一株鲤春病毒血症病毒SVCV-shlj4全基因组序列分析

鲤春病毒血症(Spring Virernia of Carp，SVC)是一种高致病性、高传染性的鲤科鱼类病毒性疾病。在自然条件下，可感染锦鲤Cyprinus carpio、草鱼Ctenopharyngodm idellus、银鱼Hypophthalmichthys molitrix、胖头鱼Aristichthys obilis、鲫Carassius auratus、金鱼C.auratus、拟鲤Rutilus rutilus、圆腹雅罗鱼Leuciscus idus、丁鲷Tinca tinca和六须鲇Silurus glanis[1-2]。该病最早流行于中世纪欧洲大部分地区。1998年英国环境、渔业和水产养殖科学研究中心从中国对英国出口的锦鲤中检测出SVCV之前，中国无该病毒流行的报道。中国内地对于该病的首次报道是在2003年Liu等[3]从天津某观赏鱼养殖场分离鉴定出SVCV。

SVCV是一种有类脂囊膜的弹状病毒，长为90～180 nm，宽为60～90 nm，隶属单股负链RNA病毒目弹状病毒科Rhabdoriridae水泡性病毒属Vesiculorius[1]。SVCV的基因组全长约为11 000 bp，共包含5个主要的开放阅读框(Open Reading Frame, ORFs)，分别编码5种结构蛋白，即核蛋白(Nuclear protein，N)、磷蛋白(Phosphoprotein，P)、基质蛋白(Matrix protein，M)、糖蛋白(Glycoprotein，G)和RNA聚合酶(RNA polymerase，L)，各结构蛋白之间的连接顺序为3′-N-P-M-G-L-5′[4]。目前GenBank中共收录16株SVCV的全基因组序列，其中11株来自中国。Stone等[5]于2003年对来自不同国家的15株SVCV分离株部分G蛋白的基因序列(550 bp)进行了系统发育分析，将世界范围内的SVCV分成Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd 4个基因型。此后，编码G蛋白的基因序列成为划分SVCV基因型的主要参考基因序列。目前，国内有3株SVCV分离株(SVCV-A1、SVCV-265、BJ0505-2)完成了全基因组序列生物学分析工作[6-8]。

本课题组在水生动物疫病监测期间，获得一株中国北方地区现行毒株SVCV-shlj4[9]。为了更好地了解该毒株的分子特征，本研究中通过分段克隆、测序、拼接，获得了该毒株的全基因组序列，结合生物信息学研究方法对该基因组序列及其编码M蛋白、G蛋白、P蛋白的基因序列进行了系统发育和基因型分析，旨在明确中国北方地区SVCV分离株与国内乃至世界各地SVCV毒株间的进化关系，为揭示SVCV分子进化机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papulosum cyprini，EPC)由中国水产科学研究院长江水产研究所曾令兵研究员惠赠；SVCV-shlj4毒株由本课题组在2016年黑龙江地区养殖鲤流行病调查中分离保存。

大肠杆菌(E.coli)DH5α、pMD18-T克隆载体、PCR纯化试剂盒、RACE试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；Easy-A High Fidelity Cloning Enzyme购自Stratagene公司；MEM(Minimum essential medium)细胞培养基、胰酶购自Hyclone生物公司；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)购自Gibco生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计根据GenBank公布的SVCV-A2基因组序列(NCBI登录号：DQ491000.1)，利用Primer Premier 5.1软件设计特异性引物。将SVCV-shlj4毒株全基因组编码区分成3个部分，分别命名为1st、2nd、3rd，为保证扩增的准确性，相邻的扩增片段之间含有部分重叠区域。3对重叠引物分别为

1st F：5′ATGAGTGTCATTCGGATCAAAACAA 3′，

1st R：5′TTCAGCTGCATGGCAGATCCATCCA 3′；

2nd F：5′TACACGGAAATCTACCTAACACA 3′，

2nd R：5′TCATCATTGTTGATGATTAATCCTAG 3′；

3rd F：5′ACACAGTTGTAAAAGTGTTGGCT 3′，

3rd R：5′CTATTCTACCCATGTCCCAGAGT 3′。

根据已获得SVCV-shlj4毒株的CDS序列信息，利用RACE试剂盒，设计合成用于扩增5′末端和3′末端非编码区的上、下游引物，分别为

5′RACE：GTTAGCCGGAAGCACGGCAGCAACT，

3′RACE：TCGGTACCAACAGTGTCTTCCGCTC。

以上引物由长春库美生物公司合成。

1.2.2 PCR产物的克隆及测序采用Trizol法对SVCV-shlj4毒株进行总RNA的提取[10-11]。以提取的总RNA作为模板，利用Easy-A高保真DNA聚合酶，对SVCV株 3段基因序列进行RT-PCR的扩增及3′末端加A处理。利用PCR纯化试剂盒对扩增获得的PCR产物回收。将回收后的产物与pMD18-T载体连接，转化至E.coli DH5α中，在含有氨苄青霉素抗性的LB平板中培养，直至长出单菌落。每个连接选择3个阳性克隆并送至库美公司测序，以得到SVCV-shlj4毒株的编码区基因序列。利用RACE试剂盒，结合已获得的编码区基因序列，继续扩增SVCV-shlj4分离株5′末端和3′末端非编码区，对其进行回收、连接、转化、测序，操作方法同上。

