菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum肉质鲜美、养殖周期短，是中国主要的海产经济贝类之一，广泛分布于中国南北海区。菲律宾蛤仔在实际物流过程中未形成密封的单元化包装，受外界环境的影响，到达消费者环节时品质不受控制，易引起死亡变质，影响其鲜活销售品质。合理的密封包装在确保活贝品质、延长保活期的同时，还可方便流通及促进销售，目前水产品的活品密封包装主要采用充氧的形式，可用于鱼和贝类[1]。物流过程中水产品的鲜度会随着时间延长而下降，因此，应用有效快速的方法评估水产品鲜度变化，预测其剩余货架期显得尤为重要[2]。
水产品鲜度品质可以从感官指标、物理指标、化学指标和微生物指标等方面进行评价，通常采取多种指标相结合的方法进行评价[3]。其中，温度是影响微生物生长最重要的因素，也是导致水产品腐败的重要原因，目前，大多数货架期预测模型均根据温度建立[2]。国内外学者对水产品货架期模型的研究主要集中在冰、鲜水产品货架期的预测，通常采用微生物、生化指标建立基于温度变化的货架期动力学模型，如鲑[4]、鲇[5]、鳕[6]、鲤[7]、带鱼[8]、红鲣[9]和小黄鱼[10]等，除了冷藏鱼类，其他水产品的鲜度综合评价和货架期预测也有相关研究[11-13]。不同水产品品质衰变机理虽然有一定差异，但动力学模型能很好地反映其衰变趋势。目前，应用Arrhenius法预测水产品货架寿命的研究已有大量报道，包括冰鲜带鱼[8]、小黄鱼[10]、冷藏三文鱼片[11]、鲈鱼片[13]、扇贝[14]、牡蛎[15]、即食虾仁[16]、真空油炸脆虾[17]和梭子蟹[18]等水产品，该方法通过测定菌落总数、总挥发性盐基氮(TVB-N)、鲜度指标(K值)、pH值、色度与感官品质等理化及微生物指标，并采用Arrhenius方程建立贮藏时间、贮藏温度的动力学模型进行货架期预测，然而目前该方法主要用于冰鲜和即食水产品的评价，用于活品的研究较少，尤其未见对活品菲律宾蛤仔的相关报道。活贝无水物流过程中品质指标的变化与冰、鲜水产品有一定差异，为此，本研究中，研究了真空、空气、充氧3种密封包装形式，在不同温度下对活品菲律宾蛤仔品质的影响，并建立货架期预测模型，以期为活品蛤仔流通提供数据参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用菲律宾蛤仔(以下简称蛤仔)购自辽宁省大连市长兴岛，个体鲜活饱满，大小均匀，于2018年11月6日采捕后采用编织袋运抵农业农村部北方海水增养殖重点实验室，无水运输时间为3 h，壳长为(40±5)mm，壳宽为(28±3)mm，壳高为(17±2)mm，共100 kg。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 将粗选、清洗的蛤仔在净化与循环水系统中暂养24 h，然后将20枚蛤仔平铺放入包装袋(HDPE材质，长32 cm、宽25 cm)，设置真空、空气、充氧3种不同气体条件及0、5、10、15 ℃ 4种温度条件，充氧包装充入8000 cm3、浓度为99.9%的氧气。不同气体及温度条件下各60袋，每隔24 h取出3袋相同温度及气体条件的样本，样本全部死亡时停止取样。
1.2.2 指标的测定与计算
(1)存活率[19]。将蛤仔放入15 ℃海水中静置20 min，用玻璃棒轻敲其外壳，有闭合趋势则判定为存活，如果长时间不闭合则判定为死亡。
存活率=Ns/Nt×100%。
(1)
其中，Ns、Nt分别为存活个数和总数。
(2)感官评价。参考GB2733—2015食品安全国家标准鲜、冻动物性水产品评定方法。感官评定主要依据口感、色泽、气味(气味正常、无腐败味)及质地(肌肉紧密有弹性和疏松无弹性)综合评定感官分数[14,20]。感官评定标准如表1所示，其中，总分小于12分时，则判定为无法食用[14,20]。感官评定小组由7名经过培训的人员组成，每间隔24 h对蛤肉进行感官评价。
表1 感官评价评分标准
Tab.1 Standard score scale for sensory evaluation
