鱼类年龄硬组织鉴定方法研究应用进展

年龄既是鱼类生长、繁殖和种群结构的基础参数，也是渔业生态学的重要研究内容，准确的鱼类年龄数据有助于评估种群资源、分析种群动力学，以及制定合理的捕捞规划、监测和保护管理措施[1-2]。18 世纪初期，许多科学家开始使用鱼类的骨质结构鉴定鱼龄，至今已有数百年历史。随着信息技术的发展，一些新技术和新方法也被运用到年龄估计，使鱼类年龄的鉴定方法得以丰富与发展，主要分为硬组织鉴定法、体长分析法和放射性元素鉴定法三大类。其中，体长分析法(又称自然长度频率分布曲线法)是较早使用的方法，丹麦学者Petersen于1891年率先采用此法鉴定鱼龄。这种方法适用于测定一年只有一个短繁殖期或个体生长速度近乎相同的鱼类年龄，但缺点是会受到不同世代、水环境、捕捞工具等影响，需要大量渔获物才能获得相对准确的结果，有时可作为硬组织鉴定年龄的辅助方法，以校对结果的准确性。硬组织鉴定法是目前鉴定鱼龄最传统的方法，即通过读取鱼体硬组织(鳞片、骨质结构和眼晶状体)的生长纹(又称轮纹或环纹)鉴定鱼龄；放射性元素鉴定法所用的生物材料主要是耳石和晶状体。因此，从鉴定材料的角度来看，鱼类年龄鉴定的主流方法还是硬组织分析法。硬组织年轮鉴定法主要是基于对硬质结构的不连续生长模式的解释，比如鳞片、耳石等生物矿化组织的季节性或周年性生长所形成的环纹是估计硬骨鱼年龄应用最广泛的方法之一，通常可依据采集或观察的难易程度选择适宜的年龄鉴别材料。眼晶状体是一种高度特化的硬组织，其形态质量常随个体生长发育而增加，具有很强的代谢惰性，对缺乏钙化组织的鱼类年龄鉴定尤为适用。早期的鱼类年龄综述报道多以鳞片、耳石等钙化组织年龄鉴定方法为主[3-4]，近来利用多种硬组织材料共同鉴定年龄的报道越来越多。目前，随着全球气候变化加剧，分布于特定生境下的鱼类(如南极鱼类)年龄相关科学问题也日渐受到关注[5-6]，特别是基于眼晶状体放射性碳元素定年法的拓展应用，使得鱼龄鉴定技术日趋完善，但仍存在技术复杂和准确度低的问题，为此本文总结了利用硬组织(包括晶状体)鉴定鱼类年龄的研究应用进展，分析了不同硬组织鉴定法的优点与局限性，并对鱼类年龄鉴定方法应用前景进行了展望，以期为鱼类年龄鉴定方法的进一步完善提供参考。

1 鳞片鉴定

鱼类钙化组织主要包括鳞片、耳石、脊椎骨、鳍条、鳃盖骨、匙骨等，在过去的40多年里，对这些钙质结构的分析有力推动了渔业科学的发展，特别是对钙化结构的年龄研究已成为认知和评估鱼类种群的公认标准[7]。能够用于鱼类年龄鉴定的钙化组织通常在鱼类个体生活史中是恒定的，且形态特征与个体生长发育规律及环境变化同步[8]。

1.1 鳞片的形成及鉴定原理

鱼类鳞片是体表衍生的有保护作用的硬薄片状结构，其年龄标志主要是基于鳞片环纹的生长和排列：通常在春、夏季营养物质丰富的生长盛期，鳞片上的同心环纹排列间隔宽松且透光性好(疏带)；而在秋、冬季节营养物质匮乏，鱼类生长速度减缓或停滞，鳞片上的同心环纹排列紧密(密带)[9]。因此，鳞片(以疏密型为例)上会呈现出疏密相间的环带(或类似的生长环纹)，一个疏密带构成一个年轮，一般以二者间的交界处作为年龄标志。在众多用于鉴定年龄的组织中，鱼体鳞片数量最多，取材观察最简便，通常可对活体进行无损年龄鉴定(臀鳞除外)[10]。Leeuwen Hoek早在1716年就观察到鲤Cyprinus carpio的鳞片环纹结构，1898年Hoffbaner首次利用鳞片鉴定出鲤年龄，后续研究者验证了鲤、鲂Megalobrama skolkovii等鲤科鱼类年龄可以通过鳞片进行鉴定[11-14]。不过，利用鳞片作为高龄鱼年龄鉴定的材料有一定局限性，主要是因鳞片在生长衰退期时处于负异速生长甚至停止生长[15]，或出现脱落及磨损现象[16-17]，以及鳞片边缘的轮纹不明显，产生副轮、生殖轮、再生轮等不易辨认的结构，从而低估样本的年龄(表1)[18]。

