水产动物的气泡病在自然或养殖水体中均较常见[1-2]，但由于国内对该病的研究不多，同时在养殖过程中对该病也无明确诊断方法，导致业界对气泡病认识不足。水产动物的气泡病与人类潜水后发生的减压病类似，它是由于水体中气体过饱和或压力、水温变化而引起水产动物体内形成气栓，并对机体造成损伤的一种非传染性疾病[3-4]。水体中气体过饱和的原因较多，自然及人为因素均可引起，因此，水产动物的气泡病时有发生。目前，国外关于气泡病方面的研究较多，在鱼类、虾、蟹、贝类及两栖类中均有报道[5-14]。
气泡病对于鱼类的影响首先主要集中在眼睛部位，Grahn等[15]、Smiley等[16]、Speare[17-18]均进行了该病对鱼类眼睛造成的损伤研究，这些研究表明，患气泡病鱼眼常一侧严重突出，眼盲，且眼球组织严重病变，眼角膜和眼窝发生气肿或出现气泡，气泡首先在眼组织脉络膜出现。在亚急性和慢性气泡病中，气泡显著位于眼周及眼球后，眼病变严重程度会随着总气体压力的增加而增加，并伴随视网膜下、视神经及虹膜出血，其次在鱼体表、鳍、鳃等部位可以观察到气泡。Machova等[6]、Pauley等[19]、Espmark等[20]、彭天辉等[21]对此均有报道，他们在鱼体表、鳍、口周、鳃丝表面、鳃小片内、眼等部位均观察到了气泡的存在。
甲壳类动物的气泡病症状以观察到动物体内的气泡为主，Johnson[12]研究了蓝蟹Callinectes sapidus气泡病及其组织病变情况，在蓝蟹的鳃、心、血管、眼中均发现了气泡，组织病变以缺血、变性为主。Lightner等[8]报道，在褐对虾Penaeus aztecus幼体及稚虾虾体的甲壳下、肠腔及附近血腔内、鳃、眼柄等处均可见气泡。Pillai等[22]研究了罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii以鳃部肿胀为主要特征的疾病，养殖户俗称气球病。
本研究团队在养殖生产过程中发现，凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei气泡病发生时，轻者引发虾体行为异常，严重时导致死亡。甲壳动物为开放式循环系统，发生气泡病后能存活较长一段时间，但是气泡位于发病组织经久不消，且急性气泡病亦可转变为慢性气泡病，造成对虾应激反应，抗病力下降，并容易继发感染其他疾病，从而影响对虾生长甚至造成发病对虾死亡。生产过程中，发病池塘虾均出现每天几尾、几十尾至几百尾的死亡，严重的甚至排塘。养殖对虾气泡病的高发病率及严重危害程度应引起足够的重视。目前，凡纳滨对虾气泡病的相关报道较少，特别是对养殖池塘自然发病气泡病的报道，对该病组织病理方面也未见相关报道。本研究中，主要分析了室外土池塘养殖环境下凡纳滨对虾自然发生气泡病的组织病变情况，从组织病变上直接观察气泡病，了解其致病机理，以期为诊断和防控对虾气泡病提供科学参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用凡纳滨对虾取自广东省珠海市凡纳滨对虾养殖土池塘，体长(6.3±1.5)cm，虾组织内可见气泡或气柱，或虾体未见气泡但根据临床诊断已发生气泡病，记录虾塘各水体上下层溶解氧，并取健康凡纳滨对虾(体长6.1 cm±1.6 cm)作为对照。
1.2 方法
1.2.1 取样及镜检 取样池塘水深1.8 m，每日分别在水深0.2、1.6 m处实时监控养殖池塘水体溶解氧，每日8:00、15:00定点取样一次。解剖观察、记录虾体表及各组织是否有肉眼或显微镜镜检可见的气泡，以及镜检有无寄生虫等。无菌条件下，从凡纳滨对虾肝胰腺处接种细菌。取对虾肝胰腺、鳃、肌肉组织样品固定于体积分数为95%的乙醇中，用于虾肝肠胞虫及各项病毒项目的检测。取凡纳滨对虾的两侧眼、肝胰腺、鳃、肌肉(分成前中后三段)、肠、心、触角等组织，固定于波恩氏液中用于组织观察，同样方法在健康凡纳滨对虾中取对应各组织样品进行固定，用于对照观察。
1.2.2 细菌分离、培养及PCR检测 将试验对虾进行细菌分离和病毒检测，以排除病原生物的影响。无菌条件下，从对虾肝胰腺处接种细菌，划线接种于TSA培养基和TCBS培养基中，37 ℃条件下倒置培养24 h，观察记录结果。同时，分别取健康和患病对虾的肝胰腺、鳃、肌肉组织，固定于体积分数为95%的乙醇中。采用酚-氯仿法抽提组织病毒DNA、RNA，进行白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、虾血细胞虹彩病毒、桃拉病毒及虾肝肠胞虫的检测。
1.2.3 组织切片的制备与观察 样品用波恩氏液固定12～24 h后，用体积分数为70%的乙醇将波恩氏液换出，之后每隔4 h换液一次，直至溶液无黄色。常规脱水、透明、浸蜡后，将组织包埋成蜡块，待蜡块凝固后，将组织蜡块用石蜡切片机切成5 μm蜡带，展片、黏片、烘干后进行H·E染色，中性树胶封片后，于Motic光学显微镜下观察。