指标index1分 one score2分 two scores3分 three scores4分 four scores5分 five scores色泽tinct淡黄色,外表黏液较混浊淡黄色,外表黏液混浊米白色,外表黏液略混浊白色,外表黏液澄清乳白色,外表黏液澄清、光亮气味odor有较明显腐败味,出现恶臭味有异味,出现轻微腐败味有轻微的异味蛤仔固有的气味变淡蛤仔固有的气味,无任何异味口感taste有明显异味,腥味加重异味加重,出现腥味蛤仔固有味道变淡,有轻微的异味蛤仔固有味道,无鲜味,无异味蛤仔固有的味道,新鲜,无异味质地texture肌肉组织不紧密,松散,弹性完全丧失肌肉组织不紧密,局部松散无弹性肌肉组织不紧密,但不松散稍有弹性肌肉组织完整,纹理清晰,较有弹性肌肉组织致密完整,纹理很清晰,坚实富有弹性
(3)菌落总数、pH值和糖原含量。按照GB4789.2—2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定方法测定。参考GB5009.237—2016食品安全国家标准食品pH值的测定方法。取蛤仔肉，采用糖原测定试剂盒(上海沪震实业有限公司)测定糖原含量[20-21]。
(4)色度。取蛤仔肉用色度仪(4500S)测定L值(明度，反映色泽的亮度)、a值(Hunter标度中的a轴值，正数代表红色，负数代表绿色)和b值(Hunter标度中的b轴值，正数代表黄色，负数代表蓝色)，同时对色泽差异值E进行评价，色泽测定于自然灯光下进行，重复3次，并计算色度差ΔE[20]。计算公式为
(2)
ΔE=E测-E初。
(3)
1.2.3 活品蛤仔货架期模型的预测 在贮藏过程中，活品蛤仔的品质随着时间延长而发生变化，目前，国内外学者对建立水产品货架期预测模型所依据的主要原理为化学动力学和微生物生长动力学，可根据零级及一级反应方程式建立其动力学预测模型。各级反应方程为
零级动力学反应： N=N0-k×t，
(4)
一级动力学反应： N=N0ek×t。
(5)
其中： N0、N分别为初始和贮藏第t天时的品质指标值；k为反应速率常数；t为贮藏时间(d)。
测定活品蛤仔在4个不同贮藏温度(0、5、10、15 ℃)及3种气体条件(真空、空气、充氧)下的存活率、感官评价、菌落总数、pH值、色度差和糖原含量，将得到的菌落总数、pH值、色度差和糖原数据作图，分别利用零级和一级动力学模型方程(4)、(5)进行拟合，确定其反应级数。
Arrhenius 方程：该方程是描述化学基元反应的经典模型，以温度为自变量，阐明了化学反应速率k与绝对温度T的关系，该方程可以有效地反映食品的腐败变质速率，其计算公式为
k=k0exp[-Ea/(R×T)]。
(6)
其中： k为速率常数；k0为指前因子(又称频率因子)；Ea为活化能(J/mol)；R为气体常数，即8.314 J/(mol·k)；T为绝对温度(K)。
结合零级或一级动力学反应模型和Arrhenius方程，得到活品蛤仔的货架期(shelf-life, SL)预测模型如下：
零级反应货架期预测模型为
SL0=|N-N0|/[k0exp(-Ea/(T×R))]；
(7)
一级反应货架期预测模型为
SL1=|lnN-lnN0|/[k0exp(-Ea/(T×R))]。
(8)
其中: SL为预测货架期(d)；N0为品质参数初始值；N为实时品质因子；k0为指前(频率)因子，即活化能为零时的反应速率。
2 结果与分析
2.1 蛤仔存活率
从图1可见：不同密封包装条件下活品蛤仔存活率随着时间延长呈明显下降趋势，但3种包装方式有所差异，存活率依次为充氧组>空气组>真空组；0、5、10、15 ℃的真空包装分别在贮藏4、3、2、2 d时蛤仔出现死亡，7、6、4、3 d时全部死亡；0、5、10、15 ℃的充氧包装分别在11、6、4、3 d时出现死亡，14、11、9、5 d时全部死亡；0、5、10、15 ℃的空气包装分别在5、4、3、3 d时出现死亡，8、7、5、4 d时全部死亡。温度和包装方式两个因素在蛤仔无水保活过程中均有较大影响，0 ℃接近蛤仔的生态冰温点有利于其存活，这与对青蛤[22]、紫彩血蛤[23]、魁蚶[24]等的研究结果一致。包装内纯氧条件保证了活贝正常进行呼吸作用的同时抑制了厌氧菌的生长，而真空包装迫使包装内的蛤仔始终紧闭双壳，无法张口活动，只能靠体液短时间维持生命活动[25]。可见，0 ℃充氧包装蛤仔存活率最高，高温真空包装存活率最低。
