鱼类为低等水生动物，易受到生物和非生物因素的影响，所产生的生理或病理变化可通过血液学特征反映出来。黏液免疫和血液免疫是鱼类非常重要的免疫机制，其中，外周血细胞在特异性、非特异性免疫应答过程中均起着重要作用[1]。研究发现，血细胞的形态特征与动物分类、生理状况及系统演化方面均有一定的关系[2-3]，鱼类的血细胞具有吞噬、分泌等功能，可参与机体的伤口修复、防御等生理过程。鱼类血细胞对自身生理状况变化和外界环境因子刺激十分敏感，通过观察及测量血液指标可初步判断鱼类的健康情况，为疾病诊断及水域环境质量判定提供参考[4-5]。因此，研究鱼类的血细胞形态、数量和显微结构在水体生态环境监控、鱼类养殖生产等方面具有重要的指导作用。
鲑鳟鱼是世界上第三大主养鱼类，近年来，关于鲑鳟鱼血细胞研究中，相关学者仅对二、三倍体山女鳟Oncorhynchus masou和虹鳟Oncorhynchus mykiss血细胞的数量、大小及显微结构进行了比较[6-9]。本试验中，选取白点鲑Salvelinus malma、红点鲑Salvelinus leucomaenis、虹鳟及金鳟Oncorhynchus mykiss 4种鲑鳟鱼作为试验材料，采用瑞氏-姬姆萨混合染色法与血细胞计数法,观察并对比不同鲑鳟鱼外周血细胞的显微与超微结构及形态、数量特征，旨在为鲑鳟鱼血液学和免疫学研究提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用白点鲑(体质量49.07 g±12.05 g)、红点鲑(体质量83.23 g±15.07 g)、虹鳟(体质量60.12 g±11.86 g)和金鳟(体质量42.04 g±10.26 g)各8尾，均为1龄鱼，采自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所渤海冷水性鱼试验站，养殖水温为7 ℃，选择健康无病、活动状态正常的鱼。
1.2 方法
1.2.1 光镜样品制备 从每尾鱼尾静脉采集血液，经抗凝处理，用Dacie’s稀释液将血液稀释200倍和20倍，用于红细胞和白细胞计数。每尾鱼制作血涂片5张， 用瑞氏姬姆萨染液染色，光学显微镜下观察血细胞的形态特征并拍照，同时测量各细胞的长径和短径，每种细胞各测40个，并在油镜下对随机视野内100个白细胞进行分类计数，计算各种白细胞的占比。
1.2.2 电镜样品制备 电镜样品制备方法借鉴文献[10]～[12]，略有改进。采集鱼体尾静脉血(肝素抗凝处理)，转移至离心管中静置45 min，以12 000 r/min离心20 min；用移液枪吸取上层血清后，挑取薄薄的一层白细胞于灭菌离心管中，加入体积分数为3.0%的戊二醛固定液(用0.1 mol/L pH 7.4的磷酸缓冲液配制)5 mL固定1 d；用PBS冲洗3次，4 ℃下以3 000 r/min离心3 min，每次间隔12 min；用体积分数为1%的锇酸固定1.5 h，用磷酸缓冲液冲洗3次，条件同上；再分别用50%、70%和90%(均为体积分数，下同)梯度乙醇脱水1次，每次10 min，100%乙醇脱水2次，每次10 min，100%乙醇+100%丙酮(体积比1∶1)脱水1次，10 min，100%丙酮脱水1次，10 min，100%丙酮+812树脂(体积比1∶1)包埋0.5 h，812树脂包埋2 h，环氧树脂包埋30 min，超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在HITACHI7650型透射电镜下观察并拍照。
1.3 数据处理
采用SPSS 17.0软件对试验数据进行处理，试验数据均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，采用单因素方差分析比较不同鱼类同种外周血细胞间的差异，采用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 外周血细胞的组成及大小
从表1可见：虹鳟红细胞密度显著小于白点鲑、红点鲑和金鳟(P<0.05)，金鳟白细胞密度显著大于白点鲑(P<0.05)；4种鱼白细胞中均观测到嗜中性粒细胞、大淋巴细胞、小淋巴细胞及血栓细胞，白细胞中占比最高的均为小淋巴细胞，其中，虹鳟和红点鲑外周血中小淋巴细胞在白细胞中的占比无显著性差异(P>0.05)，两者占比均显著高于白点鲑和金鳟(P<0.05)；4种鲑鳟鱼大淋巴细胞和嗜中性粒细胞在白细胞中的占比均无显著性差异(P>0.05)，白点鲑外周血中血栓细胞和嗜中性粒细胞在白细胞中的占比较其他3种鱼高，虹鳟血栓细胞占比显著低于其他3种鱼(P<0.05)。
表1 血细胞计数结果
Tab.1 Result of blood cells counting