2 结果与分析
2.1 气泡病凡纳滨对虾临床特征
发生气泡病的凡纳滨对虾体色泛红、腹部肌肉体节间发白，发病严重的虾腹部第6节肌肉发白或全身肌肉发白，镜检附肢、鳃丝、触角、头胸甲肌肉等部位可见气柱、气泡(图1)。镜检未发现寄生虫。
患病凡纳滨对虾体节间白浊(A)，体色发红(B,C)，镜检步足(D)、第一触角(E)、游泳足(F)可见气柱(泡)(箭头示)。
Whitish between segments(A) and red body (B,C), gas columns(bubbles) in the periopods(D),first antennae(E) and pleopods (F)(arrow) in the diseased Litopenaeus vannamei.
图1 患气泡病凡纳滨对虾外观及镜检
Fig.1 Appearance and microscopic examination of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei with gas bubble disease
2.2 细菌分离培养及电泳结果
37 ℃条件下倒置培养细菌24 h，TSA培养基和TCBS培养基上均未见细菌菌落长出。白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、对虾杆状病毒、虾血细胞虹彩病毒、桃拉病毒及虾肝肠胞虫电泳结果均呈阴性。
2.3 气泡病凡纳滨对虾组织病变
2.3.1 肌肉组织病理变化 健康凡纳滨对虾肌肉组织及肌纤维纹路清晰、排列致密(图2A)，而发病虾肌束萎缩，相邻肌束间距较大，局部肌肉组织坏死，肌纤维排列杂乱，有水肿或淤血现象，气泡印迹明显(图2B～E)，并在背腹血管内散布大小不等、形态不一的气泡(图2F)；健康凡纳滨对虾外壳角质层、几丁质钙层、内皮紧密连接(图2G)，而发病凡纳滨对虾外壳由于气泡存在导致三者间发生分离(图2H)，并在触角内也可观察到气泡的存在(图2I)。
A—健康凡纳滨对虾肌肉组织，肌束排列致密，肌纤维纹路清晰；B—发病对虾肌肉组织轻微淤血，有小气泡，肌束间距大；C—发病对虾中明显的气柱将肌肉组织分隔开，肌束间距大；D—发病对虾肌束萎缩，组织坏死，比较杂乱，淤血处有小气泡；E—发病对虾中较大的气泡占据肌肉组织；F—发病对虾背腹血管内散布大小不等的气泡；G—发病对虾肌束轻微萎缩，外壳角质层、几丁质钙层、内皮紧密相连；H—发病对虾角质层、几丁质钙层、内皮被气泡分离开；I—发病对虾触角内有一椭圆形气泡；g—气泡或气柱。
A—muscle bundles arranged densely, muscle fiber with clear lines in healthy Litopenaeus vannamei; B—slight congestion in muscle, there are small gas bubbles, with large space between muscle bundles of diseased L.vannamei; C—with large obvious gas column separates muscle, with large muscle bundle spacing of diseased L.vannamei; D—muscle bundle atrophy, tissue necrosis, more disordered, and small gas bubbles in blood of diseased L.vannamei; E—larger gas bubbles occupy in muscle of diseased L.vannamei; F—different sizes of bubbles are scattered in dorsal and abdominal blood of diseased L.vannamei; G—muscle bundles atrophy slightly, keratinous layer, chitin calcium layer, and endothelium of shell are closely linked of diseased L.vannamei; H—keratinous layer, chitin calcium layer, and endothelium separated by gas bubbles in the diseased L.vannamei; I—an elliptical gas bubble in the antenna of diseased L.vannamei; g—gas bubble or gas column.
