六种海胆及四种杂交海胆管足骨片类型和数量

海胆Echinoidea是一类比较常见的海洋无脊椎动物，隶属于棘皮动物门Echinodermata、游走亚门Eleutherozea、海胆纲Echinoidea[1]，可分为规则海胆亚纲和不规则海胆亚纲两个亚纲，现存22目，分隶于225个属850多种，中国已记录的有8目26科60属93种。近年来，随着海胆市场需求的增大、养殖产量的增加，培育生长性能好、抗逆性强的新品种和杂交种迫在眉睫[2]。杂交种在外观上与亲本差异不明显，现多采用分子生物学方法对海胆进行标记，操作过程费时费力且成本较高。因此，借鉴海参骨片类型可以区分海参种类的方法，研究用海胆管足骨片类型和数量来准确区分海胆种类的方法不失为一种既直接又有效的方法。

目前，国内外对海参骨片的研究较多，用次氯酸钠方法制备的骨片样品清晰完整，采用电子显微镜可观察海参骨片形态和类型。张莉恒等[3]对刺参骨片的种类和形态学研究发现，骨片可为刺参的年龄鉴别提供参考。李赟等[4]对15种海参骨片的形态学研究发现，不同海参骨片种类及相对比例和同型骨片特征均存在显著差异，可依据骨片区分出不同种类的海参。姚旺等[5]对西沙群岛6种海参骨片的超显微研究进一步丰富了中国海参骨片研究的资料。但目前对海胆骨片的研究却鲜有报道。海胆管足壁内生有极其细小的骨片，本研究中通过在光学显微镜下观察并统计中间球海胆Strongylocentrotus intermedius、紫海胆Anthocidaris crassispina、光棘球海胆Mosecentrotus nudus、海刺猬Glyptocidaris crenularis、高腰海胆Mespilia globulus、马粪海胆Hemicentrotus pulcherrimus、中间球海胆♀×紫海胆♂S.intermedius♀×A.crassipine♂、中间球海胆♀×马粪海胆♂S.intermedius♀×H.pulcherrimus♂、中间球海胆♂×马粪海胆♀S.intermedius♂×H.pulcherrimus♀和中间球海胆♀×光棘球海胆♂S.intermedius♀×A.crassipine♂管足内骨片，确定各种海胆骨片类型、数量及特有类型，找出各种海胆间的区别，以及杂交种与亲本的区别，以期为海胆种类鉴定提供了一种新方法[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验随机选取农业农村部北方海水增养殖重点实验室养殖的6种海胆和4种杂交海胆，每种海胆取4枚。中间球海胆壳径为2.1～3.3 cm，紫海胆壳径为4.2～5.0 cm，光棘球海胆壳径为2.5～3.0 cm，海刺猬壳径为4.0～5.0 cm，高腰海胆壳径为1.5～2.5 cm，马粪海胆壳径为2.2～2.8 cm，中间球海胆♀×紫海胆♂壳径为2.3～3.4 cm，中间球海胆♀×马粪海胆♂壳径为2.5～4.3 cm，中间球海胆♂×马粪海胆♀壳径为2.3～3.0 cm，中间球海胆♀×光棘球海胆♂壳径为3.9～5.2 cm。

1.2 方法

将海胆放在直径为10 cm的培养皿中，待海胆伸出管足，用剪刀快速剪取赤道部的管足，用塑料滴管吸取5根管足放在载玻片上，用另一块载玻片均匀压在表面，由于海胆管足骨片具有伸缩性，较难取到等长管足，用10倍的物镜在显微镜下观察管足内的骨片特征，分别选取管足的吸盘、中部、基部3个部分观察并拍照。

将每种海胆管足里的骨片命名，吸盘、中部和基部3个视野分开统计，记录每个视野下骨片的类型及数量，再用标记的微尺测量骨片长度和宽度。

1.3 数据处理

采用Excel软件对所有数据进行初步整理，对每种海胆各个个体不同管足里骨片类型和数量分开进行统计。采用SPSS 16.0 软件对单视野下骨片类型数量进行统计分析。以海胆种类和管足部位为因素，进行双因素方差分析，检测双因素间的交互作用，若交互作用显著，则在每一海胆种类内，对不同管足部位的骨片类型数量进行单因素方差分析，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 海胆的骨片类型

