基于地标点法的4种鲹科鱼类矢耳石形态分类

耳石形态学[1-3]是通过对耳石形态的大小和形状的定量分析，进而研究鱼类生物学特性。耳石形态学应用广泛，如用于鱼种识别[4-6]、摄食习性[7]和栖息环境[8-9]等。耳石形态学的研究方法主要有传统形态测量法和几何形态测量法。传统形态测量法主要是分析耳石形态的度量特征[10]，用度量信息来了解耳石形态的变化，但耳石形态的变化差异往往由形状变化所致，故用传统形态测量法并不能很好地解释耳石形状信息的变化规律。几何形态测量法摒弃了数据的不同源性和不可重复性[11]，能很好地提取和分析耳石形状信息。几何形态测量法包括椭圆傅立叶分析法和地标点法等，椭圆傅立叶分析法又称轮廓法，是通过分析耳石形态轮廓并对耳石形态轮廓进行重建[11-12]，地标点法是对耳石形态选取有显著特征的点并重构形态，可以取得较好的研究效果[11]。地标点法相对于椭圆傅立叶分析法具有同源性、易采集数据和易分析等优点[13]。

近年来，国内对耳石形态学的研究主要集中在传统形态测量法[10]，而几何形态测量法的应用中以椭圆傅立叶分析法为主[14]，地标点法的研究应用较少。侯刚等[15-16]运用地标点法分别对4种白姑鱼属Pennahia和4种金线鱼属Nemipterus矢耳石进行了分类研究；姜涛等[17]基于地标法认为珠江口和九龙江口的凤鲚Coilia mystus和七丝鲚C.grayii群体为不同地理群体；彭艳等[18]研究认为，嘉陵江不同江段蛇鮈Saurogobio dabryi耳石分为两种类型且其形态存在显著差异。相对于传统形态测量法及椭圆傅立叶分析法，在耳石形态差异较大(轮廓不规则及突起较多等)的情况下[16]，以及利用耳石整体形态和听沟形态相结合分析过程中[15]，地标点法对分析耳石形态信息具有很好的优越性。国内应用地标点法对鱼类耳石形态的种类鉴定较少，为此，本研究中以4种不同种的鲹科鱼类[19](竹筴鱼Trachurus japonicus、短吻丝鲹Alectis ciliaris、脂眼凹肩鲹Selar crumenophthalmus、高体若鲹Caranx equula)矢耳石为例，利用地标点法研究其矢耳石形态差异，并分析地标点法对耳石形态信息的分类效果，旨在为丰富鱼类耳石形态鉴定方法的多样性和完善耳石形态学理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验鱼于2014年3月采自中国南海东沙群岛海域，其中短吻丝鲹采自(21°07′N, 115°29′E)海域，其他3种鱼均采自(20°47′N, 115°07′E)海域，4种鲹科鱼类样品共108尾(表1)。试验样品在基础生物学实验室解冻后，通过皮尺测量和电子秤测量试验样品，测量叉长精确到1 mm，称量体质量精确到1 g，并用镊子摘取试验样品的左右耳石，对摘取后的耳石样品除去包膜和黏液并清洗，再把耳石样品放入盛有95%乙醇的离心管中保存待用。矢耳石形态术语参考相关研究[10, 20-21]。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集统一选取左耳石作为研究对象，从保存的离心管中取出耳石待酒精挥发后，耳石形态摆放原则以水平方向平行听沟(裂沟)中部[4]进行摆放，使用体视显微镜(OLYMPUS SZ61)对耳石形态进行拍摄并采集图像(图1)，使用生物图像处理软件 Image-Pro Plus 6.0测量耳石形态学指标，精确到0.01 mm。

1.2.2 耳石形态地标点在生物学的应用中，地标点的选取有3种类型[22]，参考国内相关研究[16]并结合本研究中的耳石形态特性，利用tpsDig 2软件在采集完成的耳石形态二维图像上建立8个地标点(图1)，所有样品的地标点数和顺序保持一致，并对8个地标点进行分类(表2)，建立相应的坐标值数据文件。

