鲢Hypophthalmichthys molitrix是中国最丰富的养殖淡水鱼，因其生长速度快、饲料利用率高、营养价值高而备受关注[1]。然而，因其肌肉骨骼中含有强烈的土腥味和霉味及较多鱼刺使消费受到限制[2]，鱼糜加工是利用商业价值低的鱼类资源的有效途径[3]。
壳寡糖(chitooligosaccharides，CO)由甲壳质脱乙酰化的产物壳聚糖降解获得[4]，是由 2～10个氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖，相对分子质量一般低于5 000[5]，也是天然糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，水溶性好，易吸收[6]。壳寡糖具有独特的生物活性及抗氧化功能[7]，可以提高人体免疫力[8],有抗肿瘤[9]、抑菌[10]、增殖肠道有益菌[11]等功效。褐藻寡糖(alginate oligosaccharides，AO)由褐藻胶降解获得,是低分子低聚物，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)两种单体通过α-1，4糖苷键链接聚合而成，聚合方式主要有3种，即 MM、GG 和 G/M[12]。褐藻寡糖具有高溶解度、生物利用度和多重生物活性，如保护神经元[13]、抗氧化、免疫调节[14]、抗炎、抗肿瘤[15-16]等。
蛋白质与糖的相互作用对蛋白质的功能特性有贡献，已引起了研究者的广泛关注[17]。如低聚异麦芽糖与蛋清蛋白通过共价键链接形成的复合物有更好的溶解度[18]；大豆分离蛋白与CO通过共价键结合后，导致大豆分离蛋白解折叠，有更多的羟基结构，以及更无序的二级结构，降低了大豆蛋白表面疏水性和乳化活性，显著提高了蛋白质的乳化活性，同时具有较好的水油结合能力并能在乳浊液中的油滴中形成较厚的蛋白质外层[19-20]；低木聚糖还具有稳定肌原纤维蛋白凝胶性和乳化性的作用,可以防止肌原纤维蛋白结构变化[21]；寡糖还具有预防肌原纤维蛋白冷冻变性的功效，可以通过稳定蛋白质周围的水的结构来稳定蛋白质[22]，如CO、AO可以提高鳙及虾蛋白质的稳定性[23-24]，卡拉胶寡糖与虾肌球蛋白相互作用，通过与极性残基形成氢键来取代蛋白质表面周围的部分水分子，从而使肌肉蛋白质在冷冻储存期间的稳定性增加[25]。
目前，有关寡糖对蛋白质影响的研究主要集中在功能性质的改善上，缺乏寡糖对蛋白质结构修饰的深入了解。因此，本文中研究了用酶解法获得的AO和CO对低盐(1.5%食用盐添加量)鲢鱼糜的冷冻稳定性、冰点、热稳定性、化学作用力及肌原纤维蛋白的二、三级结构的影响，以期为进一步研究加工及消化过程中蛋白质的变化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
冷冻鲢鱼糜购自湖北省洪湖市井力水产食品股份有限公司；酶解壳寡糖(CO)和酶解褐藻寡糖(AO)均购自中科荣信生物科技有限公司；食用盐购自潍坊千源盐化有限公司。
试剂：溴化钾(天津市大茂化学试剂厂)(光谱纯)，氯化钠(辽宁泉瑞试剂有限公司)，氢氧化钠(天津市东丽区天大化学试剂厂)，乙醇(天津市北联精细化学品开发有限公司)，尿素(国药集团化学试剂有限公司)，β-巯基乙醇(上海雅吉生物科技有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)(青岛捷世康生物科技有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。
仪器与设备：DS-1高速组织捣碎机(上海标本模型厂)，立式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)，SynergyH1/H1M酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，高速冷冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，Q20差示扫描量热仪(DSC，美国TA 仪器公司)，F-2700荧光分光光度计(日本Hitachi公司)，NEXUS670型红外光谱仪(美国PerkinElmer公司)，UV-9000型双光束紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 样品的制备 将冷冻的鲢鱼糜于4 ℃层析柜中解冻过夜，取20 g鲢鱼糜，加入1.5%食用盐擂溃5 min，分别添加10 mL 0.5%、1.0%(均为质量分数，下同)的CO、AO溶液，将鲢鱼糜水分含量调整为76%，以添加10 mL蒸馏水的样品为空白，继续擂溃2 min使水分与鲢鱼糜充分混匀，得到不同寡糖及不同添加量的寡糖-鱼糜复合样品。