种类species红细胞密度/(103cells·mm-3)red blood cell density白细胞密度/(103cells·mm-3)white blood cell density白细胞分类计数white blood cell count/%嗜中性粒细胞neutrophil大淋巴细胞large lymphocyte小淋巴细胞small lymphocyte血栓细胞thrombus白点鲑S.malma61.64±16.30a21.76±4.09b19.82±5.667.21±1.5940.54±8.53b32.43±6.28a红点鲑S.leucomaenis65.31±13.60a24.10±10.34ab13.59±6.1212.50±3.0350.05±9.03a23.86±3.21a虹鳟O.mykiss43.67±15.06b28.56±6.31ab10.63±3.2515.18±4.7358.57±11.91a15.62±2.55b金鳟O.mykiss73.13±19.62a29.94±7.26a14.73±3.0311.11±2.8443.52±9.39b30.64±1.05a
注：同列标有不同字母组间具有显著性差异 (P<0.05)，标有相同字母或无标注者组间无显著性差异 (P>0.05)，下同。
Note: The means with different letters within the same column are significantly different among the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter or no within the same column are not significant differences (P>0.05), et sequentia.
从表2、表3可见：白点鲑红细胞的长径和短径均显著大于红点鲑(P<0.05)；虹鳟嗜中性粒细胞的长径显著大于白点鲑 (P<0.05)，4种鱼嗜中性粒细胞的短径无显著性差异(P>0.05)；金鳟大淋巴细胞的长径显著大于白点鲑和虹鳟(P<0.05)，4种鱼大淋巴细胞的短径无显著性差异(P>0.05)；4种鲑鳟鱼小淋巴细胞和血栓细胞的长径和短径均无显著性差异(P >0.05)；金鳟外周血中大淋巴细胞、小淋巴细胞、血栓细胞的长径和短经均大于其他3种鱼类。
从形态学来看，虹鳟红细胞长径与短径之比较小，其形态比其他3种鱼红细胞更接近圆形；4种鱼类白细胞中血栓细胞长径与短径之比稍大(表2)，表明血栓细胞更近椭圆形，而其他白细胞的长径与短径之比更接近于1(表3)，在形态上接近于圆形。
表2 4种鲑鳟鱼血细胞大小比较
Tab.2 Comparison of size of peripheral blood cells among 4 salmonid species
种类species红细胞erythrocyte嗜中性粒细胞neutrophil血栓细胞thrombus长径(L)/μmlong diameter短径(S)/μmshort diameter长径/短径L/S长径/μmL短径/μmS长径/短径L/S长径/μmL短径/μmS长径/短径L/S白点鲑S.malma14.52±0.38a8.75±0.17a1.65±0.1210.49±0.52b8.93±0.541.17±0.133.79±0.572.89±0.581.37±0.10红点鲑S.leucomaenis11.18±1.67b6.52±1.47b1.71±0.2011.04±0.60ab9.55±0.371.16±0.094.00±0.623.12±0.341.28±0.07虹鳟O.mykiss11.49±1.02b7.56±0.51ab1.52±0.1512.16±0.78a10.91±0.601.11±0.144.73±0.933.67±0.721.24±0.11金鳟O.mykiss12.80±0.69ab7.84±0.41ab1.63±0.1710.91±0.88ab9.00±0.501.21±0.254.8±0.623.81±0.611.31±0.14
表3 4种鲑鳟鱼淋巴细胞大小比较
Tab.3 Comparison of size of lymphocyte among 4 salmonid species
种类species大淋巴细胞large lymphocyte小淋巴细胞small lymphocyte长径/μmL短径/μmS长径/短径L/S长径/μmL短径/μmS长径/短径L/S白点鲑S.malma7.69±0.46b7.24±0.711.06±0.104.31±0.353.79±0.381.14±0.08红点鲑S.leucomaenis8.12±0.61ab7.79±0.701.04±0.134.39±0.374.01±0.631.09±0.12虹鳟O.mykiss7.83±0.57b7.20±0.641.03±0.214.17±0.383.76±0.401.11±0.06金鳟O.mykiss9.33±1.02a8.18±0.931.14±0.314.43±0.534.04±0.441.10±0.15
2.2 外周血细胞的显微结构观察