图1 不同温度及包装方式下菲律宾蛤仔存活率变化
Fig.1 Survival rate of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
2.2 感官品质
从图2可见：不同密封包装条件下活品蛤仔的感官品质随贮藏时间延长呈明显下降趋势；温度升高，感官评分降低速率加快，可食用期(货架期)终点的时间越短，接近生态冰温的低温条件有利于活贝的品质保持。感官评价能最直接地反映活贝的食用情况，可作为货架期重要的评判标准。对冰鲜带鱼[8]、小黄鱼[10]、冷藏三文鱼片[11]、鲈鱼片[13]、扇贝[14]、牡蛎[15]、即食虾仁[16]、真空油炸脆虾[17]和梭子蟹[18]等的研究中均采用感官评价作为货架期间及终点品质指标的分析。本研究中，以感官评价12分作为货架期终点指标，得到活品蛤仔充氧包装在0、5、10、15 ℃下的货架期分别为10、7、6、3 d，真空包装在0、5、10、15 ℃下的货架期分别为5、3、2、1 d，空气包装在0、5、10、15 ℃下的货架期分别为6、4、3、2 d。可见，0 ℃充氧包装货架期最长，高温真空包装最短。
图2 不同温度及包装方式的菲律宾蛤仔感官评价变化
Fig.2 Sensory evaluation of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
2.3 菌落总数
从图3可见：不同密封包装条件下活品蛤仔菌落总数随贮藏时间延长呈显著上升趋势且随温度变化明显；较低温度(0、5 ℃)条件下蛤仔的菌落总数明显低于较高温度(10、15 ℃)；相同温度条件下，空气包装内菌落总数增长速率快于真空和充氧包装，这是由于在包装内空气的作用下，厌氧性菌落和好氧性菌落可以同时生长，从而导致其增长速率最快，菌落数量也最多 [26-27]。密封包装的蛤仔菌落总数上升的速率与温度密切相关，低温条件有效抑制了菌落生长，菌落总数在一定程度上影响了密封包装蛤仔的存活率、货架期及新鲜度。可见，存活期内高温空气包装菌落总数最高。
图3 不同温度及包装方式的菲律宾蛤仔菌落总数变化
Fig.3 Total bacterial count of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
2.4 pH值
从图4可见，不同密封包装条件下活品蛤仔的pH值随时间延长呈上升趋势，其中，真空组与空气组pH值上升快于充氧组，10、15 ℃较高温度下蛤仔pH值上升速率快于0、5 ℃较低温度条件。密封包装条件下活品蛤仔生命力下降，逐渐出现死亡，在自溶酶的作用下被分解，导致包装内pH值上升。但在冰鲜水产品预测过程中，pH值往往先升高后降低，pH值无法进行货架期的预测[12]，而本研究中密封包装的活品蛤仔pH值上升规律明显。可见，0 ℃充氧包装pH上升较缓。
图4 不同温度及包装方式的菲律宾蛤仔pH值变化
Fig.4 Changes in pH value of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
2.5 色度
从图5可见，不同密封包装条件下活品蛤仔色度差ΔE随时间延长均呈明显加深的趋势。较低温度条件的色泽变化低于同一时间较高温度条件，且不同包装方式对失色度差的影响不同，空气包装内菌落的生长加上活贝自身体液的流失，导致包装内活贝色泽变化最为明显；而真空包装能有效抑制贝类内源酶活性和微生物的生长，包装内蛤仔体液流失也最少，色度差最小。对冰鲜水产研究发现，小黄鱼色度随温度和时间变化明显[10]，在货架期内三文鱼[28]和即时虾仁[16]的色度变化并不明显。而本研究中密封包装条件下的活品蛤仔由于体液的流失，导致贝肉中水分减少，从而使色度加深变化明显。可见，存活期内0 ℃真空包装色度差最小。
图5 不同温度及包装方式的菲律宾蛤仔色度差变化
Fig.5 Chrominance of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
