循环水养殖系统中不同滤料生物挂膜水处理效果及微生物群落分析

近年来，中国工厂化循环水养殖发展迅猛，其中，生物滤料是循环水水处理设施的重要组成部分[1-2]。生物滤料按形态分可分为颗粒滤料和纤维滤料[3]；按材质可分为天然生物滤料、有机高分子滤料、无机滤料和纳米材料等[4-5]；按密度可分为浮性滤料、沉性滤料和悬浮性滤料等[6-7]。滤料性质是影响生物挂膜、水处理效果和系统微生物多样性的重要原因。研究表明，高通量测序技术的发展可更深入分析滤料系统对微生物的多样性影响[8-9]。张海耿等[10]研究发现，在滤器正常运行时，上层区域的优势细菌主要有厌氧绳菌科、硝化螺旋菌属、暖绳菌科、黄杆菌科和红杆菌科，底层区域的优势细菌主要有微丝菌属、硝化螺旋菌属、Defluviimonas属、Muricauda属等；陈重军等[11]研究表明，厌氧氨氧化反应器中脱氮微生物多样性较为丰富，变形菌门Proteobacteria占11.66%～20.28%，浮霉菌门Planctomycetes占2.18%～7.94%，硝化螺旋菌门Nitrospirae占0.19%～6.30%，可见各个运行条件下系统中的微生物多样性存在差异。聚苯乙烯泡沫滤珠(EPS)、聚乙烯环(PE)具有质量轻、比表面积大、吸附能力强、不易破碎的特点[12-13]，电气石(Tourmaline)具有吸附水中杂质、降低COD、调节水pH和氧化还原电位的特点[14]。目前，这3种滤料均已应用于造纸厂污水、化工厂排放水或水产养殖循环水等水处理中。本研究中，采用电气石球、聚乙烯环、聚苯乙烯泡沫滤珠3种滤料开展了模拟水产养殖尾水挂膜和水处理效果的研究，并结合挂膜后水体中微生物多样性的变化，研究了不同滤料系统中的微生物功能特点，旨在为工厂化水产养殖的水处理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

生物滤料设聚乙烯环(PE)、聚苯乙烯泡沫滤珠(EPS)和电气石球组(T)，每组用PVC桶组装成各3套简易的循环水系统，上部为40 L的滤料桶(直径25 cm，高81.6 cm)，其中装有20 L滤料，下部为蓄水桶(直径100 cm，高70 cm)，盛放水体400 L，通过水泵(流量2600 L/h)实现下进水上出水循环，其中滤料与水体体积的比为1∶20。滤料图和水处理装置如图1、图2所示。

1.2 方法

1.2.1 挂膜试验及水处理试验结合日常大黄鱼及石斑鱼的循环水系统水质检测情况，以监测到的水质指标上限配制养殖废水。在400 L洁净海水中各投放硫酸铵4.62 g、亚硝酸钠9.662 g、磷酸二氢钾0.862 g、硝酸钾1.2 g、葡萄糖17.75 g，使得水体指标初始值总氨氮

约为2.5 mg/L，亚硝酸盐

约为5 mg/L，磷酸盐

约为0.5 mg/L，硝酸盐

约为0.5 mg/L。总有机碳(TOC)为20 mg/L自然挂膜，每4 d设为一个挂膜水循环，换水时间为8:00，换水前(7:50)从各循环水装置中取水样，测定水体中氨氮和亚硝酸盐含量，总挂膜时间为48 d。挂膜结束后，3组系统同时换新的养殖废水，每6 h从各平行系统中取水样，分别采用次溴酸盐氧化法(GB17378.4—2007)、萘乙二胺分光光度法(GB17378.4—2007)法测定氨氮和亚硝酸盐含量。

1.2.2 挂膜滤料电镜观察取挂膜好的滤料进行叔丁醇脱水固定、真空冷冻机干燥，喷金后采用场发射扫描电子显微镜(日本Hitachi s4800型)观察PE的侧切面及EPS、电气石球表面。

1.2.3 挂膜成功后水体和滤料表面微生物多样性检测

(1)水中微生物取样。挂膜成功后，从每个桶各取水样2 L，经0.22 μm滤膜过滤，每组混合为1个样本，样本分别记为聚乙烯环水体(PEw)、泡沫滤珠水体(EPSw)和电气石球水体(Tw)。