2.2.1 红细胞 光学显微镜下，可观察到圆形或近圆形的原红细胞，细胞核较大且圆，核质比较大，呈疏松网状的染色质被染成浅紫色，细胞质较少，被染成浅蓝色(图1A、B、C、D)；幼红细胞呈椭圆形，与成熟红细胞相似，但细胞核较成熟红细胞稍大，呈椭圆形，核质比较大，染色质结构疏松，着色较浅，细胞质较成熟红细胞少，染成较浅蓝色(图1E、F、G、H)；成熟红细胞呈椭圆形或长椭圆形，细胞表面光滑，细胞核近椭圆形，位于细胞中央，核中染色质密集，被染成深蓝色，细胞质被染成浅蓝色，红细胞的核质比约为1∶3 (图1I、J、K、L)；衰老红细胞较正常红细胞大，核也较大，染色质结构疏松，被染成浅紫红色，细胞质着色很浅，接近白色(图1M、N、O、P)。此外，可见被染成淡紫红色的“核影”红细胞，似裸核状，染色质呈疏松网状，其结构不同于外周血中其他有形成分(图1S)；偶见分裂期的红细胞、溶解红细胞(图1Q、R、T)。
A、B、C、D—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟原红细胞；E、F、G、H—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟幼红细胞；I、J、K、L—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟成熟红细胞；M、N、O、P—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟衰老红细胞；Q—白点鲑分裂期红细胞；R—红点鲑溶解红细胞；S—虹鳟核影细胞；T—金鳟溶解红细胞。标尺长度=10 μm。
A,B,C and D—primitive erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; E,F,G and H—immature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I, J, K and L—mature erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; M, N, O and P—aged erythrocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; Q—mitotic erythrocyte of Dolly varden; R—lysed erythrocytes of Alpine charr; S—nuclear shadow erythrocyte of rainbow trout; T—lysed erythrocytes of golden trout. bar scale=10 μm.
图1 红细胞显微结构
Fig.1 Microstructure of red blood cells
2.2.2 嗜中性粒细胞 光学显微镜下，嗜中性粒细胞多近圆球形，细胞核位于细胞的一侧，细胞质呈紫红色，表面有锯齿状突起，核质间较为明显，细胞核较大且常偏位；核有单叶核和分叶核，单叶核呈肾形、马蹄形和半圆形，分叶核多为2～3叶，少数为4～6叶，被染成蓝紫色。细胞质颗粒清晰，被染成紫红色，颗粒排列不规则，呈毛玻璃状。根据细胞核类型区分，白点鲑观察到5种嗜中性粒细胞，分别为马蹄形、半圆形、3叶形、4叶形、6叶形(图2A、B、C、D、E)；红点鲑观察到5种嗜中性粒细胞，分别为T形、马蹄形、S形、2叶形及3叶形共(图2F、G、H、I、J)；虹鳟观察到4种嗜中性粒细胞，分别为卵圆形、2叶形、3叶形、4叶形嗜中性粒细胞(图2K、L、M、N)；金鳟仅观察到2叶形嗜中性粒细胞(图2O)。
A、B、C、D、E—白点鲑马蹄形、3分叶、半圆形、4分叶、6分叶嗜中性粒细胞；F、G、H、I、J—红点鲑T形、马蹄形、S形、3分叶、2分叶嗜中性粒细胞；K、L、M、N—虹鳟卵圆形、2分叶、3分叶、4分叶嗜中性粒细胞；O—金鳟2分叶嗜中性粒细胞。标尺长度=10 μm。
A，B，C，D and E—neutrophil with a hoof-shape nucleus，trilobed nuclei， half round， quartered nuclei，and six nuclei of Dolly varden; F,G,H,I and J—neutrophil with T-shaped nucleus， hoof-shaped nucleus， S-shaped nucleus，trilobed nuclei，and bilobed nuclei of Alpine charr; K,L,M and N—neutrophil with oval nuclei，bilobed nuclei， trilobed nuclei，and quartered nuclei of rainbow trout; O—neutrophil with bilobed nuclei of golden trout. bar scale=10 μm.
