不同水平蚯蚓虫沙对鲤生长、消化和抗氧化指标影响

蚯蚓虫沙又称为蚯蚓粪，是一种黑色、均一、无味的颗粒物质，其不仅是蚯蚓的粪便，还含有蚯蚓卵和小蚯蚓，以及可被水产生物消化吸收的营养物质、腐殖酸和多种类微量元素。此外，蚯蚓虫沙还含有抗菌类微生物，对微生态平衡有益 [1]，具有药用价值，可以替代麸皮作为鱼类及畜禽的饲料[2]。已有研究表明，饲料中添加蚯蚓粪、蚯蚓粉可提高水生生物的生长性能及免疫力，如草鱼[2-3]、鲶[4]、黄鳝[5]、罗非鱼[6-7]、鳢[8]、田螺[9]、鲫[10-11]等。相较于昂贵的蚯蚓粉，蚯蚓虫沙价格低廉，更具有市场前景。

鲤Cyprinus carpio是典型的杂食性鱼类，是中国北方地区重要的淡水经济鱼类，在水产养殖业中所占比重较大。目前，随着环保力度加大和市场对绿色健康水产品需求增加，水产养殖成本也在增加，养殖中增加的各种应激因素均会对鲤生长、抗病等机能产生危害。若添加蚯蚓虫沙能使鲤饲料系数降低，鱼体生长和抗氧化性能得到提高，将会有益于鲤健康养殖和经济效益的提高。目前，蚯蚓虫沙在鲤中的应用在国内尚未见报道，本试验中主要探究了不同添加量的蚯蚓虫沙对鲤生长性能、肠道消化酶指标、血清和肝胰脏中抗氧化指标的影响，旨在为蚯蚓虫沙应用于鲤饲料提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用鲤购自北京市通州区小务村养鱼场，运回后暂养10 d，再进行分组试验。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的制备试验用蚯蚓虫沙和蚯蚓粉同作者前期报道[6]。挑选干净的湿蚯蚓虫沙(不含未吃净的牛粪与沙土等杂质)，通过阳光晒干后筛选并粉碎(粉碎细度超过60目)制成晒干蚯蚓虫沙，称为蚯蚓虫沙1。取晒干的蚯蚓虫沙在烘箱(120 ℃)内烘干1 h制成高温烘干蚯蚓虫沙，称为蚯蚓虫沙2。蚯蚓粉为鲜蚯蚓经阳光晒干后，细度超过60目粉碎而得。

饲料原料同作者前期试验报道[6]。配制试验饲料前先测定蚯蚓粉和蚯蚓虫沙常规营养成分，以及蚯蚓虫沙的微量元素和重金属含量，对其营养价值及安全性进行分析评估。据此设计饲料配方，并测定所配制饲料营养水平，具体见表1和表2。在中国农业科学院昌平南口实验基地用小型试验饲料设备加工制备饲料。

注：每千克预混料中含VA 6.0×105 IU、VB1 800 mg、VB2 1200 mg、VB6 900 mg、VB12 2 mg、VC 10 000 mg、VD3 1.2×105 IU、VE 4000 IU、VK3 400 mg、肌醇8000 mg、烟酸4000 mg、泛酸钙3200 mg、叶酸250 mg、生物素20 mg、铁8000 mg、锌6000 mg、锰1000 mg、铜250 mg、碘32 mg、钴20 mg、硒15 mg

Note: One kilogram premix contains VA 6.0×105 IU，VB1 800 mg，VB2 1200 mg，VB6 900 mg，VB12 2 mg，VC 10 000 mg，VD3 1. 2×105 IU，VE 4000 IU，VK3 400 mg，inositol 8000 mg，niacin 4000 mg，calcium pantothenate 3200 mg， folic acid 250 mg，biotin 20 mg， Fe 8000 mg，Zn 6000 mg，Mn 1000 mg，Cu 250 mg， I 32 mg，Co 20 mg， and Se 15 mg

Tab.2 Calculated theoretical values and measured ones of nutritional levels in the diets(dry matter)w/%