1.2.2 肌原纤维蛋白的提取 参考仪淑敏等[26]的方法，分别取制备的5 g样品，加入25 mL 10 mmol/L的Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液，于4 000 r/min下均质2 min后，4 ℃下以5 000 r/min离心15 min，取沉淀加入100 mL 10 mmol/L Tris-HCl(0.6 mol/L NaCl，pH 7.2)缓冲液，于4 000 r/min下均质30 s，4 ℃下以4 500 r/min离心20 min后取上清，即为肌原纤维蛋白(MP)。用双缩脲试剂测定样品蛋白MP的浓度。用10 mmol/L Tris-HCl(0.6 mol/L NaCl，pH 7.2)缓冲液将MP配制成质量浓度为1 mg/mL。
1.2.3 样品的DSC(differential scanning calorimetry)扫描 参考黄海等[27]的方法，称取13～15 mg样品，放入氧化铝坩埚底部密封。使用标准品对DSC仪进行校准后进行样品测定，以密封的空坩埚为对照。测定程序为：初始温度与结束温度均设定为15 ℃，先以10 ℃/min降温到-50 ℃并保持10 min，再以5 ℃/min升温到15 ℃保持1 min，以5 ℃/min升温到100 ℃后以50 ℃/min降温到15 ℃。在升温曲线上把相变峰温度确定为鱼肉的冰点(Tp2)[28]。
水分形态主要包括可冻结水(freezable water,FW)和非冻结水(non-freezable water,NFW)，采用DSC进行分析，计算公式为
FW=ΔH2/ΔH0×100%，
NFW=1-FW。
其中：ΔH2为用鲢鱼糜凝胶DSC测得的吸热峰面积计算的单位质量焓变(J/g)；ΔH0为纯水的单位质量焓变(J/g)。
在40～80 ℃下分析样品的热稳定性。使用TA Universal Analysis软件进行数据记录并分析各处理组样品DSC 图谱各峰的变性温度和变性焓。
1.2.4 样品化学作用力测定 根据Li等[29]的方法稍做修改。取2 g样品，分别与10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)、0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素+1.5 mol/L β-巯基乙醇(SE)混合，在4 000 r/min下均质3～5 min后，4 ℃下静置1 h，以8 000 r/min离心10 min。使用考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质的含量。离子键以溶解于SB溶液与SA溶液中的蛋白质含量之差表示；氢键以溶解于SC溶液与SB溶液中的蛋白质含量之差表示；疏水相互作用力以溶解于SD溶液与SC溶液中的蛋白质含量之差表示；二硫键以溶解于SE溶液与SD溶液中的蛋白质含量之差表示。每个样品重复测量3次。
1.2.5 肌原纤维蛋白的傅立叶红外光谱(FTIR)测定 根据Xu等[30]的方法稍做修改。取制备好的肌原纤维蛋白溶液，冷冻10 h后进行冷冻干燥。取2 mg冻干后的样品与100 mg无水溴化钾充分混合，在约18 N的压力下加压2 min，形成溴化钾压片。用NEXUS670型红外光谱仪进行测量和分析，光谱观察范围为400～4 000 cm-1。
使用Peak Fit软件对酰胺Ⅰ谱带的原始光谱曲线拟合。1 600～1 639 cm-1被认为是β-折叠波段，1 640～1 650 cm-1被认为是无规则卷曲波段，1 651～1 600 cm-1被认为是α-螺旋结构波段，1 661～1 700 cm-1被认为是β-转角结构波段[31]。蛋白质二级结构的百分比由积分面积来计算。
1.2.6 肌原纤维蛋白的内源荧光光谱测定 将样品蛋白浓度调节为1 mg/mL，采用荧光分光光度计进行荧光光谱扫描，激发波长为280 nm，扫描范围300～450 nm，测量荧光强度[32]。采用Stern-Volmer方程计算荧光淬火常数(Ksv)[33]：
F0/F=1+Ksv[Q]。
其中：F0和F分别为空白和添加寡糖处理组蛋白溶液的最高点荧光强度；[Q]为寡糖质量分数；Ksv为常数。
1.2.7 肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱测定 将样品蛋白质量浓度调节为1 mg/mL，以10 mmol/L Tris-HCl(0.6 mol/L NaCl，pH 7.2)缓冲液作为对照，用紫外可见分光光度计在230～350 nm内获得紫外吸收光谱。使用OriginPro 2017软件处理紫外吸收光谱，获得二阶导数图谱，280～300 nm的紫外二阶导数光谱可用于检测酪氨酸(Tyr)微环境中蛋白质的构象变化[34]，其中，a和b代表两个主峰的峰谷值，根据r=a/b求r值[35]。