(2)滤料表面微生物取样。挂膜成功后，从每个桶取约50 mL待检测生物膜填料，用PBS缓冲液(0.1 mol/L)清洗3遍去除生物膜表面附着杂质，再将填料置于50 mL离心管中，加入25 mL PBS缓冲液(0.1 mol/L)和适量550 ℃下灼烧2 h后的细砂(粒径<420 μm)，盖好盖后将离心管在涡旋振荡器中旋转振荡5 min(务必使细砂与填料达到充分接触的状态)，此过程中细砂与填料表面的碰撞与摩擦可以刮下填料细微结构部分的生物膜，略沉淀，用0.22 μm滤膜过滤并取出填料，每组混合为1个样本。样本名称分别记为聚乙烯环(PE)、泡沫滤珠(EPS)、电气石球(T)。

(3)DNA提取及扩增测序分析。采用DNeasy PowerSoil Kit(50) (MoBio)提取DNA，并采用引物进行16S rDNA V4高可变区的PCR扩增。本试验中采用带GC夹细菌通用引物341 F(5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′)和534 R(5′ ATTACCGCGGCTGCTGG 3′)进行细菌基因组DNA的扩增，GC-clamp序列为CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGGG，扩增片段为细菌16S rDNA的V3～V4可变区。PCR反应体系(50 μL)为：10×LAPCR buffer(mg2+plus)5 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，50 ng/μL模板DNA 2.0 μL，灭菌去离子水36.5 μL。采用降落PCR模式 touchdown-PCR，反应程序为：94 ℃下预变性5 min，94 ℃下循环变性30 s，65 ℃下退火复性30 s，72 ℃下延伸90 s，每个退火温度降0.5 ℃，共进行20个循环，在此退火温度下再进行15个循环，最终在72 ℃下延伸5 min，用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

(4)测序数据。由 Illumina Miseq 测序先获得原始双端测序数据，再经过去杂、拼接、嵌合体序列处理后获得较为优质的序列 valid tags，最后进行OTU分类、系统发育树、Alpha 及 Beta 多样性等分析。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0软件对试验数据进行方差分析和差异显著性检验，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 不同滤料组的挂膜情况

从图3可见：在48 d的挂膜过程中，3个滤料组的氨氮浓度呈先升高后降低的趋势；EPS和PE组在16 d时氨氮浓度开始下降，T组在20 d时氨氮浓度开始下降，3组滤料氨氮浓度下降速率依次为T组>EPS组>PE组，且T组氨氮消除时间比EPS组早4 d，比PE组早8 d。

从图4可见：在12 d内，各组亚硝酸盐浓度维持稳定；在16～24 d内，EPS组和PE组的亚硝酸盐浓度呈逐渐上升的趋势，在24 d后开始下降；而T组在16～20 d内逐渐上升，20 d后开始下降；待亚硝酸盐浓度下降至最低时，T组所需的时间比EPS组早4 d，比PE组早8 d。

2.2 挂膜后滤料的电镜观察

在系统运行48 d后，随机取PE、EPS及T组的生物填料进行电镜扫描(图5)，结果显示：PE在2万倍显微镜下观察，表面有球菌和杆菌附着；EPS在3万倍显微镜下观察，表面有大量球菌；电气石球在1万倍显微镜下观察，表面有大量球菌和杆状细菌。可见，3种材料均实现了生物挂膜。

2.3 不同滤料组的水处理能力

2.3.1 不同滤料组的氨氮去除能力从表1可见：3组滤料中氨氮去除率在前6 h略有降低，在6～12 h时，氨氮有所升高，在12 h后，氨氮去除率开始下降；在18 h时EPS组氨氮的去除率显著高于其他两组(P<0.05)；T组在30 h时氨氮去除率达90.80%，PE组在42 h时氨氮去除率达90.75%，EPS组在54 h时氨氮去除率达92.23%。可见，T组的去除效率高于PE组和EPS组；在54～66 h时，T组、PE组的氨氮去除率显著高于EPS、T组(P<0.05)，84～96 h时，各组间的氨氮去除率均无显著性差异(P>0.05)。

2.3.2 不同滤料组的亚硝酸盐去除能力从表2可见：3组滤料中亚硝酸盐去除率随时间延长呈现增长趋势，并在48 h后趋于平衡；在48 h内，T组的亚硝酸盐去除率高于PE组(除6 h外)，而PE组又高于EPS组；在42 h时，T组的亚硝酸盐去除率为99.39%，显著高于PE组和EPS组(P<0.05)；在48～96 h后，T组的亚硝酸盐去除率高于其他两组(P>0.05)，且均维持在99.18%以上。