1.2 鳞片分类

鳞片的环纹有日轮和年轮两种类型，通过记录轮纹的数量确定鱼类日龄或年龄[10]。不同鱼类或是同种鱼类的轮纹标志因生长状况不同而各有差异。鳞片的轮纹通常从中心向外呈放射状生长。根据轮纹生长排列的变化特征(表2)可以分为疏密型、切割型、明亮型、平直型和碎裂型，其中切割型又可细分为普通切割型、闭合切割型和疏密切割型[5]。

2 耳石鉴定

耳石是硬骨鱼类内耳膜迷路内的一种钙化组织结构，起平衡和听觉作用，又名听石[19]。其形成于每年的有机基质和碳酸钙共同沉积，主要成分是碳酸钙(占耳石质量的96.2%，3.1%为有机质，0.7%为痕量元素)[20]。有机基质和碳酸钙的沉积速率与鱼体内生理循环、外在的环境变化相关联，耳石轮纹密度也会随之改变，且两者的沉积率是互逆的[21]，产生宽而透明的增长带和窄而不透明的间歇带，从而在耳石上形成疏密相间的沉积层，即耳石轮纹。鱼类耳石具有中心核，是耳石生长的起点。中心核在鱼类孵化期就已形成，并伴随鱼类整个生活史不间断地生长，具有非细胞性和代谢惰性，在整个生活史过程中极少发生耳石分解和重吸收现象，并且耳石位置受到外骨骼的保护，结构稳定且持久[19]。对于硬骨鱼类，这些特征确立了耳石仍是应用最广、最可靠的年龄鉴定材料，常被用于验证其他钙化组织鉴定结果(表1)[7, 22-24]。耳石鉴定方法包括耳石轮纹法和耳石质量法。

2.1 耳石轮纹鉴定

耳石和鳞片一样具有轮纹，通过对耳石上轮纹的观察和记录，可以进行鱼类年龄鉴定[25]。近年来，国内外均有大量的学者把耳石作为鉴定年龄的材料。鱼类耳石依据形态分为微耳石(lapillus)、星耳石(asteriscus)和矢耳石(sagittaes)，分别位于内耳膜迷路的椭圆囊(utriculus)、瓶状囊(lagena)和球囊(sacculus)(图1)[26-27]，其中矢耳石最大，星耳石较小，而微耳石偏扁。

在鱼类生活史中，三类耳石的形状不断发生变化，不同时期耳石鉴定结果的准确性也会随之改变，矢耳石在长椭圆形阶段(11～13 d)后的鉴定成功率在90%以上，微耳石在豆形阶段(12～14 d)后的鉴定成功率在80%以上[28]，因此，难以使用一种耳石作为不同鱼类年龄鉴定的标准。国外学者利用矢耳石鉴定年龄的研究较多，对微耳石和星耳石的报道较少[29]。研究发现，微耳石最适宜作为草鱼的年龄鉴定材料[30]。李鸿等[31]利用4种钙化组织材料对新疆乌伦古湖湖拟鲤Rutilus rutilus年龄进行鉴定，发现微耳石磨片上的年轮特征最清晰，但尚不能准确鉴定4龄及以上的个体年龄，而星耳石的效果较差。Victor等[32]发现，由于鲤科鱼类的矢耳石轮纹不够清晰，星耳石发育形成较晚，故认为微耳石适用于鲤科鱼类的年龄鉴定。因此，应根据鱼的种类及耳石特点选择适合的年龄鉴定材料，避免包埋打磨后出现年轮不清晰、冗繁费时的情形(表1)。