1.2.2 试验设计及饲养管理试验于2018年7—8月在北京市水产科学研究所小汤山观赏鱼养殖基地进行，为期60 d。试验共设24个水族箱(100 cm×50 cm×50 cm)。试验期间每天8：00、12：00、16：00投喂，每次投喂约40 min，投料至试验鱼基本不再抢食为止。试验期间水温为27～29 ℃，水族箱有自动过滤循环系统，每天清洗过滤棉除去粪便等脏物，每3天换水约二分之一。

试验时挑选规格整齐、体质健壮的鲤336尾，平均初始体质量为(73.66 ± 0.21)g，随机分为8个试验组，每组设3个重复，每个重复放14尾鱼。第一组设计为对照组，仅饲喂基础饲料，标记为A试验组；第二、三、四组分别饲喂添加2.5%、5.0%、7.5%晒干蚯蚓虫沙，标记为B1、B2、B3试验组；第五、六组分别饲喂添加5.0%、7.5%高温烘干蚯蚓虫沙，标记为C1、C2试验组；第七、八组分别饲喂添加5.0%晒干蚯蚓虫沙+0.15%蚯蚓粉、7.5%晒干蚯蚓虫沙+0.23%蚯蚓粉，标记为D1、D2试验组(表1)。养殖试验共进行60 d。

1.2.3 饲料营养成分的测定按照GB6435—1986、GB/T6432—1994、GB/T6432—1994、GB/T6433—1994、GB/T6436—2002、GB/T6437—2002、GB/T6434—1994、GB13885—1992、GB13080—1991、GB13082—1991、GB13079—1999标准分别测定水分、粗灰分、粗蛋白质、粗脂肪、钙、总磷、粗纤维、矿物元素、铅、镉、总砷含量。

每种指标均取2份平行样品，结果取其算术平均值。

1.2.4 相关指标的测定 60 d的生长试验结束后，将试验鱼禁食24 h，再采集和制备样品，并对相关指标进行测定。

(1)生长指标。包括体质量、增重率、存活率、特定生长率、饲料系数，其具体计算公式同作者前期试验报道[6]。

(2)消化指标。包括前肠胃蛋白酶、中肠淀粉酶和脂肪酶。从每个水族箱随机取4尾鱼，解剖取其前肠和中肠于-80 ℃下低温冷冻保存备用。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定鲤前肠、中肠消化酶活性，具体测定方法及操作步骤严格按照说明书进行。其中，反应均在37 ℃条件下，每毫克组织蛋白1 min分解蛋白生成1 μg氨基酸相当于一个胃蛋白酶活力单位；每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为一个脂肪酶活力单位；组织中每毫克蛋白与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为一个淀粉酶活力单位。

(3)抗氧化指标。包括鲤肝胰脏和血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)。从每个水族箱随机取4尾鱼，由尾部采血并采用冷冻离心机离心，离心参数设置为10 min、温度4 ℃、3500 r/min，取上层血清于低温(-80 ℃)下冷冻保存待用，解剖取鱼肝胰脏于低温(-80 ℃)下冷冻保存备用。采用南京建成生物工程研究所试剂盒并按照说明书测定各种抗氧化指标。

1.3 数据处理

试验数据以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan多重比较法对其组间差异进行显著性检验,显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 蚯蚓虫沙营养价值及安全性分析评估

蚯蚓虫沙和蚯蚓粉常规基本营养水平测定结果见作者前期试验报道[6]。

本试验中重点对蚯蚓虫沙微量元素和重金属含量进行了测定分析，结果见表3。根据《饲料卫生标准》GB13087—2001要求：鸡和猪配合饲料含铅量不应超过5 mg/kg，含镉量不应超过0.5 mg/kg，含总砷量不应超过2 mg/kg。蚯蚓虫沙虽然不在农业部颁布的饲料原料目录中，假设作为饲料添加剂在饲料里添加，添加量为10%，这样在饲料中铅含量为0.80 mg/kg，总砷含量为0.38 mg/kg，镉含量为0.052 mg/kg。这些重金属元素的含量均低于GB13087—2001《饲料卫生标准》的要求,表明本次试验设计用蚯蚓虫沙用量安全。从表3可见，蚯蚓虫沙的铁含量为15 000 mg/kg，铜含量为62 mg/kg，锰含量为350 mg/kg，锌含量为190 mg/kg，且含有钙、磷和腐殖酸，其在饲料中添加可以替代一部分微量元素添加剂。