图2 凡纳滨对虾肌肉和触角组织病理变化
Fig.2 Histopathological changes in muscle and antennae of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei
2.3.2 鳃组织病理变化 健康凡纳滨对虾鳃组织为枝状鳃，鳃丝有多级分支(图3A)；发病凡纳滨对虾鳃组织多发生水肿、淤血、出血现象，大量的液体成分充塞鳃组织，H·E染色呈红色(图3B-E)；发病鳃组织外围及中间均可观察到较大的气泡挤压周围组织细胞(图3B、C)，鳃小片上皮内也观察到气泡，一个鳃小片内可见1～2个圆形气泡(图3D、E)，鳃轴血管内散布多个大小不等的气泡，较大气泡的直径与鳃轴直径平齐，充塞于血管(图3F)。
A—健康凡纳滨对虾鳃组织，枝状鳃、多级分支；B—发病对虾鳃组织淤血、出血、水肿，外围集中分布大小不等的圆形或椭圆形气泡，挤压周围组织细胞；C—发病对虾鳃组织淤血、出血、水肿，有一较大圆形气泡占据鳃片中间；D—发病对虾鳃组织水肿、淤血、出血，鳃小片上皮内多量球样气泡；E—发病对虾鳃上皮内气泡；F—发病对虾鳃轴血管内散布多个气泡；g—气泡。
A—dendritic branchia and multi-level branches gill tissue of healthy Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei; B—gill congestion, hemorrhage and edema, peripheral distribution of circular or oval bubble, and squeezing surrounding tissue cells in diseased L.vannamei; C—gill congestion, hemorrhage and edema, and a large round bubble occupies the middle gill in diseased L.vannamei; D—gill edema, congestion and hemorrhage, and a lot of bulbous bubbles in the branchial epithelium in diseased L.vannamei; E—intraepithelial bubbles gill in diseased L.vannamei; F—multiple bubbles scattered in the branchial axis vessels of diseased L.vannamei; g—gas bubbles.
图3 凡纳滨对虾鳃组织病理变化
Fig.3 Histopathological changes in gills of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei
2.3.3 肝胰腺组织病理变化 健康凡纳滨对虾肝胰腺为一个个腺管构成的复管状腺，各腺管紧密相邻，管腔为四角形或五角形，管壁由4种类型的细胞构成，根据形态可分为分泌细胞、吸收细胞、纤维细胞和胚细胞(图4A，胚细胞主要位于组织边缘的腺管内，分化形成其他类型的细胞，图中未显示)；发病凡纳滨对虾肝胰腺组织腺管间偶尔可观察到气泡，腺管萎缩较重，腺管间距变大，不再逐个紧密相邻，腺管上皮脱离基底膜，上皮细胞类型不可分辨，腺管间有少量细胞增生(图4B)。
A—健康凡纳滨对虾肝胰腺，由多级分支的腺管组成，管腔呈五角形或四角形，Bc—分泌细胞，Rc—吸收细胞，Fc—纤维细胞;B—发病凡纳滨对虾腺管萎缩严重，腺管间少量细胞增生，管壁上皮细胞类型无法区分，腺管间可观察到气泡；g—气泡。
A—hepatopancreas of healthy Litopenaeus vannamei consists of glandular ducts with multiple branches, and the lumen is pentagonal or quadrangular in shape, Bc—secretory cells，Rc—absorbent cells，Fc—fibroblast; B—the glandular ducts atrophy severely, a small number of cells proliferate between the glandular ducts, the types of epithelial cells are not distinguished, and gas bubbles are observed between the glandular ducts in the diseased L.vannamei; g—gas bubbles.