Reibisch于1899年在欧洲鲽Pleuronectes platessa耳石上第一次观察到年轮[33]，而Pannella[25]是最早在银无须鳕Merluccius bilinearis耳石上发现日轮。目前，鱼类耳石上存在日轮的观点被普遍承认，真骨鱼类仔鱼和当年生幼鱼的耳石中普遍存在日轮，即耳石24 h周期性的增长区。日轮主要受控于鱼体内部生理节律，是表征个体早期生长发育的有效指标，利用日轮能确定鱼类生活史早期的一些特殊时间节点，如孵化期、变态、初次摄食等[34-36]。微耳石、星耳石和矢耳石3 种耳石日轮轮纹的清晰度不同，大量研究表明，多数鱼类的矢耳石日轮轮纹较清晰[37-39]。在人工饲养唐鱼Tanichthys albonubes仔鱼的过程中，发现生长过程中唐鱼矢耳石形状变化较大，而微耳石形状稳定，日轮更易读取[40]。此外，日轮鉴定对精度也有很高的要求，鱼体的生长速度、饵料投喂密度、人为误差等因素都会影响到鉴定结果[41-42]。对毛鳞鱼Mallotus villosus幼鱼的研究中证明，生长速度越快的个体，其年龄鉴定结果的精确度就越高[36]。

2.2 耳石质量鉴定

耳石年轮法虽然被广泛使用，但是试验过程难免繁琐耗时。在过去的20年里，耳石质量一直被用于替代和补充传统的年龄估计，主要是基于年龄和耳石质量之间存在可预测的正相关关系[43]，即相比于生长快速且寿命短的鱼类，寿命长和生长慢的鱼类往往具有更重的耳石。热带珊瑚礁鱼类体型普遍小而生长速度慢，耳石年轮负异速生长甚至停滞，但耳石质量与年龄显著相关，根据耳石质量进行鉴定的结果与实际年龄相符[44]，如太平洋沙丁鱼Sardinops sagax[45]和黄尾裸颊鲷Lethrinus mahsena[46]通常以耳石质量替代耳石年轮进行鉴定。近年来，这种方法还成功应用于大西洋鳕Gadus morhua [26]、湖红点鲑Salvelinus namaycush [48]、欧洲鳗鲡Anguilla anguilla [49]和巴塔野鲮Labeo bata [50]等鱼类的年龄估计。相较于读取耳石轮纹，使用耳石质量进行年龄估计的操作更简单、成本更低廉，特别是在处理大量样本时优势明显；但耳石的密度与化学组成直接相关，其质量会受到水温、盐度等环境因素的影响，尤其会影响高龄鱼鉴定结果的精确度，因此，仅依据耳石质量估计鱼类年龄在实际应用中尚存在一定争议(表1)。

3 其他钙化组织鉴定

鱼类的其他钙化组织，如脊椎骨、鳃盖骨、鳍条、匙骨等也可被用来鉴定年龄，或用于其他年龄鉴定方法的佐证(表1)。鉴定鱼类年龄时，由于年轮出现在这些骨质内部，必须经打磨、抛光等物理或化学方法制成薄而透明的骨片方可观察。

1)脊椎骨。脊椎骨作为年龄鉴定的主要材料，其有效性已得到大量的研究证实。早在1759年，Hederstrom就曾利用鱼类的脊椎骨鉴定年龄[2]。谢小军[51]利用嘉陵江南方鲇Silurus meridionalis的胸鳍棘切片与脊椎骨进行年龄鉴定比较，结果显示两者的吻合率高达99%以上。吴清江[52]通过对长吻鮠Leiocassis longirostris的研究同样证实了利用脊椎骨进行年龄鉴定的可靠性。Clay[53]的研究表明，黄边胡鲇Clarias batrachus的脊椎骨鉴定与体长频度分析的年龄相吻合，而背鳍棘和胸鳍棘鉴定与体长频度分析的年龄结果不符。马骏[54]利用复合神经棘上的年轮和脊椎骨上的年轮鉴定黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco的年龄，发现两者的结果完全一致。这些研究表明，脊椎骨可以适用于鲇形目鱼类年龄鉴定。此外，脊椎骨在软骨鱼纲年龄鉴定中的应用更为广泛。Smith[55]将半带皱唇鲨Triakis semifasciata以四环素进行荧光标志，3年后重捕发现，脊椎骨上的标志证实了一年形成一个年轮。Carlson等[56]通过直接观察脊椎骨轮纹鉴定出了窄头双髻鲨Sphyrna tiburo的年龄。Liu等[57]利用硝酸银将大眼长尾鲨Alopias superciliosus的脊椎骨染色，然后通过X射线照射来鉴定轮纹。

