福建省是鳗鲡Anguillid sp.养殖大省，鳗鲡产值在该省水产品贸易中占重要地位，因此，对鳗鲡疫病的研究尤为重要。鳗鲡疫病的病原有病毒性、细菌性、寄生虫等，目前对其病毒性疾病缺乏有效防控措施。该类疾病暴发时，常呈现出大范围的区域传播态势，给养殖行业造成了巨大的经济损失[1]。“脱黏败血综合征”是养殖鳗鲡白仔、黑仔阶段普遍发生的一种传染性疫病，自20世纪90年代就普遍发生。本试验在前期研究中，利用鳗鲡卵巢细胞系(Eel ovary, EO)从病料中分离出鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus，AngHV)，流行病学致病性分析表明，AngHV就是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原[2]。
AngHV为线性双链DNA病毒，隶属于鱼蛙疱疹病毒亚科Alloherpesviridae鲤疱疹病毒属Cyprinivirus[3]。目前，鲤疱疹病毒属中研究较多的包括对鲤科鱼类危害较大的鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)和鲤疱疹病毒Ⅲ型(cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)等病毒，并已开展了病原学、流行病学、感染机制、诊断及防控等方面的研究[4-5]，但基因功能方面的研究较少。基因序列分析表明，AngHV与CyHV-3的遗传距离最近，有40个同源基因，但序列的一致性均较低，仅为19%～58%。因此，有必要对AngHV基因开展深入研究。
AngHV基因组全长248.5 kbp，由一段长序列及两侧11 kbp末端重复序列组成，具136个开放阅读框(ORF)[6-7]。其病毒粒子由核衣壳、间质层和囊膜组成，预测含有7个衣壳蛋白、11个囊膜蛋白和22个被膜蛋白[8]。囊膜蛋白作为重要的结构蛋白，与病毒入侵宿主细胞、胞间传递、组织嗜好性及宿主范围等方面密切相关[9-12]，也常常被用来开发基因工程疫苗[13-14]。蛋白质组学分析表明，ORF8是AngHV的结构蛋白，并大量存在于病毒粒子的囊膜中[8]。对病毒基因表达时序的研究，有助于了解病毒复制周期、基因功能、病毒与宿主的相互作用及疾病控制[15]。目前，国内外尚未见对鳗鲡疱疹病毒ORF8基因及蛋白特征研究的报道。本研究中，通过设计引物，从AngHV-FJ病毒株中克隆ORF8基因，并对其序列进行生物信息学分析，表明其符合囊膜蛋白的基本特征；采用RT-PCR方法分析该基因在病毒入侵细胞过程中的转录时相，并进一步实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达，获得了高纯度的融合表达蛋白，以期为免疫诊断试剂和疫苗研究提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
AngHV福建株(AngHV-FJ) 由福建省农科院生物技术研究所分离，EO 细胞、表达载体pET-32a、克隆菌株Escherichia coli DH5α、表达宿主菌E.coli BL21 (DE3)均由福建省农科院生物技术研究所保存。
1.2 方法
1.2.1 AngHV-FJ的细胞扩繁及基因组DNA的提取 EO 细胞用L-15细胞培养基(含体积分数为10%的胎牛血清(美国Hyclone生物公司))于26 ℃细胞培养箱中培养。铺满单层的EO细胞按照感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1.0的比例接种AngHV-FJ病毒，待大部分细胞出现细胞病变(CPE)时，利用Pure LinkTM Viral RNA/DNA Mini Kit(美国英杰生命技术有限公司(Invitrogen))提取基因组DNA，置于-20 ℃下保存备用。
1.2.2 AngHV-FJ ORF8基因的克隆 以AngHV标准株的基因组(NC_013668)为参考，设计ORF8基因的特异性引物，分别在上下游加入BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位点(宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa))。引物序列：ORF8-F为ggatccATGTATAAGGCGTTGAGC，ORF8-R为gaattcTTACGCCCTGGCGTTGGT。以提取的AngHV-FJ基因组DNA为模板，进行ORF8基因序列的PCR扩增。PCR产物经凝胶电泳后，利用DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化，并与pMD19-T载体(宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa))连接，利用质粒小量抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取质粒，经PCR和双酶切鉴定后，阳性克隆测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)验证，获得质粒T-ORF8。