1.3 数据处理

使用tpsSmall软件对所获得的地标点进行有效性检验。利用tpsRelw软件求出耳石形态的平均形(mean shape)，然后进行相对扭曲(relative warps)，同时得出分析报告和求出相对扭曲得分，最后进行相对扭曲主成分分析(PCA)和利用相对扭曲得分对4种鲹科鱼类耳石形态进行判别分析(Discriminant analysis, DA)。用tpsRegr软件的薄板样条分析法对耳石形态进行可视化处理，并计算出质心值(Centroid size，CS)，并对质心值进行对数转换。对4种鲹科鱼类耳石形态的质心值进行单因素方差分析，以比较4种鲹科鱼类种间矢耳石形态质心值大小差异，单因素方差分析之前对4种鲹科鱼类耳石形态的质心值数据进行K-S检验，判别是否符合正态分布和进行Levene方差齐性检验，并做耳石形态质心值箱线图[23]。所有数据分析使用SPSS 20.0 和Excel 2016软件完成。

2 结果与分析

2.1 矢耳石形态地标点分析

利用tpsSmall软件进行最小二乘准则回归分析显示，其切空间距离(y轴)和普式距离(x轴)的回归系数为0.99，说明所选取的地标点是有效的。通过tpsRelw软件对4种鲹科鱼类矢耳石形态地标点数据文件进行分析，计算得到4种鲹科鱼类矢耳石8个地标点的平均形(图2-A)，并对4种鲹科鱼类矢耳石108个样品的所有地标点进行重叠(图2-B)，可以明显看出8个地标点各自的集散情况。相对扭曲分析显示，4种鲹科鱼类矢耳石形态的8个地标点，在相对扭曲时贡献率最大的是地标点5，贡献率为42.655%，其次为地标点4，贡献率为35.853%(表3)。

2.2 矢耳石形态可视化分析

通过tpsRegr软件对4种鲹科鱼类矢耳石形态地标点进行可视化分析显示，8个地标点生成的网格变形图中，地标点矢量图的网格变形中清楚地看出各个地标点在网格中的变化趋势及变化程度(图3-A)，而在地标点连线图的网格变形中，可以直观形象地看到可视化形成的矢耳石形态(图3-B)，其可视化形态与实际耳石形态相似，可视化后的耳石形态具有种的特异性。

2.3 矢耳石形态质心值分析

通过对质心值进行对数转换，4种鲹科鱼类耳石形态质心值符合正态分布(P>0.05)，也通过了Levene方差齐性检验(P=0.079>0.05)。单因素方差分析显示，4种鲹科鱼类耳石质心值种间差异显著(F=289.563，P<0.05)。从图4可见，4种鲹科鱼类耳石质心值的最大值比较中，脂眼凹肩鲹最大，短吻丝鲹最小。

2.4 主成分分析

相对扭曲主成分分析结果显示，4种鲹科鱼类矢耳石形态地标点主成分分析中共提取了12个主成分(表4)，其中，第1个主成分贡献率为74.55%，第2个主成分贡献率为11.16%，前两个主成分的累计贡献率达85.71%，很好地解释了矢耳石形态变化特性。从图5可见,第1主成分能很好地将4种鲹科鱼类区分开，第2主成分仅能将竹筴鱼与其他3种鲹科鱼类区分开。

Tab.4 Eigenvalues and contributions of the first twelve principal components of relative warps scores

2.5 判别分析

判别分析显示，4种鲹科鱼类矢耳石形态的12个相对扭曲主成分得分，仅有7个指标(P<0.05)被纳入判别函数中，分别是PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC8。4种鲹科鱼类判别分类函数如下(竹筴鱼T，短吻丝鲹A，脂眼凹肩鲹S，高体若鲹C)：

T=-73.033PC1+166.479PC2-112.508PC3+32.551PC4-36.793PC5+50.560PC6+94.483PC8-12.993；

A=358.909PC1-67.372PC2+75.309PC3-33.236PC4+86.212PC5-254.708PC6-11.760PC8-49.402；

S=-132.724PC1-24.518PC2+34.020PC3-10.570PC4-2.448PC5+88.791PC6-9.226PC8-8.681；

C=49.915PC1+5.346PC2-219.315PC3+102.969PC4-157.967PC5+6.531PC6-110.068PC8-16.538。

判别分析结果显示，4种鲹科鱼类的判别分析中逐步判别和交互检验的成功率平均值均为100%(表5)。4种鲹科鱼类的判别函数图(图6)区分效果较好，判别函数1可以将短吻丝鲹和高体若鲹与其他两种鱼区分开，而判别函数2则可以把竹筴鱼和高体若鲹与其他两种鱼区分开。判别函数1解释了4种鲹科鱼类矢耳石形态总变异的81.8%。