2.6 糖原含量
从图6可见，不同密封包装条件下活品蛤仔糖原含量随贮藏时间延长呈下降趋势，真空条件下糖原含量下降最为缓慢。真空包装内的蛤仔无法正常进行呼吸，而呼吸作用是糖原消耗的主要原因，从而抑制了糖原的消耗[29]。在冰鲜水产品中无法采用糖原进行货架期预测，而随着蛤仔存活时间延长，蛤仔生命活力下降，糖原下降速率总体降低[29〗。温度也影响糖原下降的速率，包装内的蛤仔高温状态下生命代谢旺盛，糖原消耗速率加快，这与对其他活品贝类研究结果一致[30-31]，糖原随时间下降明显并随温度升高下降趋势不同，这表明糖原是活品区别于冰鲜水产品货架期预测的重要指标。可见，0 ℃真空包装糖原含量下降最为缓慢。
图6 不同温度及包装方式的菲律宾蛤仔糖原含量变化
Fig.6 Glycogen content of Manila clam Ruditapes philippinarum in different packaging at different temperatures
3 货架期预测模型的建立
3.1 理化指标与感官品质的相关性分析
感官评价确定了不同温度及包装条件下活品蛤仔货架期的时间，对蛤仔理化指标与感官评分进行Pearson相关系数分析(表2)显示，相关系数范围为0.800～1.000，为极强相关，表明蛤仔的感官评分与其他理化指标存在密切相关性，因此，可由感官评价货架期作为密封包装的蛤仔货架期终点时品质指标分析依据。
表2 菲律宾蛤仔理化指标与感官评分进行Pearson相关系数分析
Tab.2 Pearson correlation analysis between sensory evaluation and physiological and biochemical indices of Manila clam Ruditapes philippinarum
气体条件gas condition贮藏温度/℃temperaturepH菌落总数total bacterial count糖原glycogen色度差(ΔE)chrominance失重率weight loss rate充氧 oxgen0-0.909∗∗-0.976∗∗0.926∗∗-0.930∗∗-0.889∗5-0.886∗-0.976∗∗0.967∗∗-0.933∗∗-0.896∗10-0.908∗-0.982∗∗0.958∗∗-0.973∗∗-0.950∗∗15-0.805∗-0.946∗∗0.956∗∗-0.959∗∗-0.946∗∗真空 vacuum0-0.939∗∗-0.875∗0.966∗∗-0.938∗∗-0.943∗∗5-0.929∗∗-0.940∗∗0.994∗∗-0.969∗∗-0.910∗10-0.959∗∗-0.924∗∗0.932∗∗-0.963∗∗-0.913∗15-0.908∗-0.988∗∗0.980∗∗-0.907∗-0.987∗∗空气air0-0.844∗-0.951∗∗0.964∗∗-0949∗∗-0.941∗∗5-0.917∗∗-0.974∗∗0.938∗∗-0.925∗∗-0.925∗∗10-0.879∗-0.980∗∗0.969∗∗-0.923∗∗-0.882∗15-0.889∗-0.802∗0.983∗∗-0.960∗∗-0.814∗
注： *表示显著相关(P<0.05), **表示极显著相关(P<0.01)
Note： * means significant correlations(P<0.05), **means very significant correlations(P<0.01)
3.2 活体蛤仔品质指标货架期预测模型建立
分别对不同气体包装条件下蛤仔菌落总数、pH、色度差和糖原在0、5、10、15 ℃进行零级和一级反应拟合，即N和ln N与时间的关系进行线性回归分析。根据回归系数R2≥0.92和∑R2来比较不同级数品质函数所对应的拟合精度，确定品质指标反应级数，筛选出拟合精度较高的拟合方程，结合Arrhenius方程预测活品蛤仔在不同温度及气体条件下的货架期。对公式(6)取对数得到:
lnk=-Ea/(R×T)+lnk0。
