两种剂量下恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在虹鳟体内的代谢残留

恩诺沙星(enrofloxacin, ENR)是第三代喹诺酮类抗菌药物，也是第一个动物专用的抗生素[1]。因其对大多数革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等均有抑制作用，且具有毒副作用小、抗菌力强、体内分布广等特点，《渔药使用规范》(SC/T 1132—2016)将其列为水产养殖用处方药之一[2]，并广泛应用于水产养殖病害防控中[3]。ENR在动物体内会发生脱乙基反应，生成具有活性的代谢产物环丙沙星(ciprofloxacin, CIP)。CIP药理作用类似ENR，因CIP存在明显种属差异，容易产生耐药性且毒副作用强，《无公害食品渔用药物使用准则》(NY 5071—2002)已将其列为禁用渔药。《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》(GB31650—2019)将水产动物中ENR及其代谢产物CIP的总残留限量定为100 μg/kg[4]。

虹鳟Oncorhynchus mykiss是全世界养殖最多的鱼类之一[5]，也是中国重要水产养殖品种[6]。嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri、恶臭假单胞菌Pseudomonas putida和荧光假单胞菌P.fluorescens等革兰氏阴性菌感染虹鳟会导致败血症、肠口红等疾病[7]，对虹鳟养殖业造成了巨大经济损失[5,8]。ENR被普遍用于虹鳟等鱼类养殖生产中的病害防控和治疗，但因缺乏代谢和残留规律研究，加之随意用药现象普遍存在，导致养殖产品药物残留超标事件时有发生[9-10]。药物不合理使用,不仅影响水产品质量安全，还会产生耐药性,并对生态环境可持续发展造成影响[11-12]。目前，对罗非鱼Oreochromis niloticus[13]、鲤Cyprinus carpio[14-15]、克氏原螯虾Procambarus clarkii[16]、大黄鱼Larimichthys crocea[17]、杂交鲟Acipenser schrenckii♂×Huso dauricus♀[18]、中华绒螯蟹Eriocheir sinensis[19]、日本鳗鲡Anguilla japonica[20]和鲫Carassius auratu gibelio [21-22]等水产动物体内ENR的代谢特征已开展了部分研究，国外针对大西洋鲑和虹鳟苗种也开展了低剂量药浴和注射研究[23-26]，但虹鳟养殖生产中不同给药剂量的代谢特征比较研究尚未见报道。本研究中，探究了不同给药剂量下ENR及其主要代谢产物CIP在虹鳟6个组织中的代谢过程和残留消除规律，并对其药物代谢动力学特征进行比较，旨在为水产养殖中ENR的合理使用及休药期制定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用虹鳟购自河北省涞源县某养殖场，平均体质量为(70.48±5.41) g，经确认，该养殖场未使用过喹诺酮类药物。试验在北京市水产科学研究所小汤山冷水鱼养殖基地进行。试验前将虹鳟暂养10 d，水温为(15±2) ℃，水体连续曝气且循环过滤，溶解氧质量浓度为6.5 mg/L以上，3 d换水一次，每次换1/2养殖水体。按照鱼体质量2%每日早、中、晚各投喂饲料一次，及时排出残饵和污物，试验前3 d停止投喂。

仪器：Thermo TSQ高效液相色谱-串联质谱仪、HCB 1002型电子天平、AB265-S型分析天平、H-2050R型离心机、H/T16MM型离心机、N-EVAP1/2型氮吹仪和MS3bsic型涡旋振荡器。

药品与试剂：恩诺沙星原药购自北京鑫洋水产高新技术有限公司，经检测，纯度为94.6%；恩诺沙星标准品(纯度99.5%)和环丙沙星标准品(纯度95.0%)购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；氘代恩诺沙星标准品(纯度99.8%)和氘代环丙沙星标准品(纯度99.8%)购自德国Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯(德国Merck公司)，醋酸铵为色谱纯(美国Fluka公司)，无水硫酸钠和正己烷为分析纯(北京化工厂)。