1.2.3 AngHV-FJ ORF8 基因的生物信息学分析 利用NCBI的Blast在线工具对扩增获得序列进行比对分析，利用Softberry进行基因转录启动子分析；利用ExPASy的Protparam预测蛋白理化性质，利用CDD工具分析编码蛋白保守功能域，利用TMHMM分析跨膜结构域，利用SignalP-4.1预测蛋白的信号肽，利用Psort预测蛋白的亚细胞定位，利用BepiPred对蛋白的B细胞抗原表位进行预测。
1.2.4 AngHV-FJ ORF8基因的表达时序分析 EO细胞按照MOI为1.0的比例接种AngHV-FJ病毒，在接种病毒后的0、3、6、24、48、72、96、120 h收集细胞，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经DNase消化后，用PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit(宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa))合成cDNA，于-80 ℃下保存备用。设计特异性扩增内参基因ACTB和ORF8的引物序列：ACTB-F为TCCAGGCCGACGTAGCACAG，ACTB-R为TGGCCCCCGAGGAGCAC；ORF8-F为ATGTATAAGGCGTTGAGC，ORF8-R为TTACGCCCTGGCGTTGGT进行PCR扩增。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析。
1.2.5 表达质粒32a-ORF8的构建 分别将质粒T-ORF8和pET-32a用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，获得的片段利用DNA胶回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化，利用T4 DNA连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司(TaKaRa))连接，转化至感受态E.coli DH5α细胞中，提取质粒，经双酶切确认，获得质粒32a-ORF8。
1.2.6 质粒32a-ORF8的诱导表达 将质粒32a-ORF8转化至感受态E.coli BL21( DE3)细胞中，挑选平板上阳性克隆，于LB液体培养基中37 ℃下培养过夜，次日接种于新鲜LB中，培养至吸光度OD600 nm为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L， 37 ℃下再培养12 h，离心收集细菌菌体，超声破碎后进行SDS-PAGE分析。
1.2.7 融合蛋白的Western blot鉴定 上述样品经SDS-PAGE电泳后，用半干转移法转至PVDF膜，将膜放入含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液中37 ℃下封闭1 h， 用TBST 缓冲液洗膜后，与1∶5 000倍稀释于TBS中的鼠抗 His-Tag单克隆抗体(英国艾博抗生物技术有限公司(Abcam))在室温孵育1 h，再用TBST缓冲液洗膜后，与1∶15 000倍稀释于TBST缓冲液中的HRP标记的羊抗鼠IgG(美国Cell Signaling Technology (CST)) 室温孵育1.5 h，用TBST洗膜后，采用Super ECL Plus化学发光液(北京兰博利德商贸有限公司(LabLead))显色，用ChemiScope 6000 Touch成像系统拍照(上海勤翔生物科技有限公司)。
1.2.8 融合表达蛋白的纯化 收集表达菌，超声破碎后进行蛋白的SDS-PAGE分离,染色后，将含目的条带的凝胶切下，在研钵(-80 ℃预冷)中研磨后，利用PAGE-胶蛋白微量回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)回收蛋白，置于-80 ℃下保存备用。
2 结果与分析
2.1 AngHV-FJ ORF8基因的克隆
利用设计的引物对ORF8-F/ORF8-R，从AngHV-FJ基因组中扩增出约650 bp的特异性条带(图1(a))，连接至pMD19-T载体，提取质粒后进行双酶切鉴定(图1(b))，经测序验证，确定克隆的就是AngHV-FJ的ORF8序列，将质粒命名为T-ORF8。
M1—DL2000 DNA Marker;M2—DL5000 DNA Marker;1—ORF8;2—阴性对照;3—BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切。
M1—DL2000 DNA Marker； M2—DL5000 DNA Marker；1—ORF8；2—negative control; 3—double enzyme digestion by BamHⅠ/EcoRⅠ.
