总氨态氮和pH对菲律宾蛤仔“斑马蛤2号”品系幼贝潜沙的影响

菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum是典型的埋栖贝类，同时也是中国单种产量最高的埋栖型海水经济贝类[1]。目前，北方的蛤仔养殖苗种来自南方，由于南方苗种不耐低温，在北方滩涂不能安全越冬，导致北方冬季大量滩涂闲置。菲律宾蛤仔“斑马蛤2号”(以下简称“Zebra 2”)是继闫喜武等[2]培育出的第一个蛤仔新品种“斑马蛤”后，从辽宁大连石河群体中选育的蛤仔新品系,其具有斑马蛤的美观花纹，同时还具有耐低盐、低温、高温，抗逆性强，养殖存活率高的特点。目前，该研究团队已与中国南、北方企业合作，繁育新品系苗种73.39亿粒，并在辽宁、山东、江苏开展了滩涂、池塘、浅海、浮筏4种模式的养殖应用，合计148.37 hm2。由于“Zebra 2”品系耐低温，有望培育成适合在北方滩涂养殖的蛤仔新品种，因此，对其生态学进行研究，对于蛤仔新品种的培育与推广，以及充分利用北方滩涂，提高蛤仔生产效益具有重要的意义。

埋栖型贝类养殖中，使苗种顺利潜沙是该生态类型贝类养殖的关键技术之一。蛤仔苗种投放到海水中后，能否顺利潜沙及潜沙速度的快慢是放养成败的关键。潜沙快的蛤仔就能快速转入埋栖生活，潜沙慢则有可能被水流带走或被敌害生物所捕食[3]。影响贝类潜沙的因素众多，目前有关埋栖贝类潜沙的研究多集中在重金属[4]、有毒有机污染物[5]、潜沙生理[6-7]及底质[8-11]等方面。杨凤等[3]研究了几种环境因子和蛤仔规格对普通蛤仔潜沙的影响。养殖水体中pH和总氨态氮(TAN)是影响贝类生长存活的重要水质指标。无论在池塘养殖还是滩涂养殖中，TAN均为最易积累的有毒物质，pH不仅直接影响贝类的生存，还决定着TAN毒性的大小[12-13]。目前，关于pH和TAN 对蛤仔 “Zebra 2”品系潜沙的影响研究尚未见报道，为此，本研究中以极具经济价值的“Zebra 2”蛤仔幼贝为研究对象，探讨了pH、TAN对“Zebra 2”蛤仔幼贝潜沙的影响，旨在为完善蛤仔“Zebra 2”潜沙行为学和健康养殖技术提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料

分别于2019年6月和8月进行TAN和pH对“Zebra 2”幼贝潜沙的影响试验。试验用“Zebra 2”幼贝源自辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，壳长为(4.78±0.60)mm，试验前在未铺沙的水槽中以充分曝气的新鲜海水暂养2 d。

试验用水为充气曝气的沙滤海水。试验用底质泥沙取自大连庄河贝类养殖场育苗场，经0.35 mm筛绢网过滤后用于试验，泥沙中粒径为0.106～0.420 mm的沙占96%，属沙质底质，总有机碳的质量分数为0.069%。

1.2 方法

试验均在3 L聚乙烯桶中进行，桶底铺5 cm 泥沙，试验用水为2 L，水深约15 cm。试验时随机选取20个幼贝用于试验，每个处理设3个平行。试验持续24 h，为防止底质发生悬浮，影响潜沙的观察，试验期间不充气、不换水、不投饵。

1.2.1 TAN对幼贝潜沙的影响试验以添加分析纯氯化铵的方式，按等对数间距[14]设置8个TAN浓度组，实测TAN质量浓度分别为(0.51±0.01)、(1.03±0.06)、(1.64±0.42)、(2.93±0.15)、(5.93± 0.40)、(12.30±1.26)、(28.00±8.07)、(54.90±13.30)mg/L，以不添加氯化铵的天然海水(TAN为0.12 mg/L±0.05 mg/L)为对照。试验期间，水温为20.7 ℃，盐度为29.0，pH为8.12，DO大于5.2 mg/L，亚硝酸盐氮为(0.017±0.002)mg/L。试验从放入蛤仔后开始计时，分别记录蛤仔潜沙的竖壳ET5(5% 的受试个体从幼贝落到泥沙表面至竖壳所用时间，又称潜沙准备时间)、竖壳ET50(50% 的受试个体竖壳所用时间)、潜沙ET50(50%的受试个体完全潜入底质中所用时间)和潜沙ET100(100% 的受试个体完全潜沙所用时间)，潜沙ET100的测定于试验开始后4 h内完成，其后在24 h记录潜沙数量，计算24 h时的潜沙率(%)。