2)鳍条、鳃盖骨。相较脊椎骨，背鳍条和神经弓等生物材料更适用于深海软骨鱼类的年龄鉴定[58-59]。近年来，有研究报道，通过鳃盖骨、鳍条等其他钙化组织的轮纹也可以鉴定鱼类年龄。陈昆慈等[60]发现，斑鳠Mystus guttatus的鳃盖骨轮纹排列规则，是年龄鉴定的首选材料。陈军等[61]利用鳃盖骨年轮带对鳜Siniperca chuatsi和大眼鳜Siniperca kneri的年龄进行了比较鉴定。应用鳍条对大眼金枪鱼Thunnus obesus的年龄鉴定较为普遍，通常认为大眼金枪鱼的鳍条轮纹清晰且取材方便，但也有学者在大眼金枪鱼的鳍条切片中发现有脉管化现象，会导致鉴定结果的偏差，并且这种脉管化现象与年龄呈正相关[62-63]。

3)匙骨、舌骨。利用匙骨可成功鉴定出中华鲟Acipenser sinensis的年龄[64]。利用舌骨进行了黄鳝Monopterus albus年龄鉴定，结果发现，基舌骨、上舌骨和间舌骨的轮纹明显且三者间数量相同[65]。

综上所述，这些钙化组织结构常作为鱼类年龄鉴定的辅助材料，并且在鳞片和耳石无法准确鉴定年龄时，可以起到替代作用。

4 晶状体鉴定

鱼类眼晶状体呈圆球体，由极点、赤道部和纤维层构成，是一种高度特化的组织(图2)。晶状体大小随个体生长发育而增加，晶状体在原肠期分化为晶状体上皮细胞和纤维细胞，上皮细胞围绕晶状体分泌保护性透明层；纤维细胞聚集、重叠、成层生长于上皮细胞和相邻晶体皮层之间，形成同心环纹，是晶体蛋白的主要合成场所[66-68]。由于脊椎动物晶状体核的晶体蛋白具有代谢惰性，因此，可用于钙化组织缺乏的软骨鱼类鉴定年龄[69-70]。

4.1 晶状体直径和质量鉴定

晶状体的直径和质量能够反映鱼类个体的生长，通过测量晶状体的直径与质量可鉴定幼龄鱼群体。通过测定罗非鱼Tilapia zilli眼睛晶状体直径和年龄相关性，可作为2龄以上鱼群体的判据[72]。进一步对花斑蛇鲻Saurida undosquamis和多鳞鱚Sillago sihama的研究发现，利用晶状体的直径可以鉴定出1龄鱼群体，而晶状体的质量被证明不可靠[73]。Al-Hassanl等[74]对利比亚班加西海岸的两种鲷科鱼类的年龄研究表明，根据晶状体直径可以判别1～2龄和2～3龄的牛眼鲷Boops boops群体，同样的方法可成功判别尾斑重牙鲷Diplodus annularis的2龄和3龄群体，而用晶状体质量能够较好地判别0～1龄牛眼鲷群体。Al-Dubakel等[75]也发现，可以用晶状体质量作为鯻Terapon theraps、四带牙鯻Pelates quadrilineatus和黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus 3种海洋鱼类幼龄(0～3龄)个体的年龄判别指标。利用晶状体环纹也能鉴定鱼类的年龄，但相关研究报道较少[76]。Ferenbaugh[77]研究发现，相较于耳石轮纹，太平洋鲱Clupea pallasii和单鳍多线鱼Pleurogrammus monopterygius的眼睛晶状体环纹并不明显，虽然环纹与耳石轮纹鉴定结果有一定相关性，但数量并不一致。

