金鱼是中国特有的名贵观赏鱼类，具有久远的养殖历史，并因其绚丽的色彩、优美的体态及典雅的游姿深受人们喜爱，享有中国“国鱼”的美誉。金鱼上市前要通过多轮的淘汰优选，出品率极低[1]，以龙睛金鱼Carassius auratus为例，生产中多数仔鱼因身体或颜色上的畸形、残缺而被淘汰，能作为成品鱼上市的比例不足10%。因此，在人工育苗过程中提高亲鱼繁殖性能及仔鱼质量成为金鱼养殖产业中亟待解决的问题。鱼类在繁殖阶段需要大量营养，该阶段营养失衡或缺乏会引起亲鱼性腺发育不良，配子质量低下，进而导致亲鱼繁殖性能及仔鱼质量降低 [2]。因此，满足亲鱼营养需求是提升亲鱼繁殖性能与仔鱼质量的重要保障。但有关金鱼亲鱼的营养需求研究目前几乎还是空白。
维生素C(vitamin C，VC)是维持动物生长和正常生理功能所必需的微量营养元素[3-4]。近年来，对食用鱼的研究发现，VC可通过促进亲鱼性腺发育[8]，改善精卵质量，进而影响亲鱼的繁殖性能[9-10]和后代仔鱼质量[9]。目前，有关VC对观赏鱼生长[5]、免疫、抗应激反应[6]和总色素稳定性[7]的研究已有一些报道，但有关金鱼亲鱼对VC营养需求的研究鲜见报道。
本研究中，以龙睛金鱼为研究对象，开展了VC对龙睛金鱼亲鱼繁殖性能及仔鱼质量的影响研究，探究VC在龙睛金鱼亲鱼性腺成熟、产卵和仔鱼阶段的作用，以期为开发观赏鱼亲鱼营养强化饲料提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用鱼为人工养殖的龙睛金鱼亲鱼，由北京鑫淼观赏鱼养殖中心提供，并在该公司养殖车间进行试验。
1.2 方法
1.2.1 试验设计及饲料制作 试验用鱼为当年繁殖的3月龄龙睛金鱼，初始体质量为(6.60±0.12)g，选取体质健康、摄食活跃的龙睛金鱼作为试验用鱼。试验开始时，随机分配供试鱼至4个试验组，每个试验组设置3个平行，共用12个养殖池(1.5 m×1.5 m×0.6 m)进行养殖，投喂试验饲料至7月龄(当年12月初)时，按雌、雄比为1∶2，每个池随机留下10尾雌鱼和20尾雄鱼越冬培养，待第2年水温达到20 ℃、出现雄鱼追逐雌鱼时(4月中旬)，开始繁殖试验。
试验饲料以鱼粉、豆粕为主要蛋白源，以鱼油、豆油为主要脂肪源，VC添加剂为35%(质量分数)的L-抗坏血酸-2-磷酸酯(购于河北天寅生物技术有限公司)，采用内添加的方式将L-抗坏血酸-2-磷酸酯添加在饲料原料中，与原料一起过 245 μm孔径的筛，用搅拌机混匀后制成直径为 2.0 mm的颗粒饲料(膨化饲料)，于-20 ℃下保存备用。试验饲料由北京友谊恒远科技有限公司加工，以该公司鲫饲料中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的添加量0.05%(质量分数)作为参考，设计试验饲料中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的等比添加量分别为0.05%(对照)0.25%、0.50%和1.00%(均为质量分数)，对应各组饲料中VC含量的计算值分别为0.175、0.875、1.75、3.50 mg/g。试验饲料的组成及营养成分见表1和表2。
表1 试验饲料的组成成分
Tab.1 Ingredient of the experimental diets w/%
VC添加量①/(mg·g-1)VC content豆粕 soybean meal 面粉wheat flour 菜粕rapeseed meal 鱼粉fish meal 谷朊粉wheat gluten 大豆油soybean oil啤酒酵母beer yeast磷酸二氢钙Ca(H2PO4)2氯化胆碱choline chloride 淡水鱼预混料②premix赖氨酸lysine L-抗坏血酸-2-磷酸酯L-ascorbic acid-2-phosphate 0.175(对照)2527.002559.5430.60.20.350.30.050.8752526.802559.5430.60.20.350.30.251.752526.552559.5430.60.20.350.30.503.502526.052559.5430.60.20.350.31.00