1.2.3 SVCV-shlj4毒株系统发育分析利用DNAsis软件对该毒株的3段基因序列及5′末端和3′末端非编码区的测序结果进行拼接，结合Lasergene(DNAStar，Inc.，USA)、Clustal W及MEGA 5.1生物信息学软件，对SVCV-shlj4毒株基因组及GenBank中检索得到的其他16株SVCV基因组序列进行同源性分析并绘制系统发生树。同时，利用MEGA 5.1软件和Lasergene对SVCV-shlj4分离株及其他SVCV参考毒株编码的M蛋白、P蛋白、G蛋白基因序列进行多重对比，采用Neighbor-Joining法(1000 runs)构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 SVCV-shlj4毒株基因组特征

SVCV-shlj4毒株基因组全长为11 029 bp，已提交至GenBank( NCBI登录号：MT675953)。该基因组共由5个开放阅读框构成，从3′端到5′端共编码5 个结构蛋白，各结构蛋白之间的连接顺序为 3′-N-P-M-G-L-5′(表1)。N基因全长为1335 bp，开放阅读框长度为1257 bp，编码蛋白418 aa，蛋白相对分子量约为47 000；P基因全长为967 bp，开放阅读框长度为930 bp，编码蛋白309 aa，蛋白相对分子量约为36 000；M基因全长为716 bp，开放阅读框长度为672 bp，编码蛋白223 aa，蛋白相对分子量约为26 000；G基因全长为1598 bp，开放阅读框长度为1530 bp，编码蛋白约509 aa，蛋白相对分子量约为57 000；L基因全长为6325 bp，开放阅读框长度为6288 bp，编码蛋白2095 aa，蛋白相对分子量约为121 000。

SVCV-shlj4毒株的N基因、M基因、G基因、L基因均由AACAGACATC(ATG)作为转录起始信号，而P基因的转录起始信号序列为AACAGAGATC(ATG)，有一个碱基发生突变，各基因序列均以TATG(A)7作为转录终止信号。此外，毒株各基因的连接区高度保守，其中N基因、P基因、M基因及G基因之间的连接区均为CT，G基因和L基因之间的连接区为CTAT。SVCV-shlj4毒株基因组的3′ 端非编码区(1 nt～8 nt)与5′ 端非编码区(11029 nt～11022 nt)存在8对反向互补序列(ACGAAGAC)(图1)。

2.2 SVCV基因组序列的系统发育分析

使用MEGA 5.1软件，采用邻位相连法(Neighbor-Joining)通过自举分析(Bootstrap 1000 runs)构建包括SVCV-shlj4在内的17株SVCV全基因组的系统发育进化树，各参考毒株具体的信息如表2所示。进化分析结果显示：SVCV-shlj4毒株与中国内地株(10株)、中国香港株(1株)及韩国株(3株)聚为一簇，同属亚洲分支，一致性在97.1%～99.0%，与SVCV-A2毒株一致性最高(99.0%)，与SVCV-202238毒株一致性较低(97.1%)；Fijan株和VR-1390株属于欧洲分支，SVCV-shlj4株与二者在进化上有明显差异，一致性最低(93.0%)(图2)。

2.3 编码M、G、P蛋白的基因系统发育分析

利用BLAST检索(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)获得其他SVCV参考株编码M、G、P蛋白的基因序列，进行系统发育进化分析。结果显示：根据编码M蛋白的核苷酸序列可将SVCV分为两大分支，亚洲分支和欧洲分支，其中亚洲分支包括中国所有毒株、韩国株ADC-SVC2016-1和美国株(207914、266921、316715、212364及322383)(图3)；根据编码G蛋白的核苷酸序列可将SVCV分为4个基因型，分别为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc和Ⅰd，其中，SVCV-shlj4毒株的基因型为Ⅰa，与中国株SVCV-265可能来源于同一祖先，聚为一簇(图4)；根据编码P蛋白的核苷酸序列可进一步将Ⅰa基因型划分成Ⅰai和Ⅰaii两个基因亚型，SVCV-shlj4株与中国株BJ0505-2、SVCV-A1、SVCV-A2及美国株OM-24聚为一簇，均为Ⅰaii基因亚型，其中与SVCV-A2株的一致性最高(99.0%)(图5)。