1.3 数据处理
试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 样品DSC扫描结果
从表1可见：与空白组相比，AO组鲢鱼糜的水分结晶峰值和△H1升高且1.0%组最高，而CO组的水分结晶峰值和△H1降低且0.5%组最低；样品在-10～10 ℃出现的吸热峰，为冰点峰Tp2，冰点峰值均降低，0.5%CO组冰点峰值最低；样品中的可冻结水在升温过程中发生焓变(△H2)，CO组△H2降低，可冻结水含量降低，而AO组△H2升高，可冻结水含量升高。
从图1可见，40～80 ℃范围内有3个峰，分别代表肌球蛋白头部、肌球蛋白尾部与肌浆蛋白及肌动蛋白引起的热流变化，峰的顶点温度(表1，TpⅠ、TpⅡ、TpⅢ)为变性温度，该温度越高，蛋白质热稳定性也越高[36]。由表1还可以看出，经寡糖修饰后各寡糖组峰Ⅰ值、峰Ⅲ值均升高，且1.0%组较高。
图1 空白样品DSC图谱
Fig.1 DSC of blank sample
表1 样品的转变温度、焓值和水分含量
Tab.1 Transition temperature,enthalpy and moisture content of sample
样品sample水分结晶峰moisture crystallization peak冰点峰freezing peak含水量water content峰Ⅰpeak Ⅰ峰 ⅡpeakⅡ峰 ⅢpeakⅢ总焓total enthalpy温度1/℃Tp1变性焓1/(J·g-1)ΔH1温度2/℃Tp2变性焓2/( J·g-1)ΔH2可冻结水/%FW非冻结水/%NFW温度Ⅰ/℃TpⅠ温度Ⅱ/℃TpⅡ温度Ⅲ/℃TpⅢ变性焓3/( J·g-1)ΔH3空白blank-11.23140.701.16125.1037.4662.5450.2969.1275.890.330.5%CO-18.6128.52-4.5325.067.5092.5053.7964.0584.470.031.0%CO-11.42121.00-0.0195.8428.6971.3156.3368.2886.570.020.5%AO-8.66157.60-0.24129.6038.8061.2053.4269.7281.010.381.0%AO-9.85164.200.35140.8042.1657.8456.2768.8586.650.37
2.2 样品化学作用力结果
从表2可见:鲢鱼糜中存在大量离子键和氢键，与空白组相比，经0.5%AO和0.5%CO修饰后的样品离子键含量升高，而经1.0%AO和1.0%CO修饰后的样品离子键显著降低(P<0.05)，1.0%AO组离子键含量降低较大，对应的疏水作用力降低，相反，CO组疏水作用力增加；而经寡糖修饰后的样品氢键含量和二硫键含量均无显著性差异(P>0.05)，此外，除1.0%AO外，其他样品的氢键及二硫键含量均较空白组略有降低。
表2 样品的化学作用力
Tab.2 Chemical interactions of sample mg/mL
样品 sample离子键 ionic bond疏水作用力 hydrophobic bond氢键 hydrogen bond二硫键 disulfide bond空白blank0.041 6±0.009 4a0.018 2±0.005 3ab0.037 9±0.006 7a0.018 2±0.016 6a0.5%CO0.043 6±0.008 5a0.038 4±0.012 4a0.011 5±0.018 6a0.011 7±0.016 3a1.0%CO0.028 2±0.010 4b0.024 4±0.011 2ab0.033 9±0.014 1a0.013 2±0.013 7a0.5%AO0.045 6±0.008 2a0.011 0±0.005 5ab0.036 4±0.004 2a0.011 7±0.022 2a1.0%AO0.013 0±0.002 8b0.003 2±0.001 5b0.048 4±0.005 7a0.021 7±0.083 0a
注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)。
Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level,and the means with the same letter within the same column are not significant differences.