图1 AngHV-FJ ORF8基因的PCR扩增及克隆
Fig.1 PCR amplification and cloning of AngHV-FJ ORF8
2.2 AngHV-FJ ORF8基因的生物信息学分析
2.2.1 AngHV-FJ ORF8 基因序列分析 Blast分析表明，AngHV-FJ ORF8的基因序列与GenBank中参考株AngHV-1的 (NC_013668)ORF8序列一致性为99.84%，仅在基因的第544 bp碱基处出现点突变(T→C)，对应基因编码的氨基酸由Y→H。Softberry的基因转录启动子分析显示，在上游-10 bp和-35 bp处分别存在为TATAAG和TTGTCT的启动子序列，在-20 bp处存在转录因子rpoD15的潜在结合位点，序列为TTTTGTTT；在终止密码子TAA下游41 bp处存在poly A尾，序列为AATAAAAA。
2.2.2 AngHV-FJ ORF8蛋白特征分析 Protparam分析显示，预测ORF8基因编码的蛋白相对分子质量为23 700,等电点为5.72，属于酸性蛋白；不稳定系数为19.65，比较稳定；总平均亲水性为-0.206，为亲水性蛋白。CDD、TMHMM、SignalP-4.1、Psort和BepiPred分析显示，ORF8蛋白不含保守功能区，在氨基酸序列的第158～180位存在跨膜结构，无信号肽结构，亚细胞定位于细胞质膜，并存在10个潜在抗原位点，表明ORF8蛋白可能具有较好的免疫原性(表1)。
表1 AngHV-FJ ORF8蛋白的B细胞抗原表位预测
Tab.1 Prediction of the B cell antigenic epitopes of AngHV-FJ ORF8 protein in B cells
预测表位的氨基酸位置amino acid location of the predicted epitope预测表位的氨基酸序列amino acid sequence of the predicted epitope20～24STWQ27～30MCEG43～45TAD53～59YSEENGE69～79GIWKPEPYAAN83～85TVD87～91DGRLN118～131NCTDDPRMAGNMTW144～153LREPRPDILV183～204THPSPKKTRYSKLRPDDDDETL
2.3 AngHV-FJ ORF8基因的转录时相分析
AngHV感染EO细胞后120 h，多数细胞发生CPE。为了解AngHV入侵细胞后ORF8的表达情况，本试验中在EO细胞感染AngHV-FJ后的不同时间点收集细胞，利用RT-PCR方法对ORF8的转录时相进行了分析。结果显示，ORF8在病毒感染细胞后3 h就可以检出，在24 h达到高峰，随后表达量无明显变化，作为对照的内参基因ACTB在所有时间点的表达量无显著性差异(图2)。这表明，ORF8基因可能是AngHV的早期基因，在病毒感染早期发挥作用。
2.4 AngHV-FJ ORF8基因在大肠杆菌中的表达
质粒T-ORF8用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切，回收目的片段，与表达载体pET-32a连接，连接质粒用BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切鉴定，结果出现大小约650 bp的特异性条带(图3)，这表明成功构建了表达质粒32a-ORF8。将该质粒转化至E.coli BL21，IPTG诱导表达，菌体进行SDS-PAGE分析。结果显示，与未经诱导的全菌蛋白相比，含pET-32a载体的诱导菌在相对分子质量为20 400处有明显的蛋白条带，而含32a-ORF8的诱导菌在约44 000处有明显的蛋白条带(图4(a))。
M—DL1000 Marker； NA—阴性对照。
M—DL1000 Marker； NA—negative control.
图2 AngHV感染EO细胞后ORF8转录时相的RT-PCR分析
Fig.2 ORF8 transcription profiles in AngHV infected EO cells by RT-PCR analysis
M—DL5000 DNA Marker； 1 —BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切。
M—DL5000 DNA Marker； 1—double enzyme digestion by BamHⅠ/EcoRⅠ.