3 讨论

3.1 选取地标点对耳石形态信息的影响

传统形态测量法对形态信息的提取能力有限，几何形态测量法[13]的发展弥补了传统形态测量法的不足，几何形态测量法为生物分类学和系统发育学提供强有力的研究手段[24]。地标点法[13]以定量的分析方式对耳石形态差异进行描述，通过对地标点位置的确定有助于分析和提取耳石形态信息数据，并进一步解释耳石形态的变异和种间的特异性。耳石形态二维平面上的各个地标点均是由一组坐标值组成[13]，在进行形态分析时，选取具有代表性的地标点尤其重要。

本研究中根据4种鲹科鱼类矢耳石形态的平均形和重叠地标点图(图2)可以看出，地标点4和地标点5相对其他地标点，其地标点较为集中，离散程度小。在相对扭曲时，地标点5贡献率最大，其次为地标点4，两个地标点占了全部贡献率的78.508%，说明在选取的地标点中这两个地标点对耳石形态信息的分析和提取中作用显著。而Ⅰ型地标点贡献率为42.655%，Ⅲ型地标点为45.047%，也说明地标点选取的重要性。选取地标点对耳石形态信息的影响在其他研究也有类似的结果，如在白姑鱼属Pennahia耳石形态分析中，其耳石听沟颈部交叉点两个地标点贡献率达83.01%，对形态识别起到非常重要的作用[15]；金线鱼属Nemipterus耳石形态研究中其Ⅰ型地标点和Ⅲ型地标点对耳石形态区别也有较大作用[16]。不同种鱼类耳石形态在地标点的选取中[15-16,18]，因其Ⅰ型地标点是耳石形态中不同部分间的交点，如基叶与翼叶的交点等，所以Ⅰ型地标点在选取过程中容易被准确定位。而Ⅰ型地标点贡献率较高[15-16,18]，也较为稳定，具有很好的代表性，对耳石形态地表点法分析产生重要的影响。

表5 4种鲹科鱼类耳石的判别分析结果(逐步判别分析、交互检验分析)

Tab.5 Discriminant analysis results of otolith of four species in Carangidae (stepwise discriminant analysis and cross validation analysis)

笔者认为，在地标点法分析中选取地标点应结合其耳石形态特异性选取具有代表性的点，才能更好地提高对耳石形态信息的提取和识别鱼种的效果。如4种白姑鱼[15]和4种金线鱼[16]均采用其耳石整体形态和听沟形态的地标点相结合分析耳石形态差异，由于其白姑鱼属和金线鱼属耳石整体形态属内差异较小且较为相似，所以需要结合其听沟形态地标点进行分析，以便达到更好的分析效果。本研究中4种鲹科鱼类虽为同科鱼类但不同属，其耳石形态差异较大，通过耳石整体形态的地标点分析能达到较好的分类效果。

3.2 地标点法对耳石形态的可视化效果

4种鲹科鱼类耳石形态特征差异明显，具有鲜明的种的特异性。竹筴鱼矢耳石形态呈长椭圆形，基叶发达，有翼叶发育；短吻丝鲹矢耳石形态略似手写体的阿拉伯数字“9”，基叶发达且宽厚，翼叶发育明显；脂眼凹肩鲹矢耳石形态呈四边形，基叶发育明显，有翼叶发育且呈小三角形；高体若鲹矢耳石形态呈长椭圆形，基叶发达，有翼叶发育，其翼叶发育呈三角形。

本研究中地标点是沿着耳石轮廓顺时针选取具有代表性的地标点，并通过薄板样条分析[25]得到4种鲹科鱼类耳石形态可视化的网格变形图(地标点矢量图和地标点连线图)，基于二维平面的耳石形态地标点位置可以观察出，地标点连线图(图3-B)中耳石形态的网格变形过程中其耳石形态变化具有种的特异性，使得地标点法分析更为直观。此外，可以从地标点矢量图(图3-A)中直接看出，耳石形态地标点在网格上的变化和差异。通过4种鲹科鱼类耳石形态地标点的网格变形图可以初步进行种类鉴定，要更进一步鉴定和确定鱼种需要结合主成分分析和判别分析进行准确识别。