1.2 方法

1.2.1 给药方式《新编渔药手册》[27]对于ENR在鱼类细菌性疾病中的指导用量为20～50 mg/kg鱼体质量，参照上述推荐剂量，本研究中分别选择20 mg/kg作为低剂量和50 mg/kg作为高剂量，进行虹鳟单次混饲口灌后的代谢残留比较研究。

试验共挑选上述暂养健康虹鳟257尾，分为两组，其中，低剂量组126尾，随机分为21个亚组，每组6尾；高剂量组132尾虹鳟，随机分为22个亚组，每组6尾。采用混饲口灌给药法给药，无回吐者放回养殖缸中进行试验研究，试验期间虹鳟养殖管理同暂养时期。

1.2.2 样品采集口灌药物后，低剂量组分别于给药后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、96、144、192、240、312、384、456、528、576、768、888 h共21个点采样，每个采样点采集6尾鱼，分别采集其血液、肝脏、肾脏、肌肉、皮肤、剩余其他组织(除上述5种组织外全部其他组织混合物)6种样品。高剂量组除增加1 008 h采样点外，其他采样点与低剂量组一致。使用经3‰肝素钠(质量分数，下同)润洗的注射器从鱼尾部采集1 mL血样，置于离心管(经3‰肝素钠润洗)，混合均匀后以8 000 r/min离心10 min，取上层即为血浆样品。肌肉、肝脏、皮肤、剩余其他组织各采集约10 g，肝脏和肾脏采集全部组织。全部样品放入-80 ℃超低温冰箱中冷冻待测。另选择6尾未给药虹鳟，采集对应6类组织样品作为空白对照。

1.2.3 样品前处理样品处理及药物浓度测定参照《水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱-串联质谱法》(农业农村部1077号公告-1—2008)优化后进行。

1.2.4 色谱、质谱条件色谱柱为Hypersil GOLD C18(2.1 mm×150 mm,5 μm)，以A(0.1%甲酸溶液，含5 mmol/L醋酸铵)和B(乙腈)为流动相，二者体积比为88∶12进行梯度洗脱，流速为300 μL/min，进样量为10 μL，室温。

离子源为电喷雾(ESI)离子源，离子化模式为正离子，监测方式为选择反应监测(SRM)，电喷雾电压为3 200 V，鞘气为45 units，辅气为15 units，离子源温度为350 ℃，源内碰撞诱导解离电压为10 V。

1.2.5 标准曲线制备配制质量浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的ENR和CIP混合标准工作液，供液相色谱-串联质谱仪测定，采用内标法定量。以3倍基线噪音药物的浓度为最低检测限。

1.2.6 回收率、精密度测定采用加标回收法测定。分别取虹鳟空白对照组血浆1.0 mL及肌肉、皮肤、肝脏、肾脏和剩余组织1.0 g，分别加入质量浓度为50、100、200 μg/L的混合标准工作液，按照“1.2.3节”方法处理样品，每个浓度设3个平行。将上述3个浓度的同一样品于1 d内分别重复进样5次并分5 d测定，计算3个浓度水平响应值峰面积的变异系数(CV)。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 8.0软件计算时间浓度曲线，采用DAS 2.0软件计算ENR和CIP药代动力学参数。

2 结果与分析

2.1 分析方法验证

2.1.1 恩诺沙星和环丙沙星的标准曲线 ENR的标准曲线方程为

Y=-0.321 1+0.069 6X，R2 =0.999 9；

CIP的标准曲线方程为

Y=0.091 9+0.024 1X，R2 =0.999 9。

对5种空白对照组织的基线噪音值取平均值，求得该方法中ENR和CIP的检测限均为1 μg/L。

2.1.2 回收率 50、100、200 μg/L(低、中、高)3个质量浓度添加水平在虹鳟6种组织中的回收率结果见表1，ENR的回收率为78.14%～108.80%，CIP的回收率为76.06%～106.04%。