图2 嗜中性粒细胞显微结构
Fig.2 Microstructure of neutrophils
2.2.3 淋巴细胞 光学显微镜下，淋巴细胞近圆形，有的表面光滑，有的有明显的伪足胞突(图3G)；核质比大，核占细胞体积的3/4以上，被染成蓝紫色，细胞质呈碱性被染成浅蓝或深蓝色，根据细胞的大小可将淋巴细胞分为大淋巴细胞(图3A、B、C、D)及小淋巴细胞(图3E、F、G、H)。
A、B、C、D—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟大淋巴细胞； E、F、G、H—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟小淋巴细胞； I—白点鲑成群聚集的血栓细胞；J—红点鲑肾形血栓细胞；K—虹鳟短棒状血栓细胞；L—金鳟短棒状血栓细胞。标尺长度=10 μm。
A,B,C and D—large lymphocyte of Dolly varden， Alpine charr， rainbow trout and golden trout; E, F, G and H—small lymphocyte of Dolly varden, Alpine charr, rainbow trout and golden trout; I—group of thrombocyte of Dolly varden; J—thrombocyte with a kidney-shaped nucleus of Alpine charr; K—thrombocyte with a clubbed nucleus of rainbow trout; L—thrombocyte with a clubbed nucleus of golden trout. bar scale=10 μm.
图3 淋巴细胞及血栓细胞显微结构
Fig.3 Microstructure of lymphocyte and thrombocyte
2.2.4 血栓细胞 光学显微镜下，血栓细胞呈圆形或椭圆形或不规则圆形，表面光滑，细胞质少，核质比大，细胞核呈肾形(图3J)、马蹄形(图3J)和棒形(图3K、L)，核中染色质密集，被染成深紫色；细胞质仅一薄层，着色较浅，呈淡蓝色、透明色或颜色不清，绕核零星分布，边界模糊，在白点鲑血细胞图片中还可观测到聚集成队的血栓细胞(图3I)。
2.3 外周血细胞的超微结构观察
2.3.1 红细胞 透射电镜下，4种鲑鳟鱼成熟红细胞呈椭圆形，表面光滑；细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核膜清晰，可见核孔；异染色质沿着核膜内侧呈带状分布，在核中央呈片状分布；胞质均匀致密，电子密度较高；成熟红细胞胞质内已无细胞器，核糖体亦几乎消失(图4A、B、C、D)。
2.3.2 淋巴细胞 透射电镜下，鲑鳟鱼淋巴细胞呈不规则圆形或椭圆形，有的表面伸出许多细小的指状突起(图4E)；核体积大，呈不规则形，偏于细胞一侧，核膜清晰，核内异染色质较少，结构疏松，位于核中央；胞质中细胞器较少，只含有少量细小颗粒和空泡，红点鲑和虹鳟淋巴细胞含有极少量线粒体(图4F、G、H)。
2.3.3 单核细胞 透射电镜下，单核细胞呈不规则椭圆形，表面有少量伪足状突起；核偏位，核膜不清晰，核内异染色质多，大部分沿核膜内缘分布；胞质丰富，有少量小的嗜天青颗粒，靠近细胞膜的外质中有许多大小不一数量不等的囊泡和空泡；金鳟和虹鳟单核细胞胞质可观察到线粒体，白点鲑胞质中溶酶体及内质网含量较为丰富，红点鲑和白点鲑胞质中含有少量嗜天青颗粒(图4I、J、K、L)。
2.3.4 嗜中性粒细胞 透射电镜下，嗜中性粒细胞呈锥形或椭圆形，表面可见突起和微绒毛；胞核较小、分叶，呈不规则状，偏于细胞一侧，核膜不清晰，异染色质较多且浓重，胞质丰富，特殊颗粒较多，有单位膜包被，形态多样，大小差异较大，排列不规则；比较几种鱼嗜中性粒细胞胞质中细胞器含量，白点鲑线粒体、核糖体、内质网含量均不丰富(图4M)，虹鳟及红点鲑嗜中性粒细胞内富含各种细胞器，线粒体数目多且大、峭清晰、内质网丰富，可见少量吞噬小泡(图4N、O、P、Q)，金鳟嗜中性粒细胞内可见少量线粒体(图4R)。