本研究中从质心值的箱线图(图4)可以直观地看出，4种鲹科鱼类耳石形态质心值的种间变化，即通过地标点法利用质心值分析4种鲹科鱼类耳石形态大小关系[23,26]，4种鲹科鱼类耳石形态最大值由大到小依次为脂眼凹肩鲹>竹筴鱼>高体若鲹>短吻丝鲹。地标点法的质心值与传统形态测量法的度量值不同，通过地标点法得到的质心值在耳石形态信息提取上更为全面，本研究中的地标点是沿着耳石轮廓顺时针提取形态信息，即包含了耳石形态8个地标点在二维平面的形态信息，使得对4种鲹科鱼类耳石形态的分析更为直观形象。

3.3 地标点法对耳石形态的分类识别效果

本研究中在相对扭曲主成分分析中，4种鲹科鱼类矢耳石形态地标点提取的前两个主成分信息较好，矢耳石形态信息的相对扭曲主成分降维分析效果显著。同时，前两个主成分信息很好地解释了矢耳石形态信息变化，也印证了选取具有代表性的地标点对耳石形态信息多元统计分析的重要性。此外，根据主成分散点图(图5)可以看出，第1个主成分在耳石形态信息的降维过程中起到了重要作用。从4种鲹科鱼类的判别函数图(图6)可以看出，判别函数1可以将短吻丝鲹和高体若鲹与其他两种鲹科区分开，判别函数2则把竹筴鱼和高体若鲹与另外两种鱼区分开。本研究的判别分析中，逐步判别和交互检验对4种鲹科鱼类的判别成功率平均值均为100%，识别效果均很好。与本研究相似的分类研究结果有凤鲚Coilia mystus和七丝鲚C.grayii 两种鱼的不同群体判别成功率平均值也为100%[17]；4种金线鱼的平均判别成功率为89.8%[16]，低于本研究的判别成功率。这表明,本研究中利用地标点法对4种鲹科鱼类耳石形态识别效果明显。但也存在应用地标点法对生物分类识别效果较差的情况，冯波等[27]研究短吻鲾Leiognathus brevirostris不同地理群体，采用传统形态测量法和地标点法进行比较分析，其分析效果是传统形态测量法优于地标点法，原因可能是地标点选取不当造成的。选取具有同源性的地标点[28]，即选取地标点要具有代表性，这不仅对形态信息分析产生影响，而且也最终影响到种类鉴定分析效果。

随着几何形态测量法的不断深入和完善[29-30]，不仅开发出许多形态测量应用软件[11]，而且促进了大批研究人员从事该方面的研究，使得基于形态信息的研究方法在生物领域等中也得到了应用和推广[31]。地标点法在耳石形态学的应用中能有效地对耳石形态信息进行提取，对耳石形态的种类鉴定、群体识别应用具有十分重要意义，也为识别耳石形态的自动分类提供了基础，地标点法对耳石形态信息的分析，使得耳石形态中的一些信息特征能够被转换成几何指标数据，而这些几何指标数据的构成和完善是将来计算机自动处理和识别分析鱼种的重要手段之一，地标点法的应用不仅为完善耳石形态学的研究提供了强有力的研究手段，而且为鱼类系统分类学提供了多样的研究方法。

[1] Tuset V M,Rosin P L,Lombarte A.Sagittal otolith shape used in the identification of fishes of the genus Serranus[J].Fish Res,2006,81(2-3):316-325.

[2] 陈新军,刘必林,钟俊生.头足类年龄与生长特性的研究方法进展[J].大连水产学院学报,2006,21(4):371-377.

[3] 林东明,许柳雄,叶旭昌,等.西北印度洋丝尾红钻鱼耳石生长形态学的初步研究[J].大连海洋大学学报,2015,30(2):155-160.

[4] 欧利国,刘必林.南海东沙群岛海域圆鲹属鱼类矢耳石的形态特征分析[J].南方水产科学,2019,15(3):33-40.

[5] Tuset V M,Lombarte A,González J A,et al.Comparative morphology of the sagittal otolith in Serranus spp.[J].J Fish Biol,2003,63(6):1491-1504.

[6] 叶振江,孟晓梦,高天翔,等.两种花鲈(Lateolabrax sp.)耳石形态的地理变异[J].海洋与湖沼,2007,38(4):356-360.