2.4 各基因序列变异位点分析

SVCV-shlj4毒株各基因序列变异位点的分析结果显示(图6)：与中国株SVCV-A1相比，SVCV-shlj4毒株在N基因编码区第1357、1364和1376 nt分别缺失1个碱基，在G基因3′端非编码区4630 nt处和4639 nt处缺失两段基因序列(分别为44 bp和31 bp)；与欧洲株VR-1390相比，SVCV-shlj4毒株在G基因3′端非编码区(4637 nt位点)插入一段10 bp的基因片段；与中国株BJ0505-2相比，SVCV-shlj4毒株在L基因编码区(5822 nt位点)缺失一段18 bp的基因片段，该基因缺失导致L基因编码区缺失6个氨基酸(序列为KSLANA)(图7)。

3 讨论

SVC首次被报道是在20世纪70年代，Fijan[12]从患病的鱼体中分离得到SVCV。该病毒严重威胁到欧洲鲤鱼养殖业的发展，并对其造成了巨大的经济损失。中国对于SVCV的报道是在2002—2004年间，刘荭等[3，13]在对全国范围内SVCV监控过程中，首次分离报道了该病毒。近年来，该病在中国虽然没有大规模的暴发，但在多个地区均有关于SVCV分离鉴定的报道，这应当引起国内鲤科鱼类养殖业的高度重视。

3.1 参考毒株的选择及基因组结构分析

由GenBank SVCV分离株的收录情况可知，迄今为止，国际上共完成了16株SVCV毒株基因组序列的测定工作，其中11株为中国株。本课题组在水生动物疫病监测期间，分离获得了一株中国北方地区现行毒株SVCV-shlj4。根据OIE检测标准对该病毒进行鉴定，RT-PCR产物测序结果对比显示，SVCV-shlj4与中国株SVCV-A2的核酸一致性最高。因此，本研究中选用SVCV-A2作为参考毒株设计引物，以获得SVCV-shlj4全基因组序列。测序结果显示，该毒株的基因组大小为11 029 bp，共编码5种结构蛋白，各基因之间的连接区高度保守，N基因、P基因、M基因及G基因连接区均为CT，G基因与L基因连接区为CTAT，这些基因间连接区与其他水泡病毒属成员一致，区别于弹状病毒科的其他属成员[14]。同时，SVCV-shlj4毒株基因组的3′ UTR与5′ UTR存在8对反向互补序列，这是弹状病毒基因组和不分段负链RNA病毒的共同特征[15]。

3.2 全基因组及编码M、G、P蛋白的基因系统发育分析

在得到SVCV-shlj4毒株全基因组序列后，将其与其他16株SVCV参考株全基因组序列进行系统发育分析，结果显示，SVCV基因组序列相对稳定，但不同地区的毒株存在一定的差异，一致性为93.0%～99.0%。通过对比SVCV参考株编码M、G、P蛋白的基因序列，构建系统发育进化树，可以发现，编码M蛋白的核苷酸序列可将SVCV分为两大分支，亚洲或亚洲原始分支及欧洲分支[16]。亚洲SVCV分离株(包括韩国株和中国株)均处于同一分支，各毒株间核苷酸一致性较高，亚洲原始株包括美国株207914、266921、316715、212364、322383[16]，其中SVCV-shlj4株与美国株322383的一致性最高(99.7%)，说明二者可能来源于同一祖先。根据编码G蛋白的部分核苷酸序列可将SVCV分为4种基因型，分别为Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅰd，其中，Ⅰa基因型包括亚洲株和亚洲原始株，Ⅰb和Ⅰc基因型包括来自摩尔多瓦、乌克兰和俄罗斯等国家的分离株，Ⅰd基因型包含来自英国和其他欧洲国家的分离株。目前，中国SVCV分离株均为Ⅰa基因型[3]。由于编码P蛋白的基因系统发育树与编码G蛋白的基因拓扑结构相似[6]，可将Ⅰa基因型进一步分为Ⅰai和Ⅰaii两个基因亚型，SVCV-shlj4与中国株A1、A2、BJ0505-2及美国株OM-24聚为一簇，均为Ⅰaii基因亚型，印证了之前关于美国毒株由亚洲传入的假说[8,17]。

3.3 各基因变异位点分析

在对比分析各个参考毒株和SVCV-shlj4毒株各基因核苷酸变异位点时发现，SVCV-shlj4毒株与中国株SVCV-A1、BJ0505-2、欧洲株VR-1390在N基因、G基因及L基因存在明显差异。其中，SVCV-shlj4毒株与中国株SVCV-A1差异性主要存在于N蛋白的编码区和G蛋白的3′端非编码区；与中国株BJ0505-2的差异性主要存在于L蛋白的编码区；与欧洲株VR-1390株的差异性主要存在于G蛋白的3′端非编码区。这些差异性可能是导致各个地区毒株毒力强弱的主要原因之一。

综上所述，SVCV-shlj4毒株在进化上属于亚洲分支，属Ⅰa基因型，Ⅰaii基因亚型。虽然当前国内SVCV基因型均为Ⅰa，但来源于不同地区SVCV分离株的核酸序列依然存在一定差异，SVCV毒株在中国不同地区不同环境中正在不断地进化。本研究结果可为SVCV分子进化研究提供数据支撑。

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