2.4 不同滤料组挂膜成熟后水体和滤料表面微生物多样性分析

2.4.1 不同滤料组细菌丰度及多样性分析从表3可见：3组循环系统水体中和滤料表面的微生物原始序列和有效序列差异不大，通过比较3组样品的Chao指数、Shannon 指数、Simpson指数发现，PE组水体中微生物丰富度和群落多样性均高于其他两组，EPS组滤料表面的微生物丰富度高于其他两组，而PE组滤料表面的微生物群落多样性则高于其他两组。

2.4.2 样本的Alpha多样性指数分析和物种间相似性分析从Rank Abundance曲线可以看出样品所含物种的丰富程度和均匀程度，曲线在横轴上的长度越宽表示物种组成越丰富，而在纵轴上跨度越小、曲线越平坦表示物种组成均匀程度越高。从图6可见，水体中PEw的微生物物种组成相比EPSw和Tw较为丰富和均匀，而滤料EPS表面的微生物物种组成相比PE和T滤料较为丰富和均匀。根据OTU注释结果，绘制3个样本的微生物物种间相似性的双层聚类图(Heatmap)，包括样本间聚类关系树和物种OTU丰度相似性树。从图7可以看出，无论水体中还是滤料表面的微生物组成均为EPS组和T组的相似性较高。

2.4.3 3组滤料运行系统水体细菌在门、属分类层面的分布规律 3组循环水处理中水体和滤料表面微生物在门分类层面的分布规律如表4所示，无论水中还是滤料表面，PE组的细菌群落结构多样性较EPS组和T组更为丰富，且丰富度排列前5的细菌门类大致相同，分别为变形菌门、厚壁菌门、

拟杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门，各组中细菌丰富度排列顺序和种类略有差异。PEw按照菌类丰富度排列前5的分别为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门；EPSw中分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、TM6、放线菌门；Tw中分别为变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、Gracilibacteria、硝化螺旋菌门。其中，水体中EPSw和Tw的变形菌门占比均高于PEw，而厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和硝化螺旋菌门占比相较PEw则少；水体中PEw的微生物中存在厚壁菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门和Cloacimonetes，而EPSw、Tw中则未检测到。滤料中，PE中按照菌类丰富度排列前5的分别为厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门；EPS中分别为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门、放线菌门；T中分别为变形菌门、硝化螺旋菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门。其中，PE中厚壁菌门、放线菌门占比较其他两组高；T中硝化螺旋菌门占比高于EPS和PE；EPS、T中变形菌门远高于PE。

从表5可见：水体中细菌丰富度属类差异也较大，其中，PEw中按照丰富度排列前5的分别为远洋杆菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属、油螺旋菌属、OM43_clade；EPSw中分别为远洋杆菌属、OM43_clade、油螺旋菌属、NS5_marine_group、醋杆菌属；Tw中分别为远洋杆菌属、油螺旋菌属、OM43_clade、中温黄杆菌属和贝塔变形菌属。

从表6可见：滤料中，PE表面生物膜按照丰富度排列前5的分别为Symbiobacterium、Mobilitalea、尿素芽孢杆菌属、瘤胃梭菌属、拟杆菌属；EPS表面排列前5的分别为贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属、硝化螺旋菌属、Owenweeksia、拟杆菌属；T表面排列前5的分别为贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属、硝化螺旋菌属、拟杆菌属、粪杆菌属。

3 讨论

3.1 不同滤料对挂膜和水处理效果的影响

生物滤池是循环水养殖系统的核心，对其的研究主要包括生物滤料的选择[15]、培养[16]、运行条件[17-18]及环境因子[19]等技术环节。本研究中就滤料的选择进行了研究，结果表明，在48 d的挂膜期间，电气石球组氨氮和亚硝酸盐消除时间比聚苯乙烯泡沫滤珠组早4 d，比聚乙烯环组早8 d，可见电气石球的挂膜速率较聚乙烯环和聚苯乙烯泡沫滤珠快，这可能是因为电气石球表面的孔隙、孔洞等有利于生物的附着、固定，且对附着物也有屏障保护作用，水力剪切冲刷作用较少，有利于微生物代谢过程中的氧气和营养物质的传质过程。李义菲等[20]研究表明，电气石能够提高氮的去除率，且表现出较好的耐负荷冲击能力。韩雅红等[21]研究表明，电气石颗粒能够缩短序批式反应器(SBR)的启动时间，并可快速恢复反硝化菌、硝化菌、PAOs 及 DPAOs代谢能力。