图3 质粒32a-ORF8酶切鉴定
Fig.3 Restriction enzyme digestion of the plasmid 32a-ORF8
进一步的Western blot分析表明，与未经诱导的全菌蛋白相比，含pET-32a载体的诱导菌可被鼠抗His-Tag单克隆抗体检测到相对分子质量为20 400的蛋白条带，而含32a-ORF8的诱导菌可被鼠抗His-Tag单克隆抗体检测到相对分子质量约44 000的蛋白条带(图4(b))，表明表达的ORF8蛋白与预期23 700的大小一致，实现了ORF8基因在E.coli BL21(DE3)中的完全表达。
M—预染标准分子量蛋白Marker；1—BL21全菌蛋白；2—未经诱导的BL21/pET-32a全菌蛋白；3—诱导的BL21/pET-32a全菌蛋白；4—未诱导的BL21/32a-ORF8全菌蛋白；5—诱导的BL21/32a-ORF8全菌蛋白。
M—predyed standard molecular weight protein Marker; 1—total cell protein of BL21; 2—uninduced total cell protein of BL21/pET-32a; 3—induced total cell protein of BL21/pET-32a; 4—uninduced total cell protein of BL21/32a-ORF8; 5—induced total cell protein of BL21/32a-ORF8.
图4 AngHV-FJ ORF8在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE和Western blot分析
Fig.4 SDS-PAGE and Western blot analysis of the expression of AngHV-FJ ORF8 in Escherichia coli
2.5 ORF8蛋白的纯化
收集诱导表达的ORF8蛋白条带，用PAGE-胶蛋白微量回收试剂盒纯化后，进行SDS-PAGE检测。结果显示，与含32a-ORF8的诱导菌全菌蛋白相比，回收蛋白为与ORF8蛋白大小一致的单一条带，表明成功获得了高纯度的ORF8表达蛋白(图5)。
3 讨论
3.1 AngHV-FJ ORF8基因序列的特征
生产实践中，AngHV给鳗鲡养殖业者造成了极大的经济损失[16] ，但学界目前对于该病毒的研究还不深入。AngHV是具囊膜的双链DNA病毒，囊膜蛋白可参与病毒包膜和宿主细胞膜间的膜融合[17-19]，对病毒囊膜蛋白进行研究，可以加深人类对宿主与病毒关系的认识，有助于阐明其发病机制，制定有效的防治策略[11]。本研究中克隆了AngHV的ORF8基因，并对ORF8基因及其编码的蛋白特征进行了生物信息学分析，结果显示，ORF8基因编码蛋白稳定性较好，亲水性较强，存在跨膜结构，定位于细胞质膜上，且存在多个抗原表位，符合囊膜蛋白的基本特征。在进一步的研究中将对蛋白进行功能鉴定，以探讨其在病毒感染中的具体作用。
M—预染标准分子量蛋白Marker；1—纯化的ORF8蛋白；2—诱导的BL21/32a-ORF8全菌蛋白。
M—predyed standard molecular weight protein Marker; 1—the purified ORF8 protein; 2—induced total cell protein of BL21/32a-ORF8.
图5 回收纯化AngHV ORF8蛋白的SDS-PAGE分析
Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified AngHV ORF8 protein
3.2 AngHV-FJ ORF8基因的表达时序
疱疹病毒在感染过程中，基因按照表达时序性一般分为3种类别——极早期基因(immediate-early gene, IE)、早期基因(early gene, E)和晚期基因(late gene, L)[20-21]，但三者间无较明确的界限[22]。一般来说，疱疹病毒的早期基因在病毒感染后的2～4 h开始表达[23]。本研究中显示,ORF8的转录本在病毒感染3 h即检测到，在感染24 h后达到峰值，因此，该基因可能在病毒感染和复制的早期就发挥作用[22]。
3.3 AngHV-FJ ORF8蛋白表达的应用
准确的病原诊断是病毒疾病预防和治疗的基础。目前，相关领域已建立了多种基于PCR的AngHV检测方法[24]，但还未见免疫学检测方法的报道。病毒的囊膜蛋白多具有良好的免疫原性[25-27]，如CyHV-2[28-31]、CyHV-3[32-35]和鲫疱疹病毒(Carassius auratus herpesvirus, CaHV)[36],常应用于建立相应的免疫学检测方法和作为制备亚单位疫苗的抗原。因此，本研究在分析ORF8抗原表位的基础上，实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达，并获得了高纯度的纯化蛋白。表达的蛋白与预期大小一致，说明ORF8蛋白可能并不存在翻译后修饰，这为下一步的抗体制备、免疫效果评价及免疫学诊断方法的建立奠定了前期基础，对于鳗鲡疱疹病毒疾病的防控研究具有重要意义。
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