4.2 晶状体核放射性碳鉴定

放射性碳定年法(radiocarbon dating)，又称“碳-14年代测定法，是利用自然存在的碳14同位素(14C)的放射性进行年龄鉴定的方法。自20世纪50年代和60年代，大气中核试验产生的放射性14C被海洋表层快速吸收，于70年代达到高峰，随后在全球范围内统一下降，由此在碳基年曲线中形成了一种独特的脉冲式14C快速增长期，成为海洋动物年龄估计与鉴定的公认时标[78-81]。

在海洋渔业生态研究中，基于鱼类耳石的14C年龄鉴定应用已越来越广泛[82-83]，但不同硬骨鱼类的耳石大小差别很大[84]，测量时需要用到加速器质谱(AMS)对Δ14C进行稳健分析，精确研磨足够的耳石核材料对于红鲷Lutjanus argentimaculatus这类耳石相对较大的鱼类容易实现，但对于耳石更小的底栖鱼类，微磨耳石核心材料进行AMS分析将是一个挑战[85]。虽然激光消融AMS技术的最新进展提供了从耳石切片中微量获取超低碳质量的方法[86]，然而随着样品质量的降低，测量误差通常会逐渐增大[71]。硬骨鱼晶状体与耳石相似，一旦形成即随个体终生生长，具有典型代谢惰性[87]，且由蛋白质组成的晶状体核的碳含量也可能远高于耳石。事实上，鱼眼晶状体碳约100%来源于代谢碳[66]，耳石碳通常有60%～80%来自溶解无机碳[88]，若以质量而言，获得100 μg的碳用于AMS分析所需的晶状体质量要比耳石核材料小约5倍[71]；另一方面，由于深海中几乎所有的有机碳都来自真光层的浮游植物，所以深海鱼类的眼晶状体C具有表层衍生的Δ14C特征，而它们耳石中与海水表层有关的14C将被耗尽[71]。因此，Patterson Ⅲ等[71]测试了鱼类生命早期形成的晶状体蛋白质的Δ14C值，探究是否可以通过放射性碳定年法验证海洋硬骨鱼的年龄估计，结果显示，墨西哥湾北部珊瑚礁鱼类的耳石和晶状体核Δ14C值之间有很强的一致性。生活于北冰洋的格陵兰鲨Somniosus microcephalus是北极海域的标志性物种，成鱼体长可达500 cm以上，但生长非常缓慢，年增长不足1 cm，由于缺乏钙化组织，常规的生长区域定年法很难适用于格陵兰鲨的年龄鉴定。另一方面，因为晶状体蛋白质主要来源于新陈代谢，而深海中几乎所有的有机碳都来自真光层的浮游植物，即深海鱼类的眼晶状体碳具有表层衍生的Δ14C特征，而其耳石中与海水表层有关的14C将被耗尽[71]。所以，Nielsen等[89]利用放射性碳定年技术对28只雌性格陵兰鲨(体长为81～502 cm)的眼晶状体核进行了测定，结果发现它们的平均寿命高达(392±120)年，性成熟年龄至少为(156±22)年，使格陵兰鲨鱼成为世界上迄今已知最长寿的脊椎动物。这些研究表明，眼睛晶状体核Δ14C可以有效验证海洋鱼类的年龄估计(表1)。

5 存在问题及展望

5.1 重视鱼类年龄鉴定的精度评价

鱼类年龄估计是鱼类种群动态和种群结构评价的关键，经过数百年的发展，各种年龄鉴定技术已日趋完善成熟，然而在精确度上还存在一定不足，因此，今后应重视提高鱼类年龄鉴定的精度。年龄鉴定精度是指用于估算鱼龄硬组织结构多次读数之间年龄估计值的一致性或可重复性,主要指标包括百分比一致性、平均百分比误差(APE)和平均变异系数(ACV)。Campana[1]回顾了渔业文献中测量年龄精度方法的使用情况，推荐了ACV值评价方法，并指出ACV值小于5%表明估算精度高。