图4 凡纳滨对虾肝胰腺组织病理变化
Fig.4 Histopathological changes in hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei
2.3.4 心组织病理变化 健康凡纳滨对虾心组织由肌纤维及血淋巴组成(图5A)；发病凡纳滨对虾心部分肌纤维被气泡和气柱占据，组织中形成较大的空白区域(图5B)，有部分样品心组织还可见淤血比较严重的现象。
A—健康凡纳滨对虾心组织；B—发病凡纳滨对虾心组织，大的气泡和气柱占据心肌;g—气泡和气柱。
A—heart of healthy Litopenaeus vannamei; B—heart, and large gas bubbles and gas columns occupied the myocardium in diseased L.vannamei; g—gas bubbles and gas columns.
图5 凡纳滨对虾心组织病理变化
Fig.5 Histopathological changes in heart of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei
2.3.5 眼组织病理变化 健康凡纳滨对虾的眼为复眼，由许多小眼组成，小眼又由角膜、晶状体、小网膜细胞等构成(图6A)；发病虾两侧眼组织出现不同程度的空泡化，常一侧眼组织空泡化较重(图6B、C)，有时也可观察到较大的气泡挤压眼组织(图6B)。但发病对虾肠组织未见明显异常。
A—健康凡纳滨对虾眼组织；B～D—发病凡纳滨对虾眼组织,眼组织内有一较大气泡(B)，一侧眼组织空泡化严重(D)，一侧眼组织轻微空泡化(C)，比较正常；g—气泡。
A—eye of healthy Litopenaeus vannamei; B-D—eyes of diseased L.vannamei: one big gas bubble in the eye(B), vacuolization of one eye is serious (D), and the other one is slightly vacuolated(C), relatively normal; g—gas bubble.
图6 凡纳滨对虾眼组织病理变化
Fig.6 Histopathological changes in eyes of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei
2.4 不同溶解氧值下患气泡病凡纳滨对虾组织病变比较
从虾池塘取样测得上下层水体溶解氧范围为4.15～15.06 mg/L，溶解氧饱和度为56%～293%(上层水体溶解氧为4.56～15.06 mg/L，下层水体溶解氧为4.15～12.06 mg/L)，不同溶解氧值下患气泡病凡纳滨对虾组织病变差异较明显的是眼和鳃组织。
当上、下层水体溶解氧分别为5.85、4.15 mg/L时，患病对虾眼组织轻度空泡化且仅在眼球外围发生空泡化，空泡范围约占据晶状体束的1/2(图7A)；当上、下层溶解氧分别为15.06、4.86 mg/L时，眼组织严重空泡化，小网膜细胞外及整个晶状体束均空泡化(图7B)。当上、下层水体溶解氧分别为4.56、4.46 mg/L时，患病对虾鳃组织仅在鳃丝血管内可见个别气泡印迹(图7C)；当上、下层水体溶解氧分别为14.27、5.86 mg/L时，鳃组织不仅在血管内可见气泡印迹，在鳃丝上皮亦可见多个气泡印迹(图7D)。这表明，水体溶解氧越高，对虾的眼组织和鳃组织损伤就越大。
A、B—眼组织，A—上、下层水体溶氧分别为5.85、4.15 mg/L，B—上、下层水体溶氧分别为15.06、4.86 mg/L；C、D—鳃组织，C—上、下层水体溶氧分别为4.56、4.46 mg/L，D—上、下层水体溶氧分别为14.27、5.86 mg/L；箭头示气泡印迹。
A,B—eyes; A—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 5.85 and 4.15 mg/L respectively, B—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 15.06 and 4.86 mg/L respectively;C,D—gills;C—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 4.56 and 4.46 mg/L respectively, and D—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 14.27 and 5.86 mg/L respectively.