潜沙率=(试验结束时完全潜沙的蛤仔数量/受试蛤仔数量)×100%，

校正潜沙率=(各试验组潜沙率/对照组潜沙率)×100%。

1.2.2 pH对幼贝潜沙的影响试验试验设置9个pH组，用40 g/L NaCl溶液与体积分数为10%的浓盐酸调节pH。实测pH值分别为7.00±0.21、7.31±0.23、7.55±0.17、7.77±0.09、8.15±0.06(不调pH的天然海水对照)、8.27±0.03、8.54±0.07、8.81±0.09、9.09±0.12。试验期间，水温为27.1 ℃，盐度为22.8，TAN为(0.11±0.05)mg/L，亚硝酸盐氮为(0.05±0.00)mg/L，DO大于8.2 mg/L，其他试验过程及测定指标同“1.2.1节”。

1.2.3 水质指标的测定按照《海洋监测规范》(GB17378.4—1998)[15]对水质指标进行测定。用pHS-3C型数字酸度计测定pH，用次溴酸钠氧化法测定TAN，用重氮-偶氮比色法测定亚硝酸盐氮

用马弗炉测定底质中总有机碳含量。

1.3 数据处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行分析处理，采用TUKEY法进行多重比较，显著性水平设为0.05。通过多重比较确定最大允许毒物浓度(MATC)的范围，定义为在对受试生物无统计显著性有害效应的毒物最高浓度与邻近的对受试生物有统计显著性有害效应的毒物最低浓度之间，即在最大无效应浓度和最小有效应浓度之间[14]。

2 结果与分析

2.1 不同TAN质量浓度下幼贝的潜沙情况

2.1.1 潜沙速度从表1可见：在设定的TAN质量浓度范围内(0.51～54.90 mg/L)，幼贝的竖壳ET5无明显的变化规律，各浓度组及对照组竖壳ET5间无显著性差异(P>0.05)；竖壳ET50和潜沙ET50具有相同的变化趋势，均以最高TAN质量浓度组(54.90 mg/L)数值最大，分别为10.33、13.33 min。多重比较结果表明， 54.90 mg/L组竖壳ET50和潜沙ET50与对照组及其余各浓度组间有显著性差异(P<0.05)，其余各TAN质量浓度组间无显著性差异(P>0.05)，最大毒物允许浓度(MATC)为28.00～54.90 mg/L。ρ(TAN)≤12.30 mg/L的各试验组均能100%潜沙；潜沙ET100以对照组用时最短(33.33 min)，其后随TAN质量浓度增加，潜沙ET100呈增大趋势；TAN对潜沙ET100的MATC为0.51～1.03 mg/L。在试验开始后4 h内，可观察到28.00、54.90 mg/L两处理组中部分幼贝进出水管和足伸出，不能100%潜沙，潜沙率分别为41.7%和11.7%(图1)。

2.1.2 4、24 h的潜沙率从图1可见：ρ(TAN)≤5.93 mg/L时，各处理组24 h的潜沙率均与对照组无显著性差异(P>0.05)；ρ(TAN)≥12.30 mg/L时各组潜沙率与对照组(0.12 mg/L)存在显著性差异(P<0.05)，且随着TAN质量浓度的增加潜沙率下降，而TAN质量浓度为12.30、28.00、54.90 mg/L组的潜沙率依次为对照组的73.6%、37.7%、32.1%；24 h潜沙率的MATC为5.93～12.30 mg/L。