2.1.3 精密度 50、100、200 μg/L(低、中，高)3个质量浓度添加水平的精密度测定结果见表2，其中，两种药物的日内变异系数均小于6%，日间变异系数均小于7%。

2.2 两种剂量下ENR和CIP在虹鳟各组织中的药代动力学特征

采用DAS 2.0非房室模型进行分析，获得各个组织和器官的药代动力学参数，两种剂量下ENR和CIP的药代动力学曲线见图1。从图1可见：ENR主要分布于肾脏中，其含量远高于其他5种组织，其次为剩余组织和皮肤；低剂量组ENR在肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的含量分别在停药后8、24、48、72、4、8 h时达到峰值，分别为13.349、11.164、23.378、114.196、33.762 mg/kg和3.361 mg/L；高剂量组ENR在肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的含量分别在停药后8、8、48、48、1、8 h时达到峰值，分别为43.302、35.909、53.315、305.098、121.254 mg/kg和8.456 mg/L。

两种剂量下，CIP药物均主要分布于肝脏中，并分别在8、48 h时出现双峰现象；低剂量下，CIP在肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的含量分别在停药后48、72、72、72、48、48 h时达到峰值，分别为6.372、0.932、0.564、1.440、1.658 mg/kg和0.196 mg/L；高剂量下，CIP在肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的含量分别在停药后48、48、48、48、48、8 h时达到峰值，分别为8.634、1.840、0.907、3.004、2.442 mg/kg和0.663 mg/L(图1)。

两种剂量下，ENR和CIP在各组织中的药代动力学参数如表3～表6所示。低剂量下，ENR在6种组织中Vd为0.121～47.234 L/kg，高剂量下Vd为0.162～49.000 L/kg，可见，随着剂量的增加，ENR分布更加广泛(表3、表4)。低剂量下，CIP在6种组织中Vd为5.341～52.328 L/kg，高剂量下Vd为9.329～87.958 L/kg，可见，随着剂量增加,CIP在各组织中的Vd值逐渐变大(表5、表6)。两种剂量下，ENR和CIP在血浆中的Vd值大于其他5种组织(50 mg/kg CIP血浆除外)，可见药物分布最为广泛，渗透量最大(表3～表6)。

2.3 ENR和CIP在虹鳟体内的残留特征

2.3.1 ENR 从图1可见，两种剂量下不同组织中ENR残留呈现如下特征：低剂量组肝脏中ENR在给药后24～144 h下降明显，含量由13.081 mg/kg降至1.70 mg/kg，后缓慢消除；高剂量组在48～192 h下降明显，含量由33.772 mg/kg下降至1.495 mg/kg。低剂量组肌肉中ENR在24～144 h下降明显，含量由11.164 mg/kg 降至0.572 mg/kg，高剂量下ENR在该时间段同样下降快速，含量由35.844 mg/kg降至2.311 mg/kg。低剂量组皮肤中ENR在48 h开始下降，消除速度较为平缓，888 h时检出含量为0.291 mg/kg；高剂量组ENR在48 h时达到峰值53.315 mg/kg后开始下降，在1 008 h时含量为0.631 mg/kg。低剂量组肾脏中ENR在72 h达到峰值后开始下降，在给药后888 h含量为1.841 mg/kg；高剂量组ENR含量在48 h达到峰值305.098 mg/kg，随后消除速度较快，下降明显。低剂量组剩余组织ENR在4～144 h下降较为明显，后持续消除，速度较为平缓；高剂量组在1 h时达到峰值，至12 h时快速下降。低剂量组血浆ENR含量在24～144 h时下降明显，后消除速度趋于平缓，含量由2.865 mg/L降至0.223 mg/L；高剂量组在24 h时出现第二个峰值后开始下降，至144 h区间下降速度较快，后期趋于平缓。低剂量下ENR在6种组织中的t1/2z为56.523～320.705 h，高剂量下为102.405～325.593 h。整体而言，在高剂量试验条件下各组织中ENR的t1/2z高于低剂量组。