2.3 肌原纤维蛋白的傅立叶变换红外光谱
从图2可见：MP在红外图谱上有多个吸收波段，其中1 629 cm-1处的特征吸收峰代表酰胺Ⅰ带C=O的伸缩振动；1 555 cm-1处的特征吸收峰代表酰胺Ⅱ带C-N的伸缩与N-H的弯曲振动[37]；1 180～953 cm-1范围内有一系列重叠峰，代表C-O和C-C伸缩振动和C-H的弯曲模式。经寡糖修饰后，MP酰胺Ⅱ带的特征吸收峰移动到略低的波数，1 180～953 cm-1区域的透光率变大，3 192 cm-1处的吸收增强。
图2 肌原纤维蛋白傅立叶变换红外光谱
Fig.2 FTIR of myofibrillar protein
从表3可见：MP二级结构含量主要是β-折叠，其次是无规则卷曲、β-转角和α-螺旋；经两种寡糖修饰后，α-螺旋含量均减小，其中AO组降低较大，且0.5%CO和0.5%AO组α-螺旋含量要高于1.0%CO和1.0%AO组；两种寡糖组β-转角含量均降低，且0.5%寡糖组β-转角含量降低较大；经CO修饰后，β-折叠含量下降，而经AO修饰后升高；经两种寡糖修饰后MP无规则卷曲结构含量均较空白组升高，且CO组高于AO组。
表3 肌原纤维蛋白二级结构相对含量
Tab.3 Secondary structure content of myofibrillar protein %
样品sampleα-螺旋α-helixβ-折叠β-sheetβ-转角β-turn无规则卷曲random coil空白blank10.4866.8510.6012.060.5%CO9.7065.469.8315.011.0%CO9.6465.0610.2015.100.5%AO9.3667.449.2813.921.0%AO9.3367.639.5713.47
2.4 肌原纤维蛋白的内源荧光光谱
从图3可见：空白组荧光最大发射波长在331 nm，经寡糖修饰后，MP样品的最大发射波长并没有发生移动，但是荧光强度均有所增强，1.0%CO和0.5%AO组荧光强度增强较大。由Stern-Volmer方程计算得到荧光常数Ksv，结果如图3所示。
图3 肌原纤维蛋白的内源荧光光谱
Fig.3 Endogenous fluorescence spectra of myofibrillar protein
2.5 肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱
从图4(a)可见：MP的最大吸收波长在275 nm附近，经CO修饰后，样品的最大吸收峰并未发生移动，但紫外吸收峰强度增强，而经AO修饰后，0.5%AO紫外最大吸收峰强度降低。为了进一步研究MP构象的细微差异，获得了二阶导数光谱(图4(b))，在288 nm(Trp、Tyr共同作用)和296 nm(Trp作用)处有两个正吸收峰，在284 nm和291 nm处有两个负吸收峰[38]，且经寡糖修饰后并未引起峰移动，样品r值增强，且CO组r值较AO组高(图4(a))。
图4 肌原纤维蛋白的紫外吸收光谱与紫外二阶导数图
Fig.4 Ultraviolet absorption of myofibrillar protein and ultraviolet absorption second derivative plot
3 讨论
3.1 样品DSC分析
差式扫描量热技术可以定量测量样品的物理转变及化学反应，水分状态的改变对食品的储藏性、加工性和商品的利用价值都有极大影响，因此，该技术经常用于测量鱼糜结晶点、冰点等[39]。AO的结构更易于水分子形成更多氢键，以类似“笼形”的“聚集体”结构使更多水分子禁锢在寡糖-蛋白复合网络结构中，不易流动水的流动性减弱，导致冰点降低[40]。本研究表明，CO修饰后鲢鱼糜的冰点更低，CO组鲢鱼糜的冰点与CO含量呈正相关，而AO组呈负相关；CO组鲢鱼糜的可冻结水含量降低，AO组鲢鱼糜的可冻结水含量升高，均与添加的寡糖含量呈正相关。由此推断，CO组对蛋白质的保存有一定优势。
本研究中，寡糖的加入可增强MP的热稳定性。分析原因，寡糖能够通过非共价相互作用和物理缠结改变MP的构象，使寡糖分子结构中的羟基与蛋白质分子中的一些基团发生反应，同时也能增强蛋白质的疏水相互作用[41]，影响多肽链空间结构的重排[42]，从而提高蛋白质的热稳定性。本研究中，与空白组相比，CO组△H3均降低，而AO组均升高。总的来说，AO组和CO组MP热稳定性都有所改善，AO组较CO组更稳定，且经1.0%CO与1.0%AO寡糖修饰后的样品热稳定性较强。
