复合益生菌对锦鲤性腺脂肪酸组成、繁殖力及仔鱼成活率的影响

益生菌一词来源于古希腊文Probiotics，被译为“共生”之意，与抗生素相对立，在动物体生命维持上可起到相互补益的作用[1-2]。1986年，Kozasa[3]首次将益生菌应用于水产养殖领域，将分离出来的东洋芽孢杆菌Bacillus toyoi应用于日本鳗鲡Anguilla japonica养殖中，认为其可增强日本鳗鲡抵抗爱德华氏菌Edwardsiella的能力。1988年，Fuller将益生菌定义为“通过改善肠道微生物平衡，有益地影响宿主动物的活的微生物饲料添加剂”[4]。此后，随着微生物学的不断发展，益生菌在水产养殖中得到了广泛应用，并表现出了较好的应用效果[5-6]。众多研究表明，益生菌在水产养殖中有如下功能：(1)益生菌可调控水质，如枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis制剂可使罗氏沼虾Macrobrachium rosenbergii养殖池塘水中氨氮和亚硝酸态氮的降解率达到59.61%、86.70%[7]，复合益生菌可有效降低草鱼Ctenopharynodon idellus养殖池塘水体中硝酸盐和无机氮含量[8]；(2)益生菌可促进动物生长，如枯草芽孢杆菌能促进草鱼对饲料的吸收能力，提高生长性能[9]，微生态制剂可显著提高锦鲤Cyprinus carpio L.的生长性能[10]；(3)益生菌能提高机体免疫力，如饲料中添加嗜酸乳酸杆菌Lactobacillus acidophilus可有效增强斑马鱼Danio rerio抵抗致病菌的能力[11]，芽孢杆菌Bacillus可显著提高斑节对虾Penaeus monodon细胞、体液的免疫力[12]；(4)益生菌可调节肠道菌群，如复合益生菌可使大菱鲆Scophthalmus maximus[13]、鲫Carassius auratus[14]和异育银鲫Carassius auratus gibelio[15]肠道中有益菌数量增加、有害菌数量降低，可改善和平衡肠道菌群，促进个体发育；(5)益生菌可抑制有害微生物生长，可通过降低肠道中的pH值增强对致病菌的抵抗能力[16-17]，同时，益生菌产生的细菌素具有广谱抑菌作用[18]。

综上，益生菌在水产领域得到了较为广泛的应用，但目前有关益生菌对鱼类亲本繁殖力影响的研究尚不多见。近年来，随着人们生活水平的提高，观赏鱼产业迅速发展，锦鲤作为观赏鱼中的“宝石”品种，备受市场欢迎，越来越多的人开始从事锦鲤人工养殖。用常规培育方法培育亲鱼，其产卵量每年起伏较大。有报道显示，益生菌在畜禽养殖中可显著提高母体的繁殖性能[19-20]。为此，本研究中考察了饲料中添加复合益生菌对锦鲤亲鱼性腺脂肪酸组成、繁殖力及初孵仔鱼成活率的影响，旨在为益生菌在锦鲤的人工繁殖、苗种培育中的应用提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼取自北京市水产科学研究所小汤山良种繁育中心自行培育的3龄红白锦鲤亲鱼，600尾亲鱼(雌雄各300尾)体质健壮、品种特征明显。雌鱼体质量为(2649.0±257.5)g，雄鱼体质量为(2349.0±283.9)g。

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、丁酸梭菌Clostridium butyricum和粪肠球菌Enterococcus faecalis菌株号分别为2018070601、2017121302和2018042501，由渔业生物技术北京市重点试验室从健康锦鲤消化道中分离得到，纯化后进行发酵培养，并收集菌体，测定菌液浓度，活菌量分别达到了109 cfu/mL。依据其他学者研究结论并综合考虑后，将枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌菌数按1∶1∶1、1∶1∶5、2∶3∶3、4∶2∶3共4种比例进行复配，因3种菌的活菌量一致，将菌数比转化为体积比进行复配，复配后活菌量仍为109 cfu/mL。

1.2 方法

1.2.1 饲养管理试验鱼暂养于小型循环水养殖池(3.2 m×1.8 m×1.5 m)中，水深为1.2 m。养殖用水为地下井水，水温为(24±2)℃，pH为7.4～7.8，溶解氧≥5 mg/L，光照为自然光源。每日投喂两次(9:30～10:00、17:00～17:30)，日投喂量为鱼体质量的3%～4%，根据鱼体的摄食情况做适当调整。3～5 d换水一次，不间断充气，暂养7 d，正式试验周期90 d。