注：① 试验饲料中VC添加量为计算值，在淡水鱼饲料中通过调整L-抗坏血酸-2-磷酸酯与非功能类预混物的量实现各组试验饲料中VC的值。② 每千克预混料含(mg·kg-1)：VA，20；VB1，10；VB2，15；VB6，15；VB12，8；烟酸胺，100；泛酸钙，40；生物素，2；肌醇，200；叶酸，10；VE，400；VK3，20；VD3，10；硫酸亚铁，981.2；硫酸锌，320.7；硫酸锰，80；碘化钾，80；亚硒酸钠(10%)，67；氯化钴，0.5；氯化钠，100；硫酸镁，2 000；磷酸二氢钙，5 000；糊精，3 520.6；沸石粉，337 000。
Note: ① the content value of vitamin C in experimental diets is obtained via calculation, and the content of vitamin C in each group is achieved by adjusting the amount of L-ascorbate 2-phosphate ester and non-functional premix in multivitamin in freshwater fish.② carp premix includes the following ingredients (mg/kg): VA，20；VB1，10；VB2，15；VB6，15；VB12，8；niacinaminde，100；calcium pantothenate，40；biotin，2; inositol，200；folic acid，10；VE，400；VK3，20；VD3，10； FeSO4·7H2O，981.2； ZnSO4·7H2O，320.7；MnSO4·H2O，80；KI，80； Na2SeO3 (10%)，67；CoCl2· 6H2O，0.5；NaCl，100；MgSO4，2 000；Ca(H2PO4)2,5 000；dextrin，3 520.6；zeolite，337 000.
表2 试验饲料的一般营养成分
Tab.2 Approximate nutrition level of experimental dietsw/%
VC添加量/(mg·g-1)VC content蛋白质protein粗脂肪crude lipid 水分moisture粗灰分crude ash 0.17533.015.176.163.210.87533.125.156.203.251.7533.095.156.103.193.5033.055.186.103.21
1.2.2 亲鱼管理 亲鱼池保持水深为30～50 cm，越冬时维持在80 cm，采用循环水、充气养殖，每24 h换水量为池水体的1/10。溶解氧保持在6 mg/L以上，氨氮质量浓度<0.2 mg/L，亚硝酸盐质量浓度<0.05 mg/L。养殖车间顶部采用透明阳光板，日照充足。高温季节每天饱食投喂3次，每周停食1 d，越冬时停止投喂。养殖过程中，每半月抽样检测鱼病及健康状况。
1.2.3 受精卵和出膜4 d内仔鱼培育 亲鱼培育期结束后，为了同步试验条件，挑选具备催产条件的试验鱼(雌鱼，手握感觉腹部后端柔软，生殖孔发红且有外翻迹象，腹棱(线)较平整；雄鱼，手触感觉鳃盖追星明显，生殖孔发红且轻触有少量浓稠精液流出)，注射复方鲑促性腺释放激素类似物(购于宁波第二激素厂)，从胸鳍基部注射，雌鱼注剂量为2 U/100 g，雄鱼注射剂量为1 U/100 g；24 h后人工挤卵，并测定每尾产卵亲鱼的产卵量。采用半干法进行人工授精，受精卵采用静水培育，将一定数量的受精卵黏附在白色瓷片上，置于净水容器中，昼夜水温保持在19～24 ℃，pH 7.5，溶解氧>6 mg/L，光照充足。4～5 d仔鱼出膜后适当充气，光照度控制在500 lx之内，每24 h换水1/3。
1.2.4 样品采集与处理 人工授精前，从每个平行随机取3尾雌、雄亲鱼称重，并采集部分精、卵，从尾静脉采集亲鱼血液，制备血清后于-20 ℃下保存，用于非特异免疫指标和激素指标的测定；采血后的亲鱼解剖取其性腺组织称重，并取其脑组织，各组织样品均用液氮速冻后于-80 ℃超低温冰箱中保存备用。雄鱼精液置于4 ℃下保存，用于测定雄鱼精子活力和密度。
1.2.5 仔鱼质量评价 将一定数量的受精卵黏附在白色瓷片上，静水培养，用来统计受精率、发眼率、出膜率和仔鱼4 d时的成活率。