回归分析表明，24 h校正潜沙率(y)与TAN浓度对数(x)符合多项式关系，且呈极显著负相关(P<0.01)(图2)，由回归方程y=-14.446x2-12.358x+95.947(R2=0.936 7)求得，使24 h潜沙率下降5%的TAN有效质量浓度24 h EC5为0.373 mg/L(非离子氨质量浓度为0.016 mg/L)，使24 h潜沙率下降50%的TAN有效质量浓度24 h EC50为25.50 mg/L(非离子氨质量浓度为1.09 mg/L)。除54.90 mg/L组外，其他试验组24 h的潜沙率均低于4 h的潜沙率，统计分析表明，ρ(TAN)≤12.3 mg/L时，4 h与24 h潜沙率间有显著性差异(P<0.05)，ρ(TAN)≥28.00 mg/L时，4 h与24 h潜沙率间无显著性差异(P>0.05)，这说明随着胁迫时间的延长，TAN对潜沙率的负面影响逐渐增大。

2.2 不同pH条件下幼贝的潜沙情况

2.2.1 潜沙速度从表2可见：在pH 7.00～9.09条件下，蛤仔“Zebra 2”幼贝在试验开始后4 h内均能100%潜沙，其中幼贝的竖壳ET5随pH的变化无明显的变化规律，各试验组竖壳ET5与对照组均无显著性差异(P>0.05)，对竖壳ET5无影响的pH 范围为7.00～9.09；当pH由对照组pH(天然水，8.15)向偏酸方向突变时，竖壳ET50随pH的降低而增大，当pH由对照组pH向偏碱方向突变时，竖壳ET50无明显的变化规律，以pH 8.81组用时最短(1.67 min)，其次为pH 8.15对照组(2.00 min)，pH 7.00组用时最长(9.67 min)，pH 7.00、pH 7.31组ET50显著慢于对照组及pH 8.81组(P<0.05)，其余各组与对照组均无显著性差异(P>0.05)，对竖壳ET50无影响的pH范围为7.55～9.09；潜沙ET50的变化规律与竖壳ET50相同，其中，对照组(pH 8.15)用时最短(2.67 min)，pH 7.00组用时最长(10.67 min)，且两者有显著性差异(P<0.05)，其余各组间无显著性差异(P>0.05)，对潜沙ET50无影响的pH范围为7.31～9.09；潜沙ET100以对照组(pH 8.15)用时最短(9.00 min)，且以对照组为中心，随着pH向两侧递变，ET100呈逐渐增大的趋势，其中，pH 7.00、8.54、8.81、9.09组与对照组比较用时明显延长，且均有显著性差异(P<0.05)，其余各组与对照组无显著性差异(P>0.05)，对潜沙ET100无影响的pH范围为7.31～8.27。

2.2.2 24 h幼贝的潜沙率从图3可见,各试验组潜沙率与对照组均无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论

3.1 “Zebra 2”幼贝的潜沙能力

“Zebra 2”是从普通蛤仔北方群体中选育出的新品系，具有抗逆性强、耐低温、适合在北方沿海养殖等特点。潜沙能力是蛤仔生存的一个基本特征，本研究中分析TAN和pH两个试验中对照组“Zebra 2”幼贝的潜沙情况(表1、表2)，在水温为20.7～27.1 ℃，pH为8.12～8.15，盐度为22.8～29.0条件下(表3)，幼贝潜沙准备时间(ET5)一般为1.00～1.67 min，半数竖壳时间(竖壳ET50)为2.0～3.5 min，半数潜沙时间(潜沙ET50)为2.67～5.50 min，完全潜沙时间(ET100)为9.00～33.33 min。

受试验条件的限制，本研究中未进行普通蛤仔与“Zebra 2”的潜沙比较试验，有研究表明，普通蛤仔幼贝(6～12 mm)的潜沙受水温、盐度、pH、规格、水流速度等的影响[3]。温度升高，潜沙速度加快，规格增大潜沙速度加快。温度为15 ℃、pH为8.0条件下，6 mm的蛤仔幼贝2～3 min开始潜沙，5～6 min有半数潜沙，12～13 min全部潜沙[3]。考虑到温度和规格的影响，与相近规格普通蛤仔(6 mm)比较，4.78 mm的“Zebra 2”幼贝的潜沙速度并未表现出明显优势。