2.2 蚯蚓虫沙对鲤生长性能的影响

饲料中添加不同比例的蚯蚓虫沙后，鲤的体质量、增重率、特定生长率、饲料系数等变化情况如表4所示。试验结果表明，与对照组相比，仅添加5.0%晒干蚯蚓虫沙组B2 的终末体质量、增重率和特定生长率显著提高(P<0.05)，其他试验组虽有提高但均无显著性差异(P>0.05)。

2.3 蚯蚓虫沙对鲤肠道消化酶指标的影响

饲料中添加不同比例的蚯蚓虫沙对鲤肠道消化酶影响情况如表5所示，添加蚯蚓虫沙的各试验组鲤肠道胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性虽有提高，但均与对照组无显著性差异(P>0.05)。

注：同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P>0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同

Note:The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia

Tab.5 Effects of dietary vermicompost on intestinal digestive enzyme activities in common carpU/g prot

2.4 蚯蚓虫沙对鲤血清和肝胰脏中抗氧化指标的影响

从表6可见：各蚯蚓虫沙试验组鲤血清中总抗氧化能力较对照组虽然有升高趋势，但无显著性差异(P>0.05)；各蚯蚓虫沙试验组T-SOD活性较对照组均有不同程度的升高，且有显著性差异(P<0.05)(除B1组外)，其中，以C1组升高最多，比对照组提高68.0%，其次是B3组，比对照组提高66.48%；B2、B3、D1、D2试验组丙二醛含量较对照组显著降低(P<0.05)，其中，D2组丙二醛含量降低最多，比对照组降低36.64%。

从表7可见：D1和D2组肝胰脏中总抗氧化能力与其他组相比有显著性差异(P<0.05)，说明蚯蚓粉能明显提高罗非鱼的总抗氧化能力；各试验组肝胰脏中T-SOD活性较对照组显著提高(P<0.05)(除B1外)；各试验组丙二醛含量均有降低，但仅B3组(添加7.5%的蚯蚓虫沙)、D1组(5.0%蚯蚓虫沙+0.15%蚯蚓粉)和D2组(7.5%蚯蚓虫沙+0.23%蚯蚓粉)有显著性降低(P<0.05),其中，以D1与D2两个添加蚯蚓粉组降低最多，其次是B3组。这表明,蚯蚓粉能够显著提高鲤肝胰脏中抗氧化指标，降低丙二醛含量，饲料中添加蚯蚓虫沙也能显著提高鲤肝胰脏的抗氧化指标，其中以7.5%的添加量为最好。

Tab.6 Effects of dietary vermicompost on serum antioxidant indices in common carp

Tab.7 Effects of dietary vermicompost on hepatopancreas antioxidant indices in common carp

3 讨论

3.1 蚯蚓虫沙微量元素和重金属含量安全性分析

蚯蚓在一定程度上会富集土壤中重金属(砷、铅、镉等)，因此，在蚯蚓虫沙相关产品开发前，需考虑其所富集的重金属是否会对养殖造成影响，以验证其是否能安全用于水产养殖。本试验中，首先对蚯蚓虫沙的营养成分、重金属和微量元素的含量进行测定，以评估其安全性。本试验中所用蚯蚓虫沙和蚯蚓粉的主要营养成分在作者前期试验中已报道[6]，这里不再讨论。本试验中所测蚯蚓虫沙钙磷含量(钙1.14%、总磷0.43%)与李云格等[12] 的报道(钙1.70%、总磷0.58%)较为接近，而比陈宝书等[13]报道(含钙4.16%、磷0.36%)的钙含量低。重金属含量方面，李云格等[12]研究表明，其所用蚯蚓虫沙铅含量为9.75 mg/kg、镉含量为0.50 mg/kg、总砷含量为3.56 mg/kg，与本试验中所用蚯蚓虫沙测得重金属含量较为接近。本试验中蚯蚓虫沙微量元素指标(铁15 000 mg/kg、铜62 mg/kg 、锰350 mg/kg、锌190 mg/kg)比李云格等[12]和陈宝书等[13]所测(均为铁3161.0 mg/kg、铜20.4 mg/kg、锰222.0 mg/kg、锌3.0 mg/kg)高许多，说明本次试验所用蚯蚓虫沙对微量元素富集程度更高，其在饲料中添加可以替代一部分微量元素。已有研究表明，由于原材料和蚯蚓活性的差异，常会导致所测蚯蚓虫沙中营养物质含量出现差异[14]。而饲养蚯蚓的原料和饲养方法不同，也会导致最终微量元素富集程度不同，这可能是导致本试验中所用蚯蚓虫沙微量元素含量与前人研究有差异的主要原因。但通过测定评估，可以说明本试验中所用蚯蚓虫沙重金属含量未超标，用作水产饲料添加剂是安全的。