2.3.5 血栓细胞 透射电镜下，血栓细胞呈纺锤形、椭圆形或圆形；核较大，位于细胞中央，呈圆形或长椭圆形，核膜围隙和核孔均清晰；异染色质丰富、电子致密、多集中分布在核膜内侧，细胞中几乎无细胞质，偶见少量线粒体和空泡(图4S、U、V)；比较4种鱼的血栓细胞显示，白点鲑纺锤形血栓细胞核呈椭圆形，染色质呈细沙状，细胞器结构极少有少量空泡(图4S)，红点鲑血栓细胞为不规则形、细胞膜锯齿状、核近圆形，偏于一侧，核周有少量线粒体及吞噬泡(图4U)，而虹鳟及金鳟血栓细胞形态不规则，核呈椭圆形或近圆形，染色质呈细沙状，细胞器结构极少，有少量空泡及线粒体(图4V、W、X)。
A、B、C、D—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟成熟红细胞；E、F、G、H—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟淋巴细胞；I、J、K、L—白点鲑、红点鲑、虹鳟、金鳟单核细胞；M—白点鲑6叶形嗜中性粒细胞；N—红点鲑2叶形嗜中性粒细胞；O、P—红点鲑4叶形嗜中性粒细胞；Q—虹鳟2叶形嗜中性粒细胞；R—金鳟S形嗜中性粒细胞；S—白点鲑纺锤形血栓细胞；T—白点鲑椭圆形血栓细胞；U—红点鲑椭圆形血栓细胞；V—虹鳟血栓细胞；W—金鳟棒槌形血栓细胞；X—金鳟血栓细胞；m—线粒体；n—细胞核；g—颗粒； Ly—溶酶体； RER—粗面内质网； v—囊泡。
A，B，C and D—mature erythrocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; E，F，G and H—lymphocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; I，J，K and L—monocyte of Dolly varden，Alpine charr，rainbow trout and golden trout; M—neutrophil with six nuclei in Dolly varden；N—neutrophil with bilobed nuclei in Alpine charr; O and P—neutrophil with quartered nuclei in Alpine charr; Q—neutrophil with bilobed nuclei of rainbow trout; R—neutrophil with S-shaped nucleus of golden trout; S—thrombocyte with spindly nucleus of triploid Dolly varden; T—thrombocyte with oval nucleus in Dolly varden; U—thrombocyte with oval nucleus in Alpine charr; V—thrombocyte of rainbow trout; W—thrombocyte with clubbed nucleus in golden trout; X—thrombocyte of golden trout; m—mitochondria; n—nucleus; g—granules; Ly—lysosome; RER—rough endoplasmic reticulum; v—vesicle.
图4 血细胞超微结构
Fig.4 Ultrastructure of peripheral blood cells
3 讨论
3.1 血细胞组成
鱼类血细胞一般包括红细胞、血栓细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞7大类[13]。本试验中4种鲑鳟鱼外周血细胞中包括5类细胞，未发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞，这与陈侠君等[7]的研究结果一致。林光华等[14]认为，鱼类血液指标值的高低与鱼类活动性及食性有关，活动性强的鱼类高于活动性弱的鱼类, 肉食性鱼类高于草食性鱼类, 草食性鱼类高于杂食性鱼类。本试验中鲑鳟鱼属于肉食性鱼类，活动能力较强，其红细胞数量较中华鲟Acipenser sinensis[15]、5种鲤科鱼类多[16]，这与鲑鳟鱼的生态习性相适应，而较波纹唇鱼Cheilinus undulatus[17]、瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli[18]、白甲鱼Onychostoma sima[19]、罗非鱼Oreochromis mossambicus[20]及欧洲鳇Huso huso[21]红细胞密度低，可能与水温、年龄等有关；4种鲑鳟鱼白细胞密度较中华鲟[22]、欧洲鳇[21]高，这表明其抗病能力也高于二者；4种鲑鳟鱼白细胞中淋巴细胞数量最多，其次为血栓细胞和嗜中性粒细胞，这与大多数淡水鱼一致[14]，但在中华鲟[15]、淡水石斑鱼[23]等的白细胞中，血栓细胞最多。