一些学者就魁蚶[16]、毛蚶[17]、青蛤[18]、文蛤[18]等埋栖贝类的潜沙行为进行了研究，但由于试验条件、受试生物的规格与发育阶段的不同等，较难相互比较。

3.2 TAN对“Zebra 2”幼贝潜沙的影响

本研究中，分析TAN对幼贝潜沙速度的影响时发现，当ρ(TAN)≤28.00 mg/L时，对竖壳ET5、竖壳ET50和潜沙ET50均无明显影响，但随着TAN质量浓度的增加ET100增大，即100%潜沙的时间延长(表1)，如对照组平均用时33.33 min就全部潜沙，5.93 mg/L TAN质量浓度组则用时142.00 min左右，而两个高TAN浓度组(28.00、54.90 mg/L)至试验开始后4 h，许多幼贝水管与足全部伸张，不能潜沙，且浓度越高越明显。

“Zebra 2”潜沙率的4 h MATC为12.30～28.00 mg/L，24 h MATC为5.93～12.30 mg/L，且除最高TAN浓度组(54.90 mg/L)外，各个试验组的24 h潜沙率均低于4 h潜沙率，表明随着TAN质量浓度的增加和胁迫时间的延长，幼贝的潜沙率下降。54.90 mg/L组的4 h潜沙率为11.7%，低于24 h潜沙率(32.1%)，是否高质量浓度的TAN短期内抑制了幼贝的潜沙能力，经过一段时间的适应后少部分个体潜沙能力恢复，还有待进一步验证。

“Zebra 2”潜沙ET100的MATC为0.51～1.03 mg/L，低于4 h与24 h潜沙率的MATC，表明指标潜沙ET100对TAN更敏感。从潜沙ET100的MATC可以推测，水中TAN浓度低于0.51 mg/L(ρ(非离子氨)≤0.022 mg/L)不会对幼贝潜沙产生明显影响。该非离子氨浓度高于对普通蛤仔早期生长发育研究所得安全浓度0.020 mg/L[19]。

有研究表明，TAN可以显著影响菲律宾蛤仔体内的去甲肾上腺素和肾上腺素含量，从而显著影响菲律宾蛤仔的神经信号传递,推测TAN可以扰乱菲律宾蛤仔的行为轨迹及其他生理生化功能[20～21]。这可能是一定浓度的TAN使“Zebra 2”幼贝潜沙速度和潜沙率下降的主要原因，确切机制还有待进一步研究。

3.3 pH对“Zebra 2”幼贝潜沙的影响

本研究中，以pH 8.15的天然海水为对照，在pH为7.00～9.09时，对幼贝的竖壳ET5无显著性影响，pH为7.55～9.09时对竖壳ET50无显著性影响，pH为7.31～9.09时对潜沙ET50无显著性影响，pH为7.31～8.27时对潜沙ET100无显著性影响，且以对照组潜沙ET100值为中心，随着pH向两侧递变，潜沙ET100逐渐增大(表2)，酸性环境条件下ET50较碱性环境条件用时长，这一结果与对普通蛤仔的研究结果相同[3]。总之，与TAN的影响类似，pH的变化对潜沙ET100影响最为明显。

水生生物对pH的耐受范围受原水pH和变化方式(突变还是渐变)等的影响。杨凤等[5]对普通蛤仔潜沙的研究表明，莆田蛤仔幼贝适宜潜沙的pH为7～9，庄河蛤仔幼贝最适潜沙的pH为8.0，与本试验结果相近。

4 结论

1) 5 mm左右的“Zebra 2”蛤仔幼贝，在沙质底、水温20～27 ℃、盐度22～29、pH 7.00～9.09时均能潜沙，且在适宜条件下9.0～30.0 min能100%潜沙。

2)ρ(TAN)≤0.51 mg/L(ρ(非离子氨)≤0.022 mg/L)对100%潜沙时间ET100无显著性影响，ρ(TAN)≤5.93 mg/L(ρ(非离子氨)≤0.254 mg/L)对24 h内潜沙率无显著性影响(P>0.05)。pH为7.31～8.27时对ET100无显著性影响。

3)天然海水的TAN质量浓度较难达到0.51 mg/L，pH一般为7.0～8.5，所以在近岸海水中投放“Zebra 2”，TAN和pH不会成为影响其潜沙的主要因素。但是投饵施肥的养殖池塘和沿海，水中TAN含量可能较高，池塘pH最高可达10以上，且波动幅度大，可能会影响蛤仔潜沙。

4) 本试验中所用幼贝属可投放苗种的较小规格，较大规格幼贝潜沙能力更强，对TAN和pH的耐受能力也可能更强。

[1] 张国范,闫喜武.蛤仔养殖学[M].北京:科学出版社,2010.