5.2 探究鱼类年龄鉴定潜在新方法

目前，关于水生动物年龄与脂肪酸相关性已有一些报道，通常随着年龄增加，水生动物饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸对总脂肪酸含量的占比逐渐增加，而多不饱和脂肪酸的占比逐渐降低。研究表明，枝角类大型溞Daphnia magna脂肪酸C14:0和C16:0与日龄呈正相关，相关系数分别为0.99和0.86[90]。钩虾Gammarus locusta脂肪酸C18:1n9对总脂肪酸含量的占比随生长周期延长而逐渐增加[91]。Herman等[92-93]曾提出用脂肪酸预测虎鲸Orcinus orca和座头鲸Megaptera novaeangliae的年龄。Marcoux等[94]建立了利用脂肪酸组成预测白鲸Delphinapterus leucas年龄的方法，发现C12:0、C14:1n-7和C14:1n-9是与白鲸年龄相关的潜在脂肪酸生物标志物，利用该方法预测白鲸年龄的误差范围是7～10年。进一步分析发现，白鲸年龄和脂肪酸的相关性与鲸脂有关，并且在外层鲸脂中表现更为明显。这主要归因于具有不同熔点的脂肪酸在鲸鱼中的分布通常是分层的，外层鲸油由高比例饱和脂肪酸组成，内层鲸油含有高比例长链多不饱和脂肪酸。由于内层鲸油代谢较活跃，与外层鲸油相比更能反映鲸鱼的食物来源，而外层鲸油能将多余脂肪酸储存起来，进而伴随鲸鱼年龄增加产生长期影响。鱼类的相关研究主要见于鲱Clupea pallasi[95]、鳀Engraulis japonicus[96]等报道，其中鲱的脂肪酸在个体发育过程中变化明显，具有2种年龄指示脂肪酸，并且鲱体长与这2种脂肪酸的相关系数均为0.832，此外饱和脂肪酸C14:0、长链多不饱和脂肪酸EPA和DHA与体长也存在一定的相关性；对鳀的卵、早期发育阶段(后期仔鱼、稚鳀、幼鳀)和成鱼阶段等各生长阶段的脂肪酸含量和组成分析发现，总脂肪酸含量随年龄增长而逐渐增加，鳀的C16:0和DHA对总脂肪酸含量的占比分别逐渐增加和降低。目前，虽然通过脂肪酸鉴定鱼类的研究尚处于试验阶段，但建议今后应完善鱼类脂质组学分析方法，进一步挖掘鱼类年龄特征脂肪酸，将以实际分子形式存在的脂质生物标志物推广应用于深海鱼类的年龄鉴定或佐证研究。

5.3 完善鱼类年龄估计数据读取可视化

通过硬组织轮纹鉴定鱼类年龄的前处理工作对鉴定者的经验和技巧通常要求较高。如使用耳石轮纹进行年龄鉴定前，需要先将鱼类耳石从鱼类的耳囊中摘取出来，并通过打磨、灼烧或者切割的方式获取耳石轮纹，在此过程中，需要注意获取的耳石轮纹一定要包含耳石的中心核，否则会对年龄鉴定结果造成影响。以打磨获取的耳石轮纹为例，通常使用打磨方式获得耳石轮纹后，需要在透射光下进行观察，并以明带作为年龄的标志。同时，在进行鱼类生长相关的研究时，还需要读取轮纹宽度来获得鱼类生长序列。随着计算机技术的发展，硬组织的轮纹读数由传统的人工读取逐渐朝图像自动化计数方向发展，例如采用R程序包测量耳石轮径和年龄自动计数，应用深度学习模型估计图像中耳石的年龄。之前鱼类耳石轮径测量大多采用Image J完成，因其耗时费力，后期处理数据繁琐。目前，使用RFishBC来获取鱼类年龄、耳石年轮宽度数据是比较准确的方法，但是由于技术的进步及对鉴定精度的要求，越来越多的研究开始着手于日轮的研究，在耳石轮纹的研究中，读取日轮的时间成本相对较大。因此，使用MtreeRing及MeasuRing软件来识别日轮或可降低研究的时间成本，可视化的研究结果使鉴定技术日趋完善，为发现新的自然规律提供了技术与数据支持。

致谢：大连海洋大学王伟教授帮助审阅了论文手稿并提出了宝贵意见。

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