(9)
由lnk对1/T作图得到线性方程，分析拟合精度，求出活化能和指前因子(表3)。并将值代入公式(7)和(8)得出货架期预测方程。
表3 菲律宾蛤仔各指标的回归方程、活化能(Ea)和前因子(k0)
Tab.3 Regression equation, activation energy (Ea) and prefactor (k0) of each indicator in Manila clam Ruditapes philippinarum by oxygenated packaging methods
气体条件 gas condition级数 progression理化指标 indicator回归方程 regression R2k0Ea充氧 oxygen0pHy=-2664.1x+6.37350.9251.71×10429901.081菌落总数total bacterial county=-4111.7x+11.6620.9471.16×10534186.320糖原glycogeny=-2380.8x+8.32630.9352.545×10318712.390色度差chrominance y=-7541.5x+26.0910.9672.14×101162703.05真空 vacuum0pHy=-5947.1x+18.7490.9792.26×10745387.480菌落总数total bacterial county=-9337.5x+31.4730.9244.66×101377635.711糖原glycogeny=-5102x+17.1990.9021.61×10741066.480色度差chrominance y=-5540.3x+18.8440.9671.53×10846064.27空气 air1菌落总数total bacterial county=-3745.6x+11.3740.9058.71×10431142.420糖原glycogeny=-3490.4x+12.740.9603.41×10529020.58
对不同包装方式的活品蛤仔，当确定了贮藏温度、初始鲜度品质值及终点鲜度品质指标值，根据所得到的货架期预测模型，即可获得在确定的贮藏温度条件下的贮藏时间，即货架期。此外，也可以根据贮藏温度、初始鲜度品质值及贮藏时间，获得在确定的贮藏温度和时间条件下的鲜度品质指标，将得出的k0及Ea代入公式(7)和(8)，得出货架期预测模型(表4)。
表4 菲律宾蛤仔货架期预测模型
Tab.4 Shelf life prediction models of live Manila clam Ruditapes philippinarum
理化指标 indicator充氧包装oxygen packaging真空包装vacuum packaging空气包装air packagingpH值pH valueSL11=N-N01.71×104exp-29901.08T×R()SL21=N-N02.26×107exp-45387.48T×R()—菌落总数total bacterial countSL12=lnN-lnN01.16×105exp-34186.32T×R()SL22=N-N04.66×1013exp-77635.71T×R()SL32=lnN-lnN08.71×104exp-31142.42T×R()糖原glycogenSL13=N-N02.545×103exp-18712.39T×R()SL23=lnN-lnN01.61×107exp-41066.48T×R()SL33=N-N03.41×105exp-29020.58T×R()色度差(ΔE)chrominance SL14=N-N02.14×1011exp-627103.05T×R()SL24=N-N01.53×108exp-46064.27T×R()—
3.3 活品蛤仔货架期预测模型的验证