1.2.6 指标的测定与计算
1)精子活力。取4 ℃下保存的各试验组精子样品，快速用养殖池水稀释20倍后，滴加在精子分析仪上，利用精子分析系统MX 7.5检测精子存活率和精子密度。
2)繁殖性能及仔鱼质量(kg)。相关计算公式为
相对怀卵量=可挤出成熟卵数量/鱼体质量，
受精率=受精卵数量/总卵数×100%，
发眼率=发眼卵数量/受精卵数量×100%，
出膜率=出膜仔鱼数量/发眼卵数量×100%，
4 d仔鱼成活率=96 h时仔鱼数量/出膜鱼
数量×100%。
3)血清中雌二醇(Estradiol，E2)和睾酮(Testosterone，T)水平，采用北京北方生物技术研究所有限公司生产的试剂盒检测血清中E2和T水平,具体测定方法参照试剂盒说明书。
4)非特异免疫指标水平。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活力及丙二醛(MDA)含量；采用浙江维益生物科技有限公司生产的试剂盒检测补体C3水平。
1.2.7 雌二醇受体(Erα)、睾酮受体(AR)、PPAR抗氧化受体(PPARγ、PPAR α)和芳香化酶(CYP19a1a)基因表达水平的测定 采用Trizol法提取卵巢与精巢组织中的总RNA。使用反转录酶FastQuant RT Kit (with gDNAase，TIANGEN)进行cDNA反转录。以18S rRNA为内参，采用qRT-PCR检测CYP19a1a、Erα、PPAR γ、PPAR α和AR基因的相对表达水平，qRT-PCR的特异性引物设计序列见表3，具体操作参照习丙文等[11]的方法。
1.3 数据处理
试验结果以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
表3 RT-PCR引物序列
Tab.3 Real-time PCR primer sequence
基因 gene 引物序列 primer sequence (5'-3')CYP19a1aforward:TTGTGCGGGTTTGGATCAATG-GTGreverse:TTCCGATACACTGCAGAC-CCAGTTERαforward:GAGGAAGAGTAGCAGCACTGreverse:GGCTGTGTTTCTGTCGTGAGPPAR γforward:AGAGGAGAGGCGAGTGGTGTAreverse:CAAGTGTAGCGGTAGGTGAT-GAAGARforward:GATGAAAGGTCCAGAGGAGGreverse:ACTGTGAGTGGAACGTCAGG18S rRNAforward:CCTGAGAAACGGCTACCACATCreverse:CCAATTACAGGGCCTCGAAAG
2 结果与分析
2.1 VC对亲鱼繁殖性能及后代仔鱼质量的影响
从表4可见：各组龙睛金鱼亲鱼的相对怀卵量有显著性差异(P<0.05)，其中1.75 mg/g VC添加组的相对怀卵量最高，且显著高于3.50、 0.175 mg/g VC添加组；各试验组间精子存活率和受精率无显著性差异(P>0.05)，均为1.75 mg/g VC添加组最高，精子存活率和受精率最高分别为94.65%和91.50%；饲料中VC水平对亲鱼的精子密度有显著性影响(P<0.05)，0.875、1.75 mg/g VC添加组的雄鱼精子密度显著高于其他两组(P<0.05)。
从表4还可见：饲料中VC水平对龙睛金鱼的发眼率、出膜率和4 d仔鱼成活率存在显著性影响(P<0.05)；1.75 mg/g VC添加组这3项指标均为最高，且显著高于其他各组(P<0.05)，各试验组4 d仔鱼成活率均在80%以上。
从表5可见：雌性亲鱼血清E2水平随饲料中VC含量变化发生显著性变化(P<0.05)，其中以1.75 mg/g VC添加组E2水平最高，且与 3.50 mg/g VC添加组存在显著性差异(P<0.05)；各组间雄性亲鱼血清T水平无显著性差异(P>0.05)。
从图1可见：1.75 mg/g VC添加组雌性亲鱼的ERα表达量最高，且显著高于0.175、3.50 mg/g VC添加组(P<0.05)；1.75 mg/g VC添加组雌鱼卵巢中CYP19a1a基因表达量最高，且显著高于 3.50 mg/g VC添加组(P<0.05)；0.875 mg/g VC添加组雄性亲鱼精巢中AR表达量最高，且显著高于其他VC组(P<0.05)。