此外，本研究中还发现，水处理试验48 h内，电气石球组的氨氮、亚硝酸盐去除效率高于聚乙烯环组，而聚乙烯环组又高于聚苯乙烯泡沫滤珠组，这可能与滤料本身的材质特性有关。Tan等[22]研究表明，添加了电气石的序批式反应器SBR1生物群落相较于未添加电气石的SBR2更加稳定，且随着氮加载率的升高，SBR1的氨氮去除率和总氮去除率高于SBR2。另有研究表明，电气石球能调节初始pH值为3～10的不同盐度的海水趋向弱碱性，催化降解有机物，使蒸馏水核磁共振半高幅宽变窄，降低了水分子缔合度，具有促进细菌、细胞生长和代谢的功能[23-24]。可见，在水处理时间和生物膜稳定性上，电气石的性能均优于有机高分子材料(PE、EPS)，这使得电气石球广泛应用于水产养殖水处理工程将成为可能。

3.2 不同滤料对系统中微生物多样性的影响

目前，已有众多学者围绕生物滤池中微生物菌群的组成开展了研究[25-26]，旨在了解各个运行条件下的菌群组成及变化规律。本研究结果表明，在3组系统中，无论水体还是滤料表面均为聚乙烯环组微生物群落多样性高于其他两组，这说明不同滤料可能因为材质、耐冲刷能力、水力特性等性质差异造成水环境中微生物菌群的不一致[27]。而3组系统的水体和滤料表面丰富度排列前5的细菌门类大致相同，丰富度较高的分别为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和硝化螺旋菌门，这与黄志涛等[9]的研究结果一致，变形菌门和硝化螺旋菌门均具有重要的脱氮功能。电气石球组水体中变形杆菌门明显高于聚乙烯环组，而滤料中变形杆菌门和硝化螺旋菌门明显高于聚乙烯环组和聚苯乙烯泡沫滤珠组，这可能是造成3组系统均具备优异水处理能力且电气石球组水处理效果较其他两组更佳的原因。另在本研究的水处理效果试验过程中，3组滤料系统的氨氮去除率在72 h后均能达到98%以上，亚硝酸盐的去除率在54 h后均能达到99%以上，水处理效果皆显著，且在48 h内，电气石球组的氨氮、亚硝酸盐去除效率均高于其他两组。在微生物多样性分析结果中，3种滤料表面的亚硝化单胞菌属和硝化螺旋菌属占比依次为电气石>聚苯乙烯泡沫滤珠>聚乙烯，与水处理效果相符，这表明海水循环水养殖系统水处理中，细菌Nitrosomonas和Nitrospira起主要的硝化作用[28-29]，而电气石可降低亚硝酸盐氧化菌的相对丰度，提高污水系统中氮的去除率[30]。

此外本研究中还发现，水体中和滤料表面中的优势菌属在3组中各不相同，聚乙烯环组水体拟杆菌属、乳酸杆菌属、粪便杆菌属、亚硝化单胞菌属占比均高于其他两组，而滤料中聚乙烯环组贝塔变形菌属、亚硝化单胞菌属均未被检测到，硝化螺旋菌属也明显低于聚苯乙烯泡沫滤珠组和电气石球组，推测聚乙烯环组水处理优势菌主要集中的水体中，而聚苯乙烯泡沫滤珠组和电气石球组水处理优势菌主要集中在滤料表面，更深入和科学的研究还有待继续。

4 结论

(1)不同的滤料对生物挂膜和水处理效果均有显著的影响。在本试验中，电气石球组的挂膜时间短于聚苯乙烯泡沫滤珠组，而聚苯乙烯泡沫滤珠组挂膜时间又短于聚乙烯环。

(2)在水处理效果试验中，48 h内，氨氮、亚硝酸盐去除效率依次为电气石球>聚乙烯环>聚苯乙烯泡沫滤珠。

(3)微生物多样性分析显示，电气石球组的水体中变形杆菌门明显高于聚乙烯环水体，滤料中变形杆菌门和硝化螺旋菌门显著高于聚乙烯环和聚苯乙烯泡沫滤珠。

(4)生物滤料的处理效果一般综合其生物膜的挂膜时间长短、水处理效果及滤料上生物膜生长的优劣等指标进行评价。由此可见，电气石球作为滤料的处理效果明显优于聚乙烯环和聚苯乙烯泡沫滤珠。

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