本研究中，金鳟的白细胞密度显著高于白点鲑，而与红点鲑和虹鳟间无显著性差异，表明白点鲑的抗病力可能相对较差。此外，本研究中测量出的虹鳟血细胞的大小较陈侠君等[7]的结果稍小，可能与测量误差、饲养环境、水温及个体差异等有关。
3.2 红细胞
红细胞是血液中最主要也是数量最多的细胞成分[24]，其主要功能是体内携带和运输氧气[25]。红细胞的形态和大小与动物的分类地位有关，进化地位越高，红细胞越小，此外，细胞核在高等哺乳动物进化过程中逐渐消失。红细胞的长短径比值可反映红细胞的基本形状：该比值越大，表明红细胞越呈长椭圆形；比值越接近于1，表明红细胞越呈圆形。不同种属间红细胞长短径比不同，本研究中，白点鲑长短径比与金鳟接近，小于红点鲑，大于虹鳟。与两栖类和爬行类动物相比，鱼类进化地位低，但大多数鱼类红细胞比两栖爬行类动物小，提示红细胞大小可能与其适应长时间底栖生活有关。本研究中，4种鲑鳟鱼中白点鲑红细胞长径和短径均最长，其相应的体积也大于其他3种鱼类，表明白点鲑的携氧能力、机体代谢能力可能要强于其他3种鱼类。在白点鲑血涂片中观察到处于分裂期的红细胞，与对条石鲷Oplegnathus fasciatus[1]、史氏鲟Acipenser schrenckii[26]等观察到的结果一致，表明鲑鳟鱼红细胞除了在造血器官中产生并释放到外周血中，还可在外周血中通过直接分裂产生[7]。此外，外周血中还发现少量原红细胞和幼红细胞，这与杂交鲟等相似[27]。有研究表明，未成熟红细胞的占总红细胞的比例与鱼的种类有关，而未成熟红细胞占比受鱼体温度、溶氧等生活环境的影响，还与鱼体的健康状况有关[28]。本研究中，电镜下观察到4种鲑鳟鱼红细胞形态结构相似。
3.3 单核细胞
单核细胞具有活跃的变形运动、明显的趋化性和一定的吞噬功能，在非特异性免疫中起到重要作用[22]。单核细胞细胞质中有较多大小不一数量不等的囊泡和空泡，对欧洲鳗鲡Anguilla anguilla[29]、鲤Cyprinus carpio[30]和鳜Siniperca chuitsi[31]等的研究表明，3种鱼均有较强的变形与吞噬能力。本研究中，电镜下观察到白点鲑较其他3种鱼其单核细胞胞质内具有更丰富的细胞器，细胞核电子更致密，推测白点鲑单核细胞变形和吞噬能力较其他3种鲑鳟鱼强。陈侠君等[7]在二倍体和三倍体虹鳟血涂片中观察到单核细胞数量很少，而本研究中在血涂片中未观察到单核细胞，这可能是因单核细胞的数量较少，且有时血涂片中嗜中性粒细胞与单核细胞难以区分所致。
3.4 血栓细胞
血栓细胞为鱼类的凝血细胞，具有凝血、吞噬(碳颗粒、细菌和细胞残骸)和蚕食分解衰老红细胞等功能，与哺乳动物血小板的功能类似。硬骨鱼类血栓细胞数量差异较大，有研究表明，血栓细胞数量在个体间波动极大，且受涂片制作过程影响明显[22]。陈侠君等[7]发现，虹鳟外周血白细胞中的血栓细胞在白细胞中占比最大，而本研究中发现，4种鲑鳟鱼淋巴细胞数量在外周血中占比最大。本研究中，白点鲑、红点鲑和金鳟外周血中血栓细胞占比显著高于虹鳟，4种鲑鳟鱼血栓细胞的大小间无显著性差异；血栓细胞在4种鲑鳟鱼中形态多样，但同种鱼外周血中为何出现多种形态有待进一步研究。另外，鲑鳟鱼血栓细胞中含少量的细胞器及空泡，可能与血栓细胞的吞噬功能有关，也可能类似于血小板中的表面连接系统，作用是增加血浆凝血因子附着的表面积[32]。
3.5 淋巴细胞
淋巴细胞是细胞免疫的重要组成部分，本研究中发现了两种大小和颜色稍有差别但形态结构基本一致的淋巴细胞，目前，两种淋巴细胞的功能尚未见报道。林光华[33]研究表明，成年草鱼大淋巴细胞和小淋巴细胞胞质内所含溶酶体样颗粒数量不同，可能两种淋巴细胞具有不同功能。也有研究表明，当处于静息状态的小淋巴细胞受到抗原刺激时，可转变成代谢活跃并具有增殖能力的大淋巴细胞，此时细胞核增大、染色质致密、细胞质增多，重新分裂和分化进行免疫应答，说明大小两种淋巴细胞可能代表了同种细胞的不同功能状态[34]。本研究中，大小两种淋巴细胞的形态和结构在4种鲑鳟鱼中差异不大，但虹鳟和红点鲑淋巴细胞数量显著高于白点鲑和金鳟，表明虹鳟和红点鲑抗病力可能高于白点鲑和金鳟；此外，4种冷水鱼外周血白细胞中淋巴细胞所占比例最大，血栓细胞占比也较大，这可能与其长期栖息于砾石底质水体中有关，白细胞以血栓细胞和淋巴细胞为主体，在鲑鳟鱼受伤后快速凝血，并将侵入体内的病原体杀死，以发挥免疫保护作用。