2.2 VC对亲鱼非特异性免疫能力的影响
从表6可见：饲料中添加VC能显著增加雌性亲鱼的血清C3水平(P<0.05)，并降低LZM水平(P<0.05)；饲料中VC添加量对雄性亲鱼血清C3、LZM水平无显著性影响(P>0.05)。
表4 饲料中VC添加量对亲鱼繁殖性能及仔鱼质量的影响
Tab.4 Reproductive performance and larval quality of tested fish fed diets containing different contents of VC
VC添加量/(mg·g-1)VC content 相对怀卵量/(105 eggs·kg-1)fecundity精子存活率/%sperm motility精子密度/(109 ind.·mL-1)sperm concentration受精率/%fertilization rate发眼率/%eyed rate 出膜率/%hatching rate 4 d仔鱼成活率/%4-day survival rate of larvae0.17593.10±10.97a85.87±2.945.23±0.36a90.55±3.7054.39±5.38b75.23±4.33a80.53±2.86a0.875150.10±8.46ab84.29±2.659.49±0.31b88.30±4.5156.36±2.07b78.44±4.55a87.22±1.47b1.75188.45±19.42b94.65±4.0212.09±2.72b91.50±5.0091.14±1.38c92.00±1.06b96.31±0.95c3.50120.88±31.48a93.60±2.234.47±0.62a89.15±6.6640.05±6.16a78.40±4.16a83.98±0.37ab
注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。
Note: The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same column are not significant differences,et sequentia.
表5 饲料中VC添加量对亲鱼血清性激素水平的影响
Tab.5 Sex hormone levels in serum of tested fish fed diets containing different contents of VC
VC添加量/(mg·g-1)VC content雌鱼血清雌二醇水平/(pg·mL-1)E2 level of female fish雄鱼血清睾酮水平/(ng·mL-1)T level of male fish0.17572.40±8.15ab4.64±0.320.87571.21±7.72ab5.53±0.211.75 78.22±9.13b5.48±0.843.5047.30±1.71a5.24±0.98
标有不同字母者表示同一指标下不同VC水平组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同。
The means with different letters within same index are significant differences in the different VC level groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.
图1 饲料中VC添加量对亲鱼性腺性类固醇激素 ERα、 CYP19 a1 a和 AR基因表达水平的影响
Fig.1 Sex steroid hormone gene expression levels in gonads of tested fish fed diets containing different contents of VC
2.3 VC对亲鱼抗氧化性能的影响