[7] Marcus J,Bowen W D,Eddington J D.Effects of meal size on otolith recovery from fecal samples of gray and harbor seal pups[J].Mar Mamm Sci,1998,14(4):789-802.

[8] Volpedo A V,Tombari A D,Echeverría D D.Eco-morphological patterns of the sagitta of Antarctic fish[J].Polar Biol,2008,31(5):635-640.

[9] Bobiles R U,Soliman V S,Yamaoka K.Changes in otolith structure of seagrass siganid Siganus canaliculatus during settlement[J].AACL Bioflux,2015,8(1):15-25.

[10] 郭弘艺,唐文乔,魏凯,等.中国鲚属鱼类的矢耳石形态特征[J].动物学杂志,2007,42(1):39-47.

[11] 陈新军,方舟,苏杭,等.几何形态测量学在水生动物中的应用及其进展[J].水产学报,2013,37(12):1873-1885.

[12] 侯刚,冯波,颜云榕,等.北部湾金线鱼、深水金线鱼与日本金线鱼矢耳石形态识别的初步研究[J].中国海洋大学学报,2012,42(3):27-35.

[13] 闫宝荣,花保祯.几何形态测量学及其在昆虫分类学和系统发育中的应用[J].昆虫分类学报,2010,32(4):313-320.

[14] 王英俊.傅里叶分析在鱼类耳石形态学中的应用研究[D].青岛:中国海洋大学,2010.

[15] 侯刚,刘丹丹,冯波,等.基于地标点几何形态测量法识别北部湾4种白姑鱼矢耳石形态[J].中国水产科学,2013,20(6):1293-1302.

[16] 侯刚,王学锋,朱立新,等.基于几何形态测量学的4种金线鱼矢耳石识别研究[J].海洋与湖沼,2014,45(3):496-503.

[17] 姜涛,郑朝臣,黄洪辉,等.基于地标点法的九龙江口和珠江口凤鲚和七丝鲚耳石形态学特征比较[J].南方水产科学,2018,14(6):10-16.

[18] 彭艳,曾燏,张臣,等.嘉陵江不同江段蛇鮈耳石形态特征及差异[J].水产学报,2018,42(12):1896-1905.

[19] 国家水产总局南海水产研究所.南海诸岛海域鱼类志[M].北京:科学出版社,1979.

[20] 叶振江.中国海洋鱼类耳石形态学分析及应用研究[D].青岛:中国海洋大学,2010:1-216.

[21] Gaemers P A M.Taxonomic position of the Cichlidae (Pisces,Perciformes) as demonstrated by the morphology of their otoliths[J].Neth J Zool,1984,34(4):566-595.

[22] Bookstein F L.Introduction to methods for landmark data[M]//Rohlf F J,Bookstein F L.Proceedings of the Michigan Morphometrics Workshop.Ann Arbor:University of Michigan Museum of Zoology,1990:215-226.

[23] 闫宝荣.基于几何形态测量学的蝎蛉科昆虫系统发育研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2011.

[24] Rohlf F J,Slice D.Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks[J].Syst Biol,1990,39(1):40-59.

[25] Bookstein F L.Principal warps:thin-plate splines and the decomposition of deformations[J].IEEE Trans Pattern Anal Mach Intell,1989,11(6):567-585.

[26] 李玲,党海燕,丁三寅,等.基于几何形态学对三种实蝇翅脉形态分析(Diptere:Tephritidae:Bactrocera)[J].应用昆虫学报,2017,54(1):84-91.

[27] 冯波,程罗妹.几何形态学方法区分短吻鲾地方种群的研究[J].上海海洋大学学报,2011,20(5):677-681.

[28] Winans G A.Using morphometric and meristic characters for identifying stocks of fish[R]. Seattle:National Marine Fisheries Service,Northwest and Alaska Fisheries Center,1987:135-146.

[29] Bookstein F L.Size and shape spaces for landmark data in two dimensions[J].Stat Sci,1986,1(2):181-222.

[30] Bookstein F L.A hundred years of morphometrics[J].Acta Zool Acad Sci Hung,1998,44(1-2):7-59.

[31] 闻慧,王心丽.轮廓形态测量法在生物分类应用中的研究进展[J].应用昆虫学报,2013,50(5):1438-1446.