1.2.2 试验饲料的制备试验用基础饲料购于北京三友创美饲料科技有限公司。锦鲤亲鱼培育期间，基础饲料营养成分为粗蛋白质40.3%、粗脂肪21.6%、粗灰分10.4%、水分4.7%。取4种复配菌液分别喷洒到饲料中，晾干，使饲料中含菌总量达到109cfu/mg，从而制得枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌、粪肠球菌菌落数比例分别为1∶1∶1(A)、1∶1∶5(B)、2∶3∶3(C)、4∶2∶3(D)的4种复合益生菌饲料。菌液和饲料于4 ℃冰箱中保存备用。定期检测饲料中菌含量是否合格(菌含量达到109 cfu/mg视为合格)。

1.2.3 试验设计及人工繁育锦鲤暂养7 d后，随机将600尾鱼平均分配到15个养殖池(11.8 m×5.4 m×1.5 m)中，其他养殖条件同暂养期，每个养殖池由中间隔网分开为两个养殖池(a、b)，a池中养殖雌鱼、b池中养殖雄鱼。试验共分A组、B组、C组、D组和E组(对照组)，分别饲喂制备的4种比例的复合益生菌饲料，对照组投喂不添加益生菌的基础饲料，每组设3个重复，每个重复40尾鱼，雌雄比例为1∶1。

待雌雄亲鱼发情后，从每个养殖池随机选取的20尾雌鱼与同组随机选择的雄鱼进行人工繁殖，雌雄比例为1∶1，将受精卵均匀铺在孵化网片上进行孵化，孵化温度为(25±0.5)℃，及时清除发白的鱼卵。仔鱼5～7 d后可平游，7 d内投喂蛋黄、轮虫、小型枝角类等饵料，7 d后投喂配合饲料，配合饲料购自北京三友创美饲料科技股份有限公司，营养成分为粗蛋白质41.8%、粗脂肪19.7%、粗灰分8.4%、水分3.2%，配合饲料中不添加复合益生菌。

1.2.4 样品采集与分析养殖试验结束时，禁食24 h，测量每池试验鱼体质量。每池随机选取雌、雄鱼各5尾，用MS-222(浓度为0.1 g/L)麻醉后进行解剖，称取每尾鱼性腺质量，并统计雌鱼卵粒数。雌鱼性腺于-20 ℃保存，用于脂肪酸组成分析。待仔鱼孵化出膜后，移出孵化网片，并统计初孵仔鱼数量。对5、10、15、20、25、30 d内仔鱼的存活率进行计算。

1.2.5 指标测定与计算饲料与锦鲤性腺的脂肪酸组成参照《GB 5009.168—2016 食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定》进行测定。统计卵粒数采用《GB/T 32758—2016 海水鱼类鱼卵、苗种计数方法》中的容量计数法。

锦鲤的成熟系数及繁殖力相关计算公式为

成熟系数=性腺质量(g)/鱼质量(g)×100%，

绝对繁殖力(粒)=单位质量卵巢的卵粒数(粒/g)×卵巢质量(g)，

体质量相对繁殖力(粒/g)=绝对繁殖力(粒)/雌鱼体质量(g)，

绝对产卵量(粒/ind.)=每尾雌鱼实际产卵数量(粒/ind.)，

相对产卵量(粒/g)=绝对产卵量(粒)/雌鱼体质量(g)，

受精率=受精卵数量(粒)/总卵数量(粒)×100%，

孵化率=初孵仔鱼数量(ind.)/受精卵数量(粒)×100%，

存活率=存活数量(ind.)/总数量(ind.)×100%。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示。采用SPSS 16.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 锦鲤性腺脂肪酸组成的变化

从表1可见：投喂复合益生菌饲料的试验组雌鱼性腺中饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、C18∶1n-9、C18∶2n-6及C18∶3n-3含量均高于对照组，其中B组含量最高，且B组雌鱼性腺中多不饱和脂肪酸总量、EPA、DHA含量显著高于对照组(P<0.05)，而n-6系列多不饱和脂肪酸含量则低于对照组。

2.2 锦鲤亲鱼繁殖力的变化

从表2、表3可见，投喂复合益生菌饲料的试验组及对照组雌、雄鱼的存活率均为100%。从表2可见，各益生菌组雌鱼的性成熟系数、繁殖力、体质量均高于对照组，其中B组最高，B组雌鱼性成熟系数、繁殖力显著高于对照组(P<0.05)，B、D组绝对繁殖力和体质量相对繁殖力均显著高于对照组(P<0.05)。