从图2可见：随着饲料中VC添加量升高，亲鱼血清SOD水平呈先上升后下降的趋势，在1.75 mg/g VC添加组雌鱼和雄鱼血清SOD活力均达到最高，且显著高于其他VC组(P<0.05)，但其他各组间亲鱼卵巢和精巢中SOD水平无显著性差异(P>0.05)；饲料中VC添加量对雌鱼卵巢MDA水平有显著性影响(P<0.05)，0.875、1.75 mg/g VC添加组亲鱼卵巢MDA水平显著高于0.175 mg/g VC添加组(P<0.05)；饲料中VC添加量对雌鱼血清CAT水平有显著性影响(P<0.05)，以1.75 mg/g VC添加组的CAT水平最高，且显著高于其他VC组(P<0.05)。
图2 饲料中VC添加量对亲鱼血清及性腺中SOD、MDA和CAT水平的影响
Fig.2 Levels of SOD, MDA and CAT in serum and gonads of tested fish fed diets containing different contents of VC
表6 饲料中VC添加量对亲鱼血清中C3和LZM水平的影响
Tab.6 Levels of serums C3 and LZM of tested fish fed diets containing different contents of VC
VC添加量/(mg·g-1)VC content雌性亲鱼 female broodstock雄性亲鱼 male broodstock补体C3/(g·L-1)溶菌酶 LZM/(U·mL-1)补体 C3/(g·L-1)溶菌酶 LZM/(U·mL-1)0.175 0.069±0.002ab24.26±1.73ab0.069±0.00325.49±1.520.875 0.068±0.001a18.81±4.26ab0.069±0.00218. 98±1.331.75 0.070±0.001ab28.00±5.26b0.069±0.00227.44±4.823.500.073±0.002b13.07±2.06a0.070±0.00131.69±5.91
从表7可见：饲料中VC添加量对雌鱼卵巢PPARγ水平有显著性影响(P<0.05)，以1.75 mg/g VC添加组卵巢PPARγ表达水平最高，且显著高于0.875、3.50 mg/g VC添加组(P<0.05)；饲料中VC水平对雄性亲鱼精巢PPARγ水平无显著性影响(P>0.05)。
表7 饲料中VC添加量对亲鱼性腺 PPARγ表达水平的影响
Tab.7 Relative PPARγ expression level in ovary and testis of tested fish fed diets containing different contents of VC
VC添加量/(mg·g-1)VC contentPPARr卵巢 ovary精巢 testis0.175 1.06±0.27ab1.30±0.490.875 0.55±0.22a1.17±0.091.751.59±0.17b1.09±0.153.50 0.49±0.02a1.49±0.08
3 讨论
3.1 VC对亲鱼性激素合成的影响
VC被认为是卵泡细胞合成分泌雌激素的一种辅助因子，参与调节机体内雌激素的合成与分泌[12]，并影响性腺发育。雌激素E2可以诱导雌鱼性腺发育，基因CYP19a1a和ERα通过调控激素水平参与雌鱼卵巢分化。本研究中，经过4个月的VC营养强化后，发现饲料中VC添加量为1.75 mg/g时，雌性亲鱼血清E2水平、CYP19a1a表达水平、ERα基因表达水平及相对怀卵量均高于另外两组VC含量较低的试验组(0.175、0.875 mg/g)，即基因水平、激素水平和繁殖性能结果一致，这说明饲料中VC含量提高有利于雌鱼卵巢发育，进而提高了雌鱼的产卵性能。这与对大西洋鲑Salmo salar亲鱼的研究结果一致[13]。当饲料中VC添加量提高至3.50 mg/g时，E2水平、CYP19a1a表达水平和ERα表达水平及相对怀卵量均出现下降。这可能是由于VC含量过高或营养不均衡，通过“脑—脑垂体—性腺”内分泌系统抑制了E2合成，影响到亲鱼的生殖进程。
本研究中，雄鱼AR表达水平随VC添加量增加呈先升高后降低趋势，与雌鱼激素相关基因的变化趋势一致。雄鱼血清中睾酮T水平随饲料中VC水平的变化趋势与雌鱼血清E2的变化趋势并不一致。这可能是由于T是E2的底物，E2是在芳香化酶(CPY)的作用下由T转化而来的[14]，因此，饲料中VC添加量对T和E2的刺激效果不同。