2.3.2 CIP 口灌ENR后，虹鳟肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中均可检测到代谢物CIP。两种剂量下不同组织中CIP的残留呈现如下特征：高低剂量组肝脏组织CIP含量均在停药后48 h时达到峰值后进入消除阶段，48～144 h消除较为快速，随后药时曲线斜率趋缓，CIP进入缓慢降解过程，且高低剂量组分别在456、528 h时CIP含量低于检测限。低剂量组肌肉组织CIP含量于72 h时达到峰值后缓慢下降，高剂量组在48 h时达到峰值后进入降解阶段，高低剂量组均于192 h时下降至检测线以下。低剂量组皮肤组织CIP于72 h时开始降解，高剂量组于48 h时开始消除，均至240 h时低于检测限以下。低剂量组肾脏组织中CIP于72 h时开始消除，96 h低于检测限；高剂量组CIP于48 h时开始消除，192 h时低于检测限。剩余组织高低剂量组CIP均于48 h时开始消除，高剂量组消除速度快于低剂量组，高低剂量组分别于240、192 h时低于检测限。血浆中CIP高剂量组于24 h、低剂量组于48 h时开始消除，分别于144、96 h时低于检测限。低剂量下CIP在6种组织中的t1/2z为32.036～162.735 h，高剂量下相应组织t1/2z为30.086～260.018 h；低剂量组肝脏、肌肉、皮肤、肾脏和剩余组织消除速度快于高剂量组，但血浆中高剂量组快于低剂量组(表5、表6)。

2.3.3 ENR+CIP 高剂量组药物代谢消除速度较低剂量组慢。低剂量组用药后888 h(37 d)鱼体肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中ENR与CIP含量之和分别为47.079、ND(未检出)、294.731、1 892.800、21.769 μg/kg和ND；高剂量组用药1 008 h(42 d)后鱼体肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中ENR与CIP含量之和分别为59.421、ND、639.093、2 628.919、57.691 μg/kg和2.231 μg/L；肌肉中ENR与CIP之和的含量，低剂量组在给药后768 h(32 d)、高剂量组在给药后1 008 h(42 d)低于检测限。

3 讨论

3.1 给药方式与采样方案

鱼类药物代谢残留研究，给药方式主要有注射、拌饲投喂、口灌和药浴等4种。注射是使抗生素进入血流最直接、最有效的给药方式，因需要更多时间和劳动力，适用于处理高价值动物，如家畜和观赏鱼[28]，不适用于养殖鱼类。拌饲投喂和药浴相对操作简便，但拌饲投喂主要是将药物混入饲料后投喂，不同试验动物个体间因摄食能力、社会等级地位等行为学特征，导致不同个体间摄入药物量差异较大，对研究结果准确性影响较大[29]。药浴是通过水体给药，难以获得鱼体实际摄入药物量数据，且存在需要较高药物用量才能达到预期效果，以及水体细菌会产生耐药性等缺点[30]。本研究中采用混饲口灌方式给药，不仅可以做到每条试验鱼体给药量精确可控，且操作相对简便，减少了试验误差，有效保障了试验结果的准确性，值得后续研究推广使用。

在鱼体代谢组织选择上，本试验中采样组织与以往研究相比，除传统血液及肌肉、肝脏、肾脏、皮肤等组织外，额外增加除上述组织外的所有剩余其他组织，即该研究获得了药物在整个鱼体中的代谢残留特征，据笔者所知上述研究思路目前尚不多见。如此设计主要因中国养殖水产动物种类众多，使用药物种类繁杂，加之养殖环境和模式多样，解决水产动物药物代谢残留问题，恐不能穷尽所有鱼药组合，解决产业需求有赖于基于生理药代动力学模型(physiologically based pharmacokinetic model，PBPK model)的鱼类药物代谢残留技术研究[31]。生理药代动力学模型是基于物质平衡原理，将整个鱼体作为一个有机整体，不同组织代表一个单独的房室，房室间借助于血液循环连接形成闭环，以此模拟机体药物代谢过程，实现药物代谢残留的预测和外推[32]。本研究中正是基于此原理，将虹鳟作为有机整体进行了全部组织中药物代谢残留规律研究，在获得代谢特征和残留规律的同时，也为鱼类药物代谢残留PBPK模型的构建提供基础数据。