图7 不同溶解氧值下患病凡纳滨对虾组织病理变化(气泡变化趋势)
Fig.7 Histopathological changes in diseased Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at different dissolved oxygen values(the trend of bubble change)
3 讨论
3.1 气泡对患病凡纳滨对虾组织的影响及危害
本研究中观察发现，在患气泡病凡纳滨对虾的肌肉、鳃、触角、心、肝胰腺、鳃血管、背腹动脉中均有不同数量的气泡。同时，多组织可见气泡印迹取代原有组织，尤其是肌肉组织，气泡印迹多集中于腹部中后段，体积较大，可占据约2/3肌束面积(横切面)。同时，患病虾肌肉组织局部有坏死，表现为肌纤维纹路消失、核固缩等。肌肉组织的这些病变，会导致眼观肌肉发白，这也就解释了发生气泡病的凡纳滨对虾经常出现腹部肌肉发白，尤其是腹部第6节肌肉白浊的现象。
本研究中，发病对虾心脏组织也常观察到被大气泡占据心肌纤维导致心脏组织出现大面积空白区域的情况，且有些病虾心组织淤血严重，这些病变会影响凡纳滨对虾正常的血液循环。气泡病凡纳滨对虾鳃组织水肿、淤血、出血，导致鳃浸润于液体中，所以眼观发病虾鳃组织常见颜色发白、肿胀。同时，在鳃轴血管内可观察到多量的气泡，有些气泡直径较大且与鳃轴直径平齐，直接堵塞鳃血管，严重影响对虾血液循环及呼吸功能，从而造成对虾呼吸困难而上浮水面。Johnson[12]将蓝蟹暴露于空气过饱和的水中，在蓝蟹的鳃、心、血管、眼中均发现气泡，组织病变以缺血、变性为主，且发现存活蓝蟹受损最严重的是心和鳃组织，组织中可见气泡栓塞，尤其鳃组织中的气泡栓塞在暴露之后35 d仍然存在。
Lightner等[8]研究发现，升温及降压均可引发褐对虾幼体及稚虾气泡病，患病虾行为异常、游泳无方向，虾昏迷、漂浮于水面，在虾体的甲壳下、肠腔及附近血腔内、鳃、眼柄等处均可见气泡。本研究中发现，在凡纳滨对虾眼组织神经区域及眼柄内也常有气泡，且凡纳滨对虾眼睛常一侧组织空泡化严重，分析认为是气泡挤压眼部神经进而引起对虾游泳异常。
患病凡纳滨对虾背腹动脉血管内血液中存在大量大小不一、形态不同的气泡，导致发病虾血液如同泡沫一样，影响对虾血液循环。这与其他学者在鱼类气泡病中的研究结果相一致[7,23]。
3.2 凡纳滨对虾急性、慢性气泡病的诊断
急性气泡病发生时，凡纳滨对虾有较明显的临床症状，如游塘、跳跃、上浮，肌节间发白或肌肉发白等，肉眼观察或镜检对虾，在其体表、壳下、附肢、鳃、触角等处可见气泡，虾持续性死亡，每天死亡几尾、几十尾至几百尾，严重时甚至出现排塘，再结合天气及水质情况可以判断对虾是否发生了气泡病[2,24]。而慢性气泡病较难发现和诊断，慢性气泡病发病时，一般较难在现场用肉眼和显微镜观察到虾体内的气泡，但通过组织切片观察，可在鳃、肌肉、眼、肝胰腺等组织观察到气泡印迹，再根据天气和水质情况进行确诊，如阴雨后晴天、连续晴好高温天气、早晚温差较大时，或者水体溶解氧和pH值较高、藻类突然大量繁殖等情况。
发生慢性气泡病的凡纳滨对虾水体溶解氧饱和度不高，镜检活体未发现明显气泡，但其组织切片观察显示，肌肉、鳃等组织中有气泡印迹，只是比镜检可见明显气泡的虾组织中的气泡印迹少。随着溶解氧饱和度升高，鳃组织气泡有增多、变大的趋势；溶解氧饱和度较低时，眼组织常一侧病变稍重，随着溶解氧值的升高，空泡化趋向严重；溶解氧饱和度较高时，两侧眼组织空泡化均较为严重。
4 结论
1)患气泡病凡纳滨对虾体表微红，肌节间及肌肉发白，附肢、鳃丝、触角、肌肉等部位镜检其内部可见气泡或气柱。对虾养殖期间若观察到上述外观症状，则表明气泡病已经发生并影响虾体。
2)患气泡病凡纳滨对虾组织病变特征以组织中出现气泡印迹为主，肌肉、眼、鳃、肝胰腺、触角、心等组织、器官均可见气泡印迹，相比较而言，鳃、肌肉组织中气泡印迹更明显，鳃血管内气泡亦比较明显，有些占据整个血道。根据上述组织病变特征可以确诊对虾是否患有气泡病。
3)水体溶解氧越高，患气泡病的对虾鳃、眼组织病变程度越严重，养殖过程中应注意随时监测水体溶解氧的变化。
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