3.6 嗜中性粒细胞
嗜中性粒细胞存在于所有硬骨鱼类中，但嗜酸性和嗜碱性粒细胞也因鱼种类而异[22]。嗜酸性和嗜碱性粒细胞细胞质内的2种颗粒易溶于水，在制作血涂片过程中可能被溶解掉，从而不易被观察[35]。有学者在金鱼和革胡子鲶外周血中发现极少量的嗜碱性粒细胞[36-37]；在花斑裸鲤、南方鲇等的外周血中观察到嗜酸性粒细胞，但未发现嗜碱性粒细胞[28,38]；而欧洲鳗鲡等鱼类的外周血中仅存在嗜中性粒细胞[29]。本次试验中也未观察到嗜酸性和嗜碱性粒细胞，白点鲑嗜中性粒细胞数量在白细胞中占最多，虹鳟嗜中性粒细胞长径显著大于白点鲑，而与红点鲑和金鳟无显著性差异；鲑鳟鱼外周血细胞中观察到多种核型的嗜中性粒细胞，从细胞发育角度来说，嗜中性粒细胞的核从未分叶到分叶，其实是一个衰老的过程，且分叶越多，细胞衰老的程度越高[39]；白点鲑的嗜中性粒细胞数量比其他鱼类稍多，分叶更多，胞质中细胞器更少，推测白点鲑的嗜中性粒细胞较其他3种鲑鳟鱼而言，参与机体防御和免疫的效率更低，而白点鲑嗜中性粒细胞在白细胞中占比较其他3种鱼大，因此，嗜中性粒细胞的数量与工作效率之间可能存在一定的平衡。此外，嗜中性粒细胞具有吞噬能力，能做变形运动，可参与机体的炎症反应[40-41]。本研究显示，几种鲑鳟鱼嗜中性粒细胞内富含内吞泡及多种细胞器，表明均具有活跃的吞噬功能。
4 结论
1)4种鲑鳟鱼外周血中可见红细胞、淋巴细胞、嗜中性粒细胞、血栓细胞和单核细胞5种细胞。
2)4种鲑鳟鱼的成熟红细胞形态结构相似，金鳟红细胞密度最大，白点鲑红细胞体积最大，鲑鳟鱼红细胞除在造血器官中产生，还可在外周血中通过直接分裂产生。
3)4种鲑鳟鱼白细胞总数存在差异，其白细胞均以血栓细胞和淋巴细胞为主，其中，淋巴细胞数量最多，其次为血栓细胞和嗜中性粒细胞，单核细胞数量最少。金鳟白细胞密度最大，白点鲑白细胞密度最小。
4)小淋巴细胞和血栓细胞大小在4种鲑鳟鱼中无显著性差异。
5)4种鲑鳟鱼淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞形态结构相似，血栓细胞在4种鲑鳟鱼中形态多样。
[1] 胡玲玲,李加儿,区又君,等.条石鲷外周血细胞的显微结构[J].福建农林大学学报(自然科学版)，2009,38(4):384-387.
[2] 周永灿,邢玉娜,冯全英.鱼类血细胞研究进展[J].海南大学学报(自然科学版)，2003,21(2):171-176.
[3] 张永安,孙宝剑,聂品.鱼类免疫组织和细胞的研究概况[J].水生生物学报,2000,24(6):648-654.
[4] 王磊,张圣强,杨桂文.黄鳝外周血细胞显微结构的观察[J].科技信息,2009(2):22-23.
[5] 赵海鹏,王志坚,杨求华,等.花鱼骨外周血细胞显微结构[J].安徽农业科学,2009,37(22):10542-10544.
[6] 韩英,王琨,张澜澜,等.二倍体与三倍体虹鳟(Oncorhynchus mykiss)红细胞及部分血液指标的比较[J].淡水渔业,2007,37(6):52-55.
[7] 陈侠君,王炳谦,刘奕,等.二倍体和三倍体虹鳟外周血细胞的比较研究[J].东北农业大学学报,2010,41(1):86-92.
[8] 贾钟贺,徐革锋,谷伟,等.二倍体与三倍体山女鳟的血液学比较分析[J].中国水产科学,2010,17(4):807-814.
[9] 余波,董仕,白宝海,等.二倍体、三倍体虹鳟的血液指标分析[J].北京水产,2008(1):20-23.
[10] 李长玲,曹伏君,黄翔鹄,等.绿海龟外周血细胞的超微结构[J].热带海洋学报,2010,29(5):168-173.
[11] 李霖,李伟,吴孝兵,等.扬子鳄外周血细胞的超微结构[J].水生生物学报,2002,26(1):45-51.
[12] 洪涛.生物医学超微结构与电子显微镜技术[M].北京:科学出版社,1980:42-47.
[13] 周玉,郭文场,杨振国.鱼类血细胞的研究进展[J].动物学杂志,2001,36(6):55-57.
[14] 林光华,张丰旺,洪一江,等.二龄鲢和鳙血液的比较研究[J].水生生物学报,1998,22(1):9-16.