3.2 寡糖对样品化学作用力的影响
鱼糜凝胶系统中的网络结构主要是通过蛋白质分子间与分子内的相互作用来维持，如离子键、疏水性作用力、氢键和二硫键[43]。离子键和氢键是相对于疏水作用力和二硫键较弱的键合力[44]。本研究表明，1.0%AO组离子键被破坏，意味着蛋白质发生了聚集；1.0%AO组疏水作用力显著下降，表明寡糖的修饰使疏水基团暴露，从而使疏水作用升高，相反，CO组疏水作用力增加；此外，除1.0%AO组外，样品的氢键及二硫键含量均降低，可能是在蛋白质展开时，寡糖与蛋白质竞争了水，推测寡糖的加入阻止了-SH键向二硫键转化，蛋白质之间未发生交联作用，因此，二硫键含量降低[44]。
3.3 肌原纤维蛋白结构分析
AO、CO与MP通过静电相互作用结合[45]，但不排除寡糖与蛋白质两者之间发生共价结合，因在室温下，二者形成了弱的凝胶，发生了分子交互作用。本研究表明，经寡糖修饰后，1 180～953 cm-1区域的透光率变大，可能是MP与寡糖之间形成了共价键，导致体系中羟基和碳氧键增多，使得该波段吸收增强，寡糖与蛋白质的作用使MP酰胺Ⅱ带的特征吸收峰移动到略低的波数[46]；复合物在3 192 cm-1处的吸收增强，可能是由N-H的减少引起的。傅立叶红外光谱通常用于研究蛋白质与其他化合物相互作用过程中二级结构的变化。本研究中，经两种寡糖修饰后，AO组α-螺旋含量降低较大，这表明CO较AO有效地维持MP结构的稳定性，其通过与蛋白质分子相互作用抑制水溶性蛋白质和疏水残留物的暴露[47]；寡糖修饰后，样品无规则卷曲结构含量均升高，且CO组高于AO组，可能是由于寡糖的修饰使α-螺旋、β-转角向无规则卷曲改变，蛋白质结构更加无序。以上MP二级结构含量变化的趋势表明，经AO修饰后较CO修饰使蛋白质分子结构更加稳定，CO修饰后对肌原纤维蛋白二级结构的影响较大。
蛋白质内源性色氨酸(Trp)荧光对于其周边微环境的极性非常敏感，因此，其常用于监测蛋白质三级结构的变化[48]。本研究中内源荧光光谱表明，寡糖修饰后，荧光强度增强，1.0%CO组样品荧光强度增加最大，这是由于色氨酸侧链基团埋藏在疏水基团内部，荧光强度增强[49]。由Stern-Volmer方程计算得到各样品的荧光常数Ksv，经寡糖修饰后样品的荧光常数皆为负值，也证实了以上结论。
本研究中经寡糖修饰后，各样品的紫外最大吸收峰并未发生移动，这表明MP中酪氨酸微环境变化不明显。MP紫外吸收峰强度增强，可能源于更多酪氨酸的暴露[35]，说明寡糖与MP之间发生分子内或分子间的相互作用[38]。如图5(b)所示，MP二阶导数光谱在288 nm(Trp、Tyr共同作用)和296 nm(Trp作用)处有两个正吸收峰，在284 nm和291 nm处有两个负吸收峰[38]，且经寡糖修饰后，并未引起峰移动。r值(r=a/b)取决于酪氨酸的相对含量和对水相的暴露，Tyr在溶剂极性中的暴露增加会导致r值增加。经寡糖修饰后，样品蛋白的r值增强，且CO组r值较高，这意味着Tyr暴露较大。
4 结论
1)壳寡糖和褐藻寡糖(1.0%、0.5%)的修饰对鲢鱼糜的热稳定有一定的改善，且1.0%含量寡糖修饰后的鲢鱼糜热稳定性较强，CO组鲢鱼糜比AO组有更好的冷冻稳定性，且0.5%CO组为最佳，1.0%AO组鲢鱼糜也有优势；CO组鲢鱼糜冰点与CO含量呈正相关，而AO组鲢鱼糜冰点与AO含量呈负相关，CO组鲢鱼糜可冻结水含量降低，AO组鲢鱼糜可冻结水含量升高，均与寡糖添加量呈正相关。
2)经0.5%CO和0.5%AO修饰后对蛋白质离子键具有保护作用。
3)两种寡糖与肌原纤维蛋白(MP)之间有静电相互作用，均改变了MP的二级结构，CO组较AO组有更无序的结构；MP三级结构显示，CO较AO更容易使色氨酸埋藏于疏水基团内部，并且更易于酪氨酸的暴露。
4)两种寡糖的修饰使鲢鱼糜及其肌原纤维蛋白结构改变，对鲢鱼糜有一定改善作用，可提高鱼糜产品品质。目前，壳寡糖和褐藻寡糖与蛋白质的作用机理及应用研究仍处于探索阶段，今后应进一步探索寡糖最适添加量，采用微观结构与理化性质相结合的方法，探讨寡糖与蛋白质的交互作用。
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