从表3可见，各益生菌组雄鱼的体质量和性成熟系数均高于对照组，其中B组均最高，仅B组雄鱼体质量显著高于对照组(P<0.05)。

2.3 锦鲤孵化及仔鱼成活情况

从表4可见：雌、雄亲鱼配组后，投喂复合益生菌饲料的试验组产卵量、受精率、孵化率和各时期仔鱼存活率均高于对照组，其中B组最高且显著高于对照组(P<0.05)；随着孵化时间的延长，各组仔鱼存活率整体呈先升高后降低再升高变化趋势，孵化20 d内存活率最低。

3 讨论

3.1 复合益生菌对锦鲤性腺脂肪酸组成的影响

脂类是鱼类性腺和胚胎发育的主要代谢能源，受精卵中的脂类和脂肪酸相对含量在胚胎发育和初孵仔鱼存活期间具有重要作用[21]。研究发现，DHA、EPA对鱼类繁殖具有重要作用[22]。本研究中，投喂含复合益生菌饲料的B组雌鱼性腺中EPA、DHA含量显著高于对照组，说明复合益生菌(枯草芽孢杆菌∶丁酸梭菌∶粪肠球菌=1∶1∶5)可显著增强锦鲤的性腺发育。从B组的益生菌配比来看，粪肠球菌含量高于其他试验组的复配比例，推测粪肠球菌对锦鲤性腺发育过程中EPA、DHA含量的增加具有重要作用，但这一推测还需要进一步的试验证实。本研究还发现，各试验组锦鲤雌鱼性腺脂肪酸中油酸和亚油酸含量与对照组相比有所提高，此结果可参照郭盼等[23]研究不同链长脂肪酸对斑马鱼性腺脂肪酸组成时的观点解释，说明各试验组复合益生菌能够促进锦鲤性腺脂肪酸中油酸和亚油酸的氧化，同时也有研究证明，EPA、DHA的增加可促进组织器官部分脂肪酸的氧化利用[24]。

3.2 复合益生菌对锦鲤亲鱼繁殖力的影响

锦鲤繁殖力的高低对鱼苗产量至关重要。雌性亲鱼绝对繁殖力和相对繁殖力是衡量鱼体繁殖状况的两个重要指标，性成熟系数则是评价亲鱼性腺发育情况的直接指标之一[25]。目前，益生菌在提高畜禽动物繁殖性能方面的研究较多，而在提高水产动物繁殖状况方面的研究尚缺乏。本研究中发现，枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌和粪肠球菌3株菌复合制剂复配饲料可增强锦鲤雌、雄亲鱼繁殖力，各组雌鱼的性成熟系数、绝对繁殖力和体质量相对繁殖力均高于对照组，其中B组(枯草芽孢杆菌∶丁酸梭菌∶粪肠球菌=1∶1∶5)各项指标高于其他组。这可能是由于益生菌通过调节鱼体肠道内微生态平衡，提高免疫力，促进性腺发育，从而提高了鱼体繁殖力。这与益生菌在畜禽方面的研究结果一致。如在日粮中添加复合益生菌可显著提高妊娠母猪的健康度、增强采食量，并可提高仔猪的健康指标[20]，也可显著增加产后14 d母猪饲料消耗量，同时显著减少哺乳期母猪体质量损失[25]。

3.3 复合益生菌对锦鲤孵化和仔鱼存活的影响

绝对怀卵量、相对怀卵量、受精率、孵化率和仔鱼存活率是评价雌鱼繁殖性能的重要指标[26]。本研究中发现，各益生菌组孵化率和各时期仔鱼的存活率均高于对照组，其中B组(枯草芽孢杆菌∶丁酸梭菌∶粪肠球菌=1∶1∶5)、C组(2∶3∶3)各项指标均高于其他组，尤以B组最高。这表明饲料中复合益生菌的添加可提高锦鲤仔鱼的产量与成活率，这可能与亲鱼摄入益生菌影响子代菌群结构，从而改善子代脂代谢，促进子代健康有关。同时，这与Schultz等[27]、关怀等[28]的研究结果相一致。Schultz等[27]研究显示，妊娠期母亲服用益生菌，在胎儿出生后2年内于粪便样本中仍能够检测到益生菌。关怀等[28]研究表明，益生菌干预母亲有利于改善肥胖孕鼠子代菌群紊乱及脂代谢异常，促进子代健康。

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