可见：投喂石榴皮水提物3 d后的试验组花鲈，在浸泡攻毒后死亡率较空白对照组略有降低(P>0.05)，但投喂石榴皮水提物5 d后，两个试验组花鲈累积死亡率降低至50%左右，且不同添加剂量的试验组间无显著性差异(P>0.05)；石榴皮水提物持续投喂7 d后，4、8 g/kg试验组的累积死亡率分别为70%和90%，明显低于对照组的100%。综上所述，投喂石榴皮水提物5 d后，花鲈浸泡感染后的存活率显著提高，表明石榴皮水提物具有较好的免疫力增强效果，其中，4、8 g/kg试验组的相对保护率分别为50%和47%。通过对患病花鲈病原菌的分离鉴定，证实其死亡由杀鱼爱德华氏菌导致。
图3 花鲈摄食含石榴皮水提物的饲料3、5、7 d后感染杀鱼爱德华氏菌的累积死亡率
Fig.3 Cumulative mortality of Lateolabrax maculatus infected with Edwardsiella piscicida after feeding diets containing water extract of pomegranate peel for 3，5 and 7 d
3 讨论
3.1 石榴皮水提物对花鲈血清非特异性免疫指标的影响
鱼体血液各项生理生化指标受环境压力、病害及食物等影响而发生改变[14]。本研究中，投喂石榴皮水提物的试验组花鲈血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、总蛋白和高密度脂蛋白含量总体上显著高于对照组，分析可能是由于石榴皮水提物中某些成分增加了肝脏代谢负荷，造成了花鲈肝功能障碍。与本研究结果不同，佟延南等[15]发现，在罗非鱼饲料中添加5%板蓝根复方制剂投喂28 d后，血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶均显著低于对照组；龚席磊等[16]研究发现，适量刺五加(Acanthopanax senticosus)水提物作为一种绿色饲料添加剂应用在罗非鱼日常养殖中，试验组鱼血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶含量与对照组无显著差异，但是血清中脂质代谢吸收能力和肝脏的免疫功能却得到改善。与本研究结果类似，在饲料中添加复方中草药后，史氏鲟幼鱼(Acipenser schrenscki)血清中高密度脂蛋白含量显著高于对照组[17]。类似地，宿斌等[18]发现，饲料中添加黄芪(Radix scutellaria)、白术(Atractylodes macrocephala)、防风(Saposhnikovia divaricata)配比制成复方中草药后，哲罗鱼(Hucho taimen)血清中乳酸脱氢酶含量显著升高；饲料中添加葛根(Radix puerariae)、甘草(Radix giycyrrhizae)等配比制成复方中草药后，哲罗鱼血清中总蛋白含量显著提高。综上所述，血清生理生化参数可作为机体健康参考指标之一，但不能以它为唯一标准，由于不同的试验条件下血清生理生化参数结果差异较大，故应当结合其他指标进行统筹分析。
碱性磷酸酶作为一种代谢调控酶，参与代谢营养物质的吸收和利用，与动物的生长性能关系密切，同时也参与了生物体内解毒体系构成，具有促进机体免疫力的作用。本研究结果表明，投喂添加石榴皮水提物的饲料，可显著提高花鲈血清中碱性磷酸酶活性。与本研究结果类似，张永政[19]研究发现，罗非鱼投喂添加黄柏(Phellodendron amurense)的饲料后，鱼体血清中碱性磷酸酶活性随时间延长逐渐增加。此外，王赛赛等[20]发现，在产卵前，大口黑鲈(Micropterus salmoides)雌鱼肝脏中碱性磷酸酶活性随饲料中复合益生菌添加量的增加逐渐增强，机体的防御和免疫功能得到增强，从而提高了子代的成活率。由此推测，花鲈摄入混合有石榴皮水提物的饲料后，机体碱性磷酸酶活性升高，从而增强了鱼体的非特异性免疫能力。以上结果表明，在饲料中添加适量的中草药制剂可提高机体的非特异性免疫酶活，从而增强机体的防御能力和免疫功能，减少养殖中病害的发生。
3.2 石榴皮水提物对花鲈组织免疫相关基因的影响