[2] 闫喜武,张跃环,杨凤,等.菲律宾蛤仔选育系的制种方法:CN101288387A[P].2008-10-22.

[3] 杨凤,曾超,王华,等.环境因子及规格对菲律宾蛤仔幼贝潜沙行为的影响[J].生态学报,2016,36(3):795-802.

[4] SHIN P K S,NG A W M,CHEUNG R Y H.Burrowing responses of the short-neck clam Ruditapes philippinarum to sediment contaminants[J].Marine Pollution Bulletin,2002,45(1/2/3/4/5/6/7/8/9/10/11/12):133-139.

[5] MATOZZO V,BALLARIN L,MARIN M G.Exposure of the clam Tapes philippinarum to 4-nonylphenol:changes in anti-oxidant enzyme activities and re-burrowing capability[J].Marine Pollution Bulletin,2004,48(5/6):563-571.

[6] KEINO H,SUGIYAMA I,NISHIZAWA T,et al.Relationships between burrowing behavior and energy consumption in the Japanese littleneck clam(Ruditapes philippinarum):key factors for recovering the clam[J].Fisheries Engineering,2008,44(3):169-174.

[7] 胥贤,杨凤,朱恒涛,等.低温对3种壳色菲律宾蛤仔幼贝耗氧率和排氨率的影响[J].大连海洋大学学报,2015,30(6):627-633.

[8] 周珊珊,张秀梅,刘旭绪,等.魁蚶稚贝的底质选择性及其潜沙能力评价[J].水产学报,2015,39(6):867-875.

[9] NEL R,MCLACHLAN A,WINTER D P E.The effect of grain size on the burrowing of two Donax species[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2001,265(2):219-238.

[10] DE LA HUZ R,LASTRA M,L width=11,height=14,dpi=110

PEZ J.The influence of sediment grain size on burrowing,growth and metabolism of Donax trunculus L.(Bivalvia:Donacidae)[J].Journal of Sea Research,2002,47(2):85-95.

[11] 张安国,袁秀堂,杨凤影,等.温度、盐度及底质对文蛤潜砂行为的影响[J].生态学杂志,2015,34(6):1595-1601.

[12] 刘炎,姜东升,李雅洁,等.不同温度和pH下氨氮对河蚬和霍甫水丝蚓的急性毒性[J].环境科学研究,2014,27(9):1067-1073.

[13] 罗杰,杜涛,刘楚吾,等.不同盐度、pH条件下氨氮对管角螺稚贝毒性影响[J].动物学杂志,2010,45(3):102-109.

[14] 雷衍之.养殖水环境化学[M].北京:中国农业出版社,2004.

[15] 国家质量技术监督局.GB 17378.4-1998 海洋监测规范第4部分:海水分析[S].北京:中国标准出版社,2004.

[16] 周玮,刘一兵,李坤,等.魁蚶苗种的潜沙行为观察[J].大连海洋大学学报,2011,26(6):550-553.

[17] 陈雷,张嵩,郭良勇,等.温度对毛蚶、文蛤和青蛤潜沙能力的影响[J].水产学杂志,2016,29(3):35-38.

[18] 张嵩.生态因子对青蛤、文蛤的潜沙及其苗种生长与存活的影响[D].大连:大连海洋大学,2014.

[19] 韩天坤,杨凤,贾甲,等.总氨态氮对菲律宾蛤仔早期生长发育的影响[J].大连海洋大学学报,2018,33(2):210-216.

[20] 曹滕飞,丛明,李兆艳,等.氨态氮对菲律宾蛤仔毒理机制研究的内参基因筛选[J].生态毒理学报,2017,12(2):182-190.

[21] 丛明,赵建民,吴惠丰.氨氮污染对菲律宾蛤仔的毒理效应初步研究[C]//中国海洋湖沼学会.“全球变化下的海洋与湖沼生态安全”学术交流会论文摘要集.南京:中国海洋湖沼学会,2014:162-163.