通过对密封包装的蛤仔货架期实测值与采用货架期预测模型计算值比较，进行货架期预测模型的验证。根据感官评价12分作为可接受的最低限制，确定了货架期时间。根据中国贝类投放市场的微生物卫生标准要求[32]，参照并分析货架期终点值时品质指标值，其中，不同包装条件的pH值、菌落总数和色度差指标货架期终点值，采用求平均值确定，但本试验中发现，充氧包装的蛤仔由于保活时间的延长，糖原品质指标在不同温度下达到感官终点值时含量不同，且随温度变化呈线性关系，线性方程为y=0.3038T+1.819(R2= 0.96，T=0～15 ℃)，同时蛤仔糖原品质终点无限定值，参照青花菜货架期预测的方法[33]代入公式(8)，作为以糖原特征指标预测的动态终点货架期。表5为不同气体条件下活品蛤仔品质指标的货架期终点值。
表5 菲律宾蛤仔品质指标货架期终点值
Tab.5 Endpoint value of quality indices for shelf-life of live Manila clam sealed package
气体条件gas conditionpHvalue菌落总数lg(CFU/g)total bacterial count糖原glycogen色度差(ΔE )chrominance 充氧包装 oxygen packaging6.894.512.16、3.03、4.51、6.722.58真空包装 vacuum packaging6.773.808.230.95空气包装 air packaging—5.504.18—
表6为货架期预测模型验证结果，与感官评价的货架期实测值比较，预测值误差在20%以内，证明两者预测的货架期时间有一定一致性。15 ℃温度条件的活品蛤仔贮藏时间较短，货架期误差较大，因此，货架期模型无法采用；充氧包装的蛤仔pH值、菌落总数、糖原指标可在0～10 ℃预测货架期，而色度差货架期模型只适用0～5 ℃的货架期预测；真空包装的蛤仔pH值、糖原指标可在0～5 ℃预测货架期，而色度差货架期模型可适用0～10 ℃的货架期时间预测；空气包装的蛤仔菌落总数、糖原指标可在0～10 ℃预测货架期。
表6 密封包装菲律宾蛤仔货架期的预测值和实测值
Tab.6 Predicted and measured shelf-lives of live Manila clam sealed package
气体条件gascondition理化指标indicator温度/℃temperature实测值/dshelf life measured value预测值/dshelf life predicted value相对误差/%relative error充氧oxgenpH色度差ΔEchrominance菌落总数 total bacterialcount糖原glycogen0108.1918.08576.871.811065.803.2901011.9619.60577.283.930108.8111.93576.724.041065.1713.790108.4115.90576.802.861066.6210.33真空vacuumpH色度差ΔEchrominance糖原glycogen055.8116.20534.5012.50054.0419.20532.806.521021.971.39055.418.20533.4411.47空气air菌落总数 total bacterialcount糖原glycogen065.1514.17544.020.501033.165.33065.3610.67544.266.501033.4113.67
4 结论
(1)0 ℃充氧包装货架期最长，高温真空包装最差；存活期内高温空气包装菌落总数最高；0 ℃充氧包装pH值上升较缓；存活期内0 ℃真空包装色度差最小，糖原含量下降最为缓慢。综合各项指标在贮藏期间的变化结果，活品菲律宾蛤仔采用充氧包装更有利于其存活及品质的稳定。
(2)通过动力学反应结合Arrhenius方程推导了活品蛤仔pH值、菌落总数、糖原和色度差的货架期预测模型，充氧包装的pH值、色度差、菌落总数、糖原含量，真空包装的pH值、色度差、糖原指标，空气包装的菌落总数、糖原指标建立的货架期预测模型在0～10 ℃范围内求得的预测值与实测值相对误差小于20%，为活贝无水载运密封包装及货架期预测提供了理论方法。
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