在所有海胆中观测到5种类型骨片，分别为C形体、S形体、杆状体、三叉形体和海马状体(图1)。

2.2 不同海胆骨片类型

从表1可见，紫海胆有3种类型骨片，分别为C形体、三叉形体和杆状体。特有Ⅱ型三叉形体骨片。两长叉间约100 μm，宽约5 μm。

中间球海胆有3种类型骨片，分别为C形体、杆状体和S形体。特有Ⅲ型S形体骨片。C形体骨片长约60 μm，宽约3.3 μm。

光棘球海胆有3种类型骨片，分别为C形体、杆状体和S形体。特有Ⅳ型C形体骨片。Ⅳ型C形体骨片长约70 μm，宽约6.6 μm。

海刺猬有2种类型骨片，分别是海马状体和杆状体。特有海马状体骨片。海马状体骨片长约150 μm，宽约25 μm。

高腰海胆有2种类型骨片，分别为C形体和三叉形体。

马粪海胆有3种类型骨片，分别为C形体、S形体和杆状体。

注：A，C形体；B，三叉形体；C，Ⅰ型三叉形体；D，Ⅱ型三叉形体；E，杆状体；F，Ⅰ型杆状体；G，Ⅰ型C形体；H，Ⅱ型C形体；I，Ⅲ型C形体；J，S形体；K，Ⅰ型S形体；L，Ⅱ型S形体；M，Ⅲ型S形体；N，Ⅳ型C形体；O，Ⅴ型C形体；P，Ⅵ型C形体；Q，Ⅶ型C形体；R，Ⅷ型C形体；S，海马状体；T，Ⅰ型海马状体；U，Ⅱ型海马状体

Note:A，C-shaped type；B，trigeminal type；C，trigeminal typeⅠ；D，trigeminal typeⅡ；E，rod；F，rodlikeⅠ；G，C-shapedⅠ；H，C-shapedⅡ；I， C-shaped Ⅲ；J，S-shaped type；K，S-shapedⅠ；L，S-shapedⅡ；M， S-shaped Ⅲ；N，C-shaped Ⅳ；O，C-shaped Ⅴ；P， C-shaped Ⅵ；Q，C-shaped Ⅶ ；R，C-shaped Ⅷ ；S，hippocampal type；T，hippocampal typeⅠ；U，hippocampal typeⅡ

中间球海胆♀×光棘球海胆♂有3种类型骨片，分别为C形体、S形体和杆状体。后代未产生新的骨片类型，遗失了部分骨片，与中间球海胆相比缺少了Ⅰ型C形体、Ⅱ型C形体、Ⅲ型C形体和Ⅲ型S形体，与光棘球海胆相比缺少了Ⅳ型C形体和Ⅷ型C形体。

中间球海胆与马粪海胆正反交，正反交后代未产生新的骨片类型，遗失了部分骨片，有3种类型骨片，分别为C形体、S形体和杆状体。与马粪海胆无区别，与中间球海胆相比缺少了Ⅰ型C形体、Ⅱ型C形体、Ⅲ型C形体、Ⅰ型S形体、Ⅱ型S形体和Ⅲ型S形体。

中间球海胆♀×紫海胆♂后代未产生新的骨片类型，遗失了部分骨片，有3种类型骨片，分别为C形体、S形体和杆状体。与紫海胆相比缺少了三叉形体、Ⅰ型三叉形体、Ⅱ型三叉形体，与中间球海胆相比缺少了Ⅲ型S形体。

由上可知，根据骨片类型可直接区分以下8种海胆：紫海胆特有Ⅱ型三叉形体骨片，中间球海胆特有Ⅲ型S形体骨片，光棘球海胆特有Ⅳ型C形体骨片，海刺猬特有海马状体骨片，高腰海胆只有C形体和三叉形体两种骨片，马粪海胆只有C形体、S形体和杆状体3种骨片类型，中间球海胆♀×光棘球海胆♂有杆状体及Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅶ型C形体骨片类型，中间球海胆♀×紫海胆♂有Ⅲ型C形体但无Ⅲ型S形体骨片类型。