3.2 药代动力学特征

药物达峰浓度(Cmax)和达峰时间(tmax)是反映药物在鱼体中吸收程度和速度的2个重要参数。本研究中，高剂量组ENR在虹鳟肌肉、肾脏和剩余组织中的tmax均比低剂量组短，且高剂量组肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的Cmax分别为43.302、35.909、53.315、305.098、121.254 mg/kg和8.456 mg/L，均大于低剂量组相应组织的Cmax值(分别为13.349、11.164、23.378、114.196、33.762 mg/kg和3.361 mg/L)。其代谢物CIP在高剂量组肌肉、肾脏和皮肤等组织的tmax也同样均短于低剂量组，且CIP在高剂量组肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中的Cmax均大于低剂量组相应组织的Cmax。上述结果表明，高剂量给药情况下，ENR及其代谢物CIP在虹鳟体内的吸收程度及速度均大于低剂量组。Stoffregen等[33]对大西洋鲑幼鱼分别进行5、10 mg/kg两种剂量ENR口灌比较研究，同样呈现高剂量组组织中ENR的tmax短于低剂量组的特征。在中国对虾中对氟苯尼考等氯霉素类药物进行高剂量(16 mg/kg)和低剂量(8 mg/kg)比较，同样发现高剂量组肌肉和肝胰脏组织药物Cmax浓度远高于低剂量组[34]。可见，同一药物在不同养殖品种或不同药物间增加给药剂量，均能促进药物吸收速度和程度。

AUC是反映组织器官对药物吸收和药物在机体内分布量大小的参数。本研究中高低两种剂量下，ENR在肾脏中的AUC值均大于其他组织，表明虹鳟肾脏中的药物吸收分布量、吸收速度和程度均高于其他5种组织。另一方面，本研究中两种ENR浓度下，鱼体肾脏中药物含量均远大于其他5种组织，且肝脏中检测出CIP含量均最高，这与ENR在欧洲鳗鲡Anguilla anguilla[35]、金鳟Oncorhynchus mykiss[36]和三疣梭子蟹Portunus trituberculatus[37]中的检出结果一致，由此说明，对部分水产动物而言，药物经肝脏代谢肾脏排泄的理论[38]同样适用。

消除半衰期(t1/2z)反映了药物在机体组织器官中的消除速度。本研究中，高剂量给药下ENR在虹鳟肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中t1/2z分别为204.193、115.639、102.405、121.852、201.834、325.593 h，均高于低剂量下对应组织的t1/2z值100.928、60.780、67.283、111.586、56.523、320.705 h，由此说明，高剂量给药下ENR在虹鳟体内所需消除时间更长，且两种给药剂量下虹鳟肌肉、肝脏和血液的t1/2z均显著高于50 mg/kg ENR在罗非鱼对应3个组织的t1/2z值(15.61、16.83、17.19 h)[13]。导致差异产生的原因，除物种间因素外，考虑到本研究中虹鳟为冷水性鱼类，试验水温为(15±2)℃，罗非鱼为热带品种，试验水温为(27±2)℃，笔者认为更多可能是不同养殖温度所致，由此提醒后续研究中应更多关注温度等环境因素的影响。本研究中ENR给药后，虹鳟肝脏和肾脏中ENR及CIP均出现双峰现象，这与ENR在短盖巨脂鲤Colossoma brachypomum[39]和异育银鲫Carassius auratus gibelio[40]体内变化规律一致，原因可能是ENR在虹鳟体内同样存在肝肠循环，但此论点还有待进一步验证。