3.2 蚯蚓虫沙对鲤生长性能和肠道消化酶活性的影响机制

研究表明，饲料中添加蚓粪可促进鲤生长并降低饲料系数[7，10]。邹青等 [11]用添加蚯蚓粪与蚯蚓饲养改良鲫的研究表明，当蚯蚓粪添加到4%时，其特定生长率可达到最大值，这与本试验中蚯蚓虫沙添加5.0%时鲤特定生长率达到最高较为一致。程静等 [2]在饲养草鱼的研究中报道，当添加6%蚯蚓粪时草鱼饲料系数最低，为1.35±0.11,其次为添加4%时，饲料系数为1.59±0.08，而本试验中添加5.0%蚯蚓虫沙时鲤饲料系数较低，为1.54±0.04，两试验结果也比较相近。刘波等 [10]报道，用添加5%蚯蚓粪的基础日粮饲喂异育银鲫，其增重率显著高于对照组，顾海林等 [7]研究表明，在基础饲料中添加38.86%蚯蚓粪及1.14%蚯蚓混合物配制成颗粒饵料，饲养尼罗罗非鱼，鱼产量与对照组相比可提高22.40%。本研究表明，饲料中添加5.0%晒干蚯蚓虫沙对鲤特定生长率和增重率有显著提高作用(P<0.05)，与上述研究结果一致。

本研究中探讨蚯蚓虫沙促进生长的内在作用原理，主要从蚯蚓虫沙的蛋白含量、蚯蚓虫沙含有的大量有益微生物及其分泌物、蚯蚓虫沙中有效磷与消化酶活性的提高和蚯蚓虫沙中含有腐殖酸五个方面进行探讨。

(1) 虽然蚯蚓虫沙因其含有一定量的蛋白质，比麦饭石、沸石粉等载体具有更高营养价值，但是本试验中所用蚯蚓虫沙蛋白质含量仅为3.81% [6]，且试验配方设计时各组试验饲料蛋白质和脂肪含量基本一致，所以蚯蚓虫沙蛋白质含量应不是导致鲤增重率和特定生长率差异的原因。

(2) 有研究认为，蚯蚓虫沙含有大量有益微生物及其分泌物 [1,15]，其可能会帮助鲤消化分解饵料，从而提高鲤的增重率和特定生长率，降低饲料系数。为了验证是否是蚯蚓虫沙中含有的有益微生物及其分泌物对鲤生产性能造成影响，本试验中C组所用蚯蚓虫沙经过烘箱120 ℃烘干1 h，在这个温度下蚯蚓虫沙中的微生物及其分泌物也基本全部失活。而从表4中可以看出，B2组与C1组同样添加5.0%的蚯蚓虫沙，两组饲料系数差异不显著(P>0.05)， B3组与C2组同样添加7.5%的蚯蚓虫沙，饲料系数差异也不显著(P>0.05)，所以蚯蚓虫沙中含有有益微生物及其分泌物也不应该是改善鲤生产性能的原因。

(3) 蚯蚓虫沙中含有效磷较多，在研究用蚯蚓处理鸡粪、农业副产品与工业废物混合物时，Garg等[16]指出，有效磷从1.4%增加到了6.5%。而本试验中蚯蚓虫沙仅含0.46%有效磷量，如果按照添加量5.0%计算，每千克饲料增加的有效磷含量可以忽略不计，所以蚯蚓虫沙中有效磷含量导致鲤生产性能的改善也不成立。