2.3 各种海胆不同部位骨片数量

从图2可见：紫海胆骨片主要集中在根部，在数量上根部最多，中部其次，吸盘最少；吸盘处Ⅰ型三叉形体和C形体各占16.7%，Ⅱ型三叉型占25%，杆状体占41.6%；中部三叉形体和Ⅱ型三叉形体占30%，Ⅰ型三叉形体占35%，Ⅰ型杆状体占5%；基部三叉形体占24.1%,Ⅰ型三叉形体占31.5%，Ⅱ型三叉型占27.8%，杆状体占9.3%，Ⅰ型杆状体占7.3%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有显著性差异(P<0.05)。

中间球海胆骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占19.2%，杆状体占9.1%，Ⅰ型三叉形体和C形体各占20.2%，Ⅲ型C形体占13.1%，Ⅰ型杆状体和Ⅲ型S形体占2.0%，S形体占5.1%，Ⅰ型S形体占3.0%，Ⅱ型S形体占6.1%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

光棘球海胆骨片主要集中在吸盘处，吸盘处Ⅰ型杆状体占16.3%，Ⅰ型S形体占2.5%，Ⅱ型S形体和Ⅳ型C形体占6.1%，Ⅴ型C形体、Ⅵ型C形体和Ⅶ型C形体各占25.0%，Ⅷ型C形体占3.8%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

海刺猬骨片主要集中在吸盘处，吸盘处海马状体和Ⅰ型海马状体各占33.3%，Ⅱ型海马状体占31.7%，杆状体占1.7%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著差异(P<0.01)。

高腰海胆骨片数量极少，吸盘处C形体占66.7%，S三叉形体占33.3%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，无显著性差异(P>0.05)。

马粪海胆骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占57.1%，Ⅰ型杆状体占17.2%，S形体占25.7%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

中间球海胆♀×光棘球海胆♂骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占18.5%，杆状体占11.1%，Ⅰ型杆状体和Ⅰ型S形体占2.5%，Ⅱ型S形体占1.3%，Ⅴ型C形体和Ⅵ型C形体各占24.7%，Ⅶ型C形体占14.7%；中部Ⅴ型C形体占62.5%，Ⅵ型C形体占37.5%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

中间球海胆♀×马粪海胆♂骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占33.3%，杆状体占18.4%，Ⅰ 型杆状体占8.3%，Ⅰ型C形体占23.3%，Ⅱ型C形体占6.7%，S形体占10.0%；中部C形体占100%；基部C形体占100%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

中间球海胆♂×马粪海胆♀骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占42.6%，杆状体占27.7%，Ⅰ型杆状体占4.3%，Ⅰ型C形体占12.7%，Ⅱ型C形体占2.1%，S形体占10.6%；中部C形体占100%；基部C形体占100%。对管足不同部位方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

中间球海胆♀×紫海胆♂骨片主要集中在吸盘处，吸盘处C形体占23.3%，杆状体占8.1%，Ⅰ型杆状体占1.2%，Ⅰ型C形体占23.2%，Ⅱ型C形体占23.1%，Ⅲ型C形体占17.4，S形体、Ⅰ型S形体和Ⅱ型S形体占1.2%；中部C形体占30.8%，Ⅰ型C形体占23.1%，Ⅱ型C形体占46.1%；基部Ⅰ型C形体占50.0%，Ⅱ型C形体占50.0%。对管足不同部位骨片数量方差分析显示，有极显著性差异(P<0.01)。

由上可知，利用海胆骨片类型可以区分出8种海胆。而中间球海胆与马粪海胆正反交，后代骨片类型一样，虽然从类型上不能区分，但中间球海胆♀×马粪海胆♂后代吸盘处C形体占33.3%，而中间球海胆♂×马粪海胆♀后代吸盘处C形体占42.6%，据此可将其分开。因此，根据不同海胆中所含骨片类型和数量差异，可将上述不同种海胆区分开，同时也可以为杂交种的鉴定提供一种思路。