NK-lysin是一种抗菌肽，具有广谱杀菌活性，主要由T淋巴细胞和自然杀伤细胞合成。免疫球蛋白是体液免疫中B细胞的主要产物，在中和抗原和清除病原中具有重要意义。溶菌酶由非特异性免疫系统中的细胞产生，具有杀菌作用，可水解细菌胞壁上的糖苷键，溶解破裂细菌达到杀菌效果。鳃是鱼类重要的外周黏膜免疫器官之一，鳃中已经发现含有多种天然免疫分子，鳃在抵御病原微生物侵染过程中发挥了重要的免疫屏障作用[21]。
本研究中，4、8 g/kg试验组花鲈脾脏和鳃组织中的免疫相关基因(NK-lysin、IgD、IgM和LZM)显著上调，这与王洪光等[22]的研究结果相类似。此外，有研究发现，用发酵艾草-构树叶复合物饲料长时间投喂鲤(Cyprinus carpio)，可显著提高其免疫相关基因(IL-10、LZM、C3、TNF-α和IL-6)表达量[23]。类似地，陈建军等[24]发现，发酵艾草-构树叶混合饲料组脾脏中IL-10的相对表达量显著高于未添加的对照组。综上所述，中草药作为饲料添加剂应用在水产养殖中，可有效上调机体组织中免疫相关基因的相对表达量。本研究中，花鲈鳃中的免疫相关基因相对表达量在石榴皮水提物拌饲投喂后显著升高，推测可能是由于石榴皮水提物中的有效活性成分通过消化道消化吸收后，经血液传播和物质交换进入鳃组织及细胞，之后作用于细胞，调节细胞内免疫相关机制，进而成功促进了免疫相关基因的高效表达。然而，中草药作为添加剂是如何影响鳃黏膜免疫分子调控网络，或影响其他各免疫器官的抗病机制，进而全局调控机体的免疫功能尚待进一步研究。
3.3 石榴皮水提物对杀鱼爱德华氏菌浸泡攻毒花鲈累积死亡率的影响
鱼类投喂中草药添加剂后，在病原菌侵袭过程中能否成功存活，将成为最直接且有效的评判标准。本研究中，利用石榴皮水提物混合饲料短期投喂的花鲈，通过杀鱼爱德华氏菌浸泡攻毒后，花鲈的累积死亡率均有所下降，其中以投喂5 d的保护效果最佳，相对保护率可达到50%，说明石榴皮水提物在提高机体免疫力并辅助鱼体抵抗杀鱼爱德华氏菌侵染中发挥了一定作用。然而，在攻毒试验过程中还发现，石榴皮水提物的投喂时间与保护效果并不呈正相关。本研究表明，虽然一定浓度的石榴皮水提物可以提高机体免疫力，减少花鲈在细菌浸泡攻毒后的死亡率，但是鱼体内药物含量难以达到杀菌浓度，投喂石榴皮水提物后机体仍可能感染杀鱼爱德华氏菌，甚至死亡。预示对花鲈爱德华氏菌病的防治应以预防用药为主，可以通过中草药的免疫增强作用减少养殖过程中的病害发生，降低死亡率。与本研究结果类似，投喂添加钩吻总碱的团头鲂经嗜水气单胞菌攻毒后，其存活率显著提高[25]；投喂添加黄柏饲料的罗非鱼经无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)攻毒感染后其死亡率低于对照组[19]。饲料中添加不同水平的单方中草药，可不同程度地提高点带石斑鱼(Epinephelus coioides)黏液的抗菌活力，4周后用迟缓爱德华氏菌攻毒，试验组死亡率均低于无添加的空白对照组，其中20 g/kg金银花(Lonicera japonica)组免疫保护率高达90%[26]。此外，中草药除了对鱼类的细菌性病害防控具有良好效果，在病毒和寄生虫疾病中也有其独特作用。陈小龙[27]通过转录组学技术分析发现，用番石榴叶(Psidium guajava)水提物药浴拟穴青蟹(Scylla paramamosain)后，可通过调控体内免疫信号识别、转导及免疫效应的基因表达，提高其非特异性免疫功能，并增强拟穴青蟹的抗病毒能力。李超等[28]研究发现，投喂添加复方中草药制剂饲料的草鱼(Ctenopharyngodon idella)，其吞噬细胞活力、血清溶菌活力和血清抗菌活力等均显著升高，草鱼对多子小瓜虫(Ichthyophthirius multifiliis)及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到提升。但关于石榴皮中草药的合理搭配、正确剂量使用和安全性能验证还待进一步研究。
4 结论
1)添加石榴皮水提物短期内拌饲投喂花鲈，可有效改善鱼体的部分非特异性免疫指标并提高组织中免疫相关基因的相对表达量，表明石榴皮水提液作为一种饲料添加剂可有效增强鱼体免疫力。
2)与未添加的空白对照组相比较，用石榴皮水提物混合饲料投喂花鲈能够显著提高鱼体感染杀鱼爱德华氏菌后的存活率，改善鱼体的抗病能力，揭示了石榴皮可作为防控花鲈杀鱼爱德华氏菌病的候选中草药。
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