3.2 VC对亲鱼繁殖性能的影响
VC对鱼类繁殖性能的重要影响已被广泛研究证实。利用添加VC的饲料连续投喂遮目鱼Chanos chanos 3年后，遮目鱼亲鱼的产卵量、孵化率和鱼苗成活率均得以提高[15]。对大菱鲆Scophthalmus maximus[8]、半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis[9]等的研究均发现，饲料中添加VC能有效提高亲鱼的精子密度和卵子受精率。本研究中，饲料中VC添加量为0.175～1.75 mg/g时，供试亲鱼的相对怀卵量、精子存活率和精子密度均随饲料中VC添加量升高而上升，与上述研究结果一致。当VC添加量提高至3.50 mg/g时，龙睛金鱼相对怀卵量、精子存活率和精子密度反而下降。这与对大菱鲆[8]亲鱼的研究结果有所差别，在大菱鲆亲鱼饲料中VC添加量为0.80 mg/g时，其产卵量与对照组相比显著增加，而当VC添加量增加到4.80 mg/g时，大菱鲆亲鱼的产卵量与0.80 mg/g VC组相比无显著性差异，但有升高趋势。这种差异可能与鱼的种类有关，不同鱼类对VC的需求、敏感度和耐受能力不同。对龙睛金鱼而言，饲料中添加1.75 mg/g VC可能更有利于提高亲鱼产卵量。
3.3 VC对亲鱼健康及后代仔鱼质量的影响
观赏鱼饲养过程中常面临营养过剩或匮乏所引发的营养性应激反应。应激压力易导致机体非特性免疫防御系统遭到破坏，外源病菌易感性增加[16]。观赏鱼亲鱼免疫力低不仅影响自身健康与观赏性能，同时可能影响后代仔鱼质量。本研究表明，饲料中VC添加量对雌鱼血清C3、LZM、血清SOD、CAT及卵巢PPARγ水平均有显著影响，适宜的VC含量(0.875～1.75 mg/g)能显著提高龙睛金鱼雌鱼的非特异免疫能力和抗氧化性能；同时，仔鱼发眼率、出膜率和仔鱼出膜后4 d的成活率对VC添加量的响应变化趋势与雌鱼非特异免疫力一致。经典免疫学认为，母源免疫在免疫防御中发挥重要作用，雌性亲鱼免疫力和抵抗力的提高，可由卵子直接传递到初生子代，从而提高子代质量[17]。因此，推测饲料中VC可能通过增强雌性亲代免疫力提升后代质量。
3.4 龙睛金鱼亲鱼饲料的适宜VC水平
培育健康、优质的后代仔鱼是观赏鱼亲鱼培育的主要目标。亲鱼在性腺发育过程中，尤其是卵子需要积累大量营养物质以满足胚胎和仔鱼早期的正常发育[2-3]。因此，亲鱼营养状况直接影响亲鱼繁殖性能及后代仔鱼产量[3]。本研究中，VC添加量为0.875 mg/g时，虽然从相对怀卵量、精子密度和4 d仔鱼成活率方面对亲鱼的繁殖性能和后代质量有一定促进作用，但饲料中VC的含量显然不能满足亲鱼在繁殖期对VC的需求；而VC添加量为1.75 mg/g时，对亲鱼的繁殖性能有显著改善。值得注意的是，在饲料中VC添加量增加至3.50 mg/g时，亲鱼繁殖性能相比1.75 mg/g VC添加组反而出现下降。综合考虑，饲料中添加1.75 mg/kg VC更有利于改善龙睛金鱼亲鱼的繁殖性能。
普通金鱼饲料VC含量一般在0.140～0.17 mg/g，基本能够满足日常营养需求，但本研究中发现，VC添加剂量为0.875～1.75 mg/g时才能满足亲鱼对VC的需求。对虹鳟Oncorhynchus mykiss的研究也发现类似现象，虹鳟生长发育所需VC添加量为0.05 mg/g，但亲鱼繁殖期所需VC添加量为0.40 mg/g[18-19]。这可能是因为鱼类在亲鱼阶段对VC需求量更高的原因。
4 结论
1)饲料中添加VC后，龙睛金鱼亲鱼雌鱼血清C3、LZM、SOD、CAT及卵巢PPARγ水平均显著改善，说明饲料中添加适量的VC能提升龙睛金鱼亲鱼的非特异性免疫能力和抗氧化能力。
2)饲料中添加VC后，龙睛金鱼雌性亲鱼相对怀卵量、雄性亲鱼精子存活率和精子密度均显著提高，说明饲料中添加适量的VC能改善龙睛金鱼亲鱼的繁殖性能。
3)饲料中添加VC后，龙睛金鱼仔鱼发眼率、出膜率和仔鱼出膜后4 d成活率显著提升，说明饲料中添加适量的VC能提高龙睛金鱼仔鱼质量。
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