3.3 给药方案与休药期

药物剂量决定药物对宿主和病原体作用的强度[41]，剂量偏小不仅达不到治疗疾病的目的，还极有可能产生耐药性，剂量过大则对养殖动物和生态环境均存在毒性风险，且容易导致药残超标，引发食品安全问题。研究表明，ENR对大多数病原菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)为0.16 mg/L，对最不敏感的链球菌MIC为0.25～0.45 mg/L[42-43]。当抗菌药物Cmax/MIC=10时即可发挥最大治疗效果，并减少耐药性的产生[44]。以最不敏感链球菌MIC为依据，本研究中，低剂量给药下虹鳟肝脏、肌肉、皮肤、肾脏、剩余组织和血浆中Cmax/MIC值分别为29.664～53.396、24.809～44.656、51.951～93.512、253.769～456.784、75.027～135.048、7.468～13.444，高剂量下相应组织中Cmax/MIC值分别为96.226～173.208、79.798～143.636、118.478～213.260、677.996～1220.392、269.453～485.016、18.791～33.824，即两种剂量下虹鳟各组织中药物Cmax/MIC的平均值均大于10，由此表明，在20 mg/kg单次给药下，ENR对最不敏感链球菌也能达到最大抑制作用。国外学者在ENR药代动力学研究中，多采用5 mg/kg或10 mg/kg给药剂量，研究结果所得血药浓度均能达到理想的抑菌效果[23-26]。考虑到养殖生产多为连续给药，笔者建议在实际养殖生产中，推荐按照20 mg/kg鱼体质量甚至更低的ENR给药剂量，这样既能满足对疾病的有效治疗和控制，也可大幅降低用药及生产成本，减少药物残留超标风险，同时对养殖水域生态环境和药物耐药性预防等均具有积极意义。

在20、50 mg/kg两种剂量下虹鳟肌肉中ENR与CIP之和分别在用药后768 h(32 d)和1 008 h(42 d)低于中国食品安全国家限量标准100 μg/kg[4]，即ENR休药期分别为480、630 ℃·d，接近或高于现行中国水产养殖用药明白纸(2020年2号)中对ENR休药期标准500 ℃·d的要求。而现实生产中，ENR通常按20～50 mg/kg剂量连续给药5～7 d，实际所需休药期应大于本研究结果。另一方面，有关虹鳟休药期，Lucchetti等[26]研究认为，ENR休药期应为816 ℃·d；对于其他养殖品种，梁俊平等[45]通过20 mg/kg剂量给大菱鲆口服和李佳蔚等[46]通过20 mg/kg剂量给黑裙口服研究，分别给出720 ℃·d和630 ℃·d时休药期建议。综上，中国现有ENR 500 ℃·d的规定不能保障养殖产品质量安全，建议适当延长休药期。

4 结论

1)以20、50 mg/kg ENR生产实际使用剂量对虹鳟进行单次混饲口灌，不同组织均可检测出代谢物CIP，且两种剂量下均为肾脏中ENR含量最高，肝脏中CIP含量最高。

2)增大ENR给药剂量能显著增加鱼体组织中药物浓度，高剂量下ENR消除速率较快，但残留时间更长。

3)ENR 20 mg/kg剂量单次给药下，虹鳟各组织中药物Cmax均能达到理想的抑菌效果，建议中国实际养殖生产中ENR使用剂量降为20 mg/kg鱼体质量甚至更低。

4)在(15±2)℃下，建议ENR 20 mg/kg剂量对虹鳟单次口服给药休药期不低于32 d(即480 ℃·d)，50 mg/kg剂量下休药期不低于42 d(即630 ℃·d)。现有500 ℃·d的休药期标准存在引发水产品质量安全风险，应适当延长。

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