[15] 姚德冬,柴毅,王毅,等.中华鲟外周血细胞的显微结构[J].长江大学学报(自然科学版)，2015,12(21):22-26,80.
[16] 杨严鸥,余文斌,姚峰,等.5种鲤科鱼类血细胞数量、大小及血清生化成分的比较[J].长江大学学报(自然科学版),2006,3(2):159-160,164.
[17] 廖光勇,区又君,李加儿.波纹唇鱼血细胞显微结构和血液生化指标[J].海洋科学进展,2011,29(3):379-385.
[18] 铁槐茂,石丹,银龙,等.瓦氏黄颡鱼血液生理指标与外周血细胞组成及显微结构[J].四川农业大学学报,2015,33(1):78-83.
[19] 代应贵,岳晓烔,尹邦一.濒危鱼类稀有白甲鱼外周血细胞特征[J].动物学杂志,2014,49(6):875-885.
[20] 傅丽容,陈学光,黎学春,等.两种罗非鱼外周血细胞显微结构比较观察[J].湖北农业科学,2008,47(9):1065-1067,1076.
[21] ZAREJABAD A M,JALALI M A,SUDAGAR M,et al.Hematology of great sturgeon (Huso huso Linnaeus,1758) juvenile exposed to brackish water environment[J].Fish Physiology and Biochemistry,2010,36(3):655-659.
[22] 张艳珍,王彦鹏,危起伟,等.中华鲟外周血细胞组成及形态观察[J].水生生物学报,2018,42(2):323-332.
[23] 顾曙余,杜寅,丁力,等.淡水石斑外周血细胞显微结构观察[J].动物学杂志,2007,42(6):115-119.
[24] 秦真东.鱼类红细胞和虾类血淋巴细胞的免疫特性和抗菌机理研究[D].武汉:华中农业大学,2018.
[25] 王培.血红蛋白与红细胞释氧速率与自氧化速率的研究[D].天津:天津工业大学,2016.
[26] LIU H B, HUA Y P, QU Q Z et al.Microstructure and ultrastructure of peripheral blood cells of amur sturgeon Acipenser schrencki Brandt[J].Acta Hydrobiologica Sinica,2006,30(2):214-220.
[27] 任永丽,齐林星,杨志军,等.杂交鲟外周血细胞形态学观察[J].大连海洋大学学报,2018,33(5):595-599.
[28] 唐银.养殖花斑裸鲤外周血液生理指标及血细胞形态参数的研究[D].雅安:四川农业大学,2015.
[29] 周玉,郭文场,杨振国,等.欧洲鳗鲡外周血细胞的显微和超微结构[J].动物学报,2002,48(3):393-401.
[30] 冯怀亮,李文武,王铁恒,等.鲤鱼血细胞显微和亚显微结构的观察[J].水产学报,1991,15(3):241-244.
[31] 袁仕取,张永安,姚卫建,等.鳜鱼外周血细胞显微和亚显微结构的观察[J].水生生物学报,1998,22(1):39-47.
[32] 王彬,孙金生.牙鲆(Paralichthys olivaceus)外周血单个核细胞的离体培养和电生理特征研究[J].海洋与湖沼,2008,39(3):217-221.
[33] 林光华.成年草鱼外周血细胞的超微结构[J].动物学报,1996,42(2):123-128.
[34] ESIRI M.Cellular autoimmunity to muscle:a review[J].Proc R Soc Med,1977,70(5):330-332.
[35] 赵莎莎,丁丽军.胡子鲇外周血细胞的组成及显微与超微结构[J].江苏农业科学,2014,42(10):220-223.
[36] 林光华,张丰旺.革胡子鲶血液常数值的周年变化[J].动物学报,1991,37(3):341-342.
[37] WEINREB E L,WEINREB S.Studies on the fine structure of teleost blood cells.II.Microtubular elements of erythrocyte marginal bands[J].Anatomical Record, 1965,147(2):219-238.
[38] 赵海涛,张其中,赵海鹏,等.南方鲇幼鱼和成鱼血液指标的比较[J].动物学杂志,2006,41(1):94-99.
[39] WINTROBE M M.Variations in the size and hemoglobin content of erythrocytes in the blood of various vertebrates[J].Folia Haemat,1933,51:32-49.
[40] 赵凤岐,曹谨玲.硬骨鱼血细胞发生的研究进展及经济前景分析[J].中国渔业经济,2007(3):30-33.
[41] Rombout J H W M,Huttenhuis H B T,Picchietti S,et al.Phylogeny and ontogeny of fish leucocytes[J].Fish & Shellfish Immunology,2005,19(5):441-455.