3 讨论

3.1 不同种海胆骨片类型的差异

骨片位于海胆的管足里，它是海胆纲分类的重要依据，其主要成分是碳酸钙。紫海胆属正形目、长海胆科[7]，特有Ⅱ型三叉形体骨片；光棘球海胆属正形目、球海胆科[8]，特有Ⅳ型C形体骨片；海刺猬属正形目、疣海胆科[9]，特有海马状体骨片；中间球海胆属正形目、球海胆科[10]，特有Ⅲ型S形体骨片。由此可知，同属的海胆骨片间存在一定共性，同属不同种海胆骨片均有差异，不同属海胆骨片类型差异较大。高腰海胆骨片极少，壳板覆盖不完全，且棘软，可能是海胆幼胚发育过程中，钙离子通过内吞作用进入细胞，PMC特异性表面分子伴随钙离子，与生长针结合在一起，针状体由原代间充质细胞合成减少[11]，导致棘软且壳板覆盖不完全。

杂交种海胆未产生新的骨片类型，亓守冰等[10]研究发现，与管足和棘刺不同,杂交海胆的骨片形状尤其是骨片两端的突起并非父母本的中间体。中间球海胆和光棘球海胆的骨片上、下两端均各有两个突起，而杂交海胆的上、下两端的突起均只有一个,有一些骨片的突起甚至完全消失,这说明杂交产生了新的变异,这也与本研究结果一致。

中间球海胆♀×光棘球海胆♂特征与亲本相近，仅棘刺颜色为浅紫色，介于中间球海胆的白色和光棘球海胆的紫色之间，但可根据骨片类型将杂交海胆与亲本分开。田晓飞等[12]研究发现，杂交海胆幼体融合了父母本的基因，在形态上与双亲均有相似和不同。而本研究中也发现类似情况，中间球海胆与马粪海胆杂交后代骨片类型既有中间球海胆又有马粪海胆的，后代在外形上与马粪海胆无明显差别，骨片类型也一样，故不能将其分开。常亚青等[13]研究发现，中间球海胆与马粪海胆杂交组异性配子的亲合性最好, 最大受精率均在60%以上, 其主要原因是马粪海胆、中间球海胆和光棘球海胆之间的杂交属同科内的种间杂交, 两种海胆的亲缘关系较近, 双亲亲和力高。而本研究中同样也发现，中间球海胆♀×紫海胆♂产生的骨片类型与中间球海胆一样，遗失了紫海胆的骨片优势类型，杂交种骨片集中在吸盘处，与中间球海胆骨片一样。文菁等[14]报道的中国热带6种海参骨片里也有C型骨片，范嗣刚等[15]报道，西沙群岛8种海参骨片形态特征种也有骨状的骨片，表明棘皮动物海参与海胆间亲缘关系较近[6]。

3.2 不同种海胆骨片数量的差异

本研究表明，不同种海胆管足里骨片优势种类及数量不同，紫海胆属长海胆科，三叉形体骨片类型最多；光棘球海胆属球海胆科，Ⅰ型C形体和Ⅴ型C形体骨片类型最多；海刺猬属疣海胆科，海马状体骨片类型占98.3%，中间球海胆属球海胆科，Ⅰ型C形体类型最多。由此可见，海胆间亲缘关系越远，骨片在优势类型和比例上差异越大。

中间球海胆♀×紫海胆♂骨片集中在吸盘，骨片类型仅比中间球海胆少S形体，骨片类型相对比例及位置与中间球海胆相近；中间球海胆♀×马粪海胆♂和中间球海胆♂×马粪海胆♀后代骨片类型比例倾向于双亲的平均值，中间球海胆♀×马粪海胆♂后代中C形体占33.3%，中间球海胆♂×马粪海胆♀后代中C形体占42.6%；中间球海胆♀×光棘球海胆♂后代骨片类型比例上，Ⅴ型C形体骨片占24.7%，Ⅳ型C形体占24.7%，介于父母本之间。王丽梅等[16]、周遵春[17]研究发现，中间球海胆与光棘球海胆杂交棘刺的特征介于两亲本之间，且与亲本相近。本研究中观测到骨片也介于父母本性状之间，与本研究中所观测到的结果一致。Ding等[18]认为，杂交海胆与所有亲本并无完全相同的形态特征，而是融合了父母本形态的结合体。与本研究结果相符合。

综上所述，骨片可作为海胆分类的一种重要依据，判断各种海胆需要从骨片类型和所占比例综合考虑，据此可将6种海胆和4种杂交种海胆完全区分开，本研究结果可为日后海胆杂交种鉴定提供一种参考。

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