(4) 鱼类消化酶活性的提高，有益于其对营养物质的消化吸收，有利鱼类生长。邹青等[17]报道，添加蚯蚓虫沙能显著提高改良鲤中肠淀粉酶活性(P<0.05)，并极显著降低中肠脂肪酶活性(P<0.01)。蚯蚓虫沙有可能通过提高消化酶活性，最终提高鱼类生长性能，但本试验结果为蚯蚓虫沙对鲤消化酶活性基本无影响，饲料系数无显著性差异，这与之前研究的蚯蚓虫沙对罗非鱼饲料系数无显著性差异[6]结果较为一致，因此，说明本次试验中蚯蚓虫沙不是通过提高消化酶活性来提高试验鲤生长性能。

(5) 蚯蚓在吞食畜禽粪便时，畜禽粪便中的大量碳水化合物经过蚯蚓肠道内大量的消化酶、有益菌的作用，可以生成腐殖酸物质随粪便排出体外[18]。蚯蚓虫沙中所含腐殖酸物质随原材料及蚯蚓的活性的不同而不同。生化腐殖酸中含有微量元素、维生素、多糖等多种天然活性营养物质，可直接参与动物机体新陈代谢，促进腺体分泌，活化体内多种酶的活性，可改变细胞膜的通透性，增加动物摄食量和对养分的吸收利用，促进生长发育，改善生产性能[18]。本试验中所用蚯蚓虫沙含有的生化腐殖酸含量为17.86%，除2.5%添加量的B1组与对照组结果相近未表现出优势外，其他各组在增重率和特定生长率方面较对照组均有一定提高，饲料系数方面均有一定降低，有可能是其中腐殖酸起到一定作用。但目前蚯蚓虫沙对鱼类生长影响的调控机理尚不清楚，有待进一步深入研究。

3.3 蚯蚓虫沙对鲤血清和肝胰脏中抗氧化指标的影响分析

鱼类的抗氧化能力对其正常生长和发育有重要影响，机体抗氧化物质含量及抗氧化酶活力可反映动物体的健康状态。总抗氧化能力是用于评价动物机体抗氧化系统功能的综合性指标[19]。MDA是脂质过氧化的终末代谢产物，其含量是评价组织和细胞中脂质氧化损伤程度的重要指标。作为鱼类非特异性免疫系统中重要的酶类，T-SOD在一定程度上可反映鱼类免疫能力强弱[20]。目前，有关蚯蚓虫沙和蚯蚓对鱼类免疫作用影响的报道尚少，程静等[2]研究表明，饲养草鱼时添加7.5%～10.0%蚯蚓可显著提高其血液SOD活性，尤其7.5%蚯蚓组效果最优，而蚯蚓粪对草鱼的血清免疫指标无显著影响，在一定程度上表明添加蚯蚓有助于提高草鱼免疫能力。刘石林等[21]报道养殖凡纳滨对虾时，添加一定量的蚯蚓可使其血清中酚氧化酶活力、血细胞数量和抗菌活力显著提高，其生长速率也显著提高。另外，姚东林等[8]指出，随蚯蚓添加量的不同，杂交鳢血清超氧化物歧化酶活性随之波动，尤其添加7.5%的蚯蚓浆时SOD活性最高。本试验中鲤肝胰脏中总抗氧化能力指标在添加蚯蚓粉的D组较其他未添加蚯蚓粉组相比显著提高(P<0.05)，这与上述等人的研究结果较为一致。与之前试验已报道蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼血清抗氧化指标无影响[6]不一致，可能是试验鱼种类不同的原因。

分析蚯蚓粉和蚯蚓粪可提高鲤免疫能力原因，有报道表明，腐殖酸中的黄腐酸有免疫增强剂的功能，高金岗等[22]报道生化黄腐酸可对小鼠机体非特异性免疫有一定促进作用，丁桂凤等[23]的研究也表明，黄腐酸能够使淋巴细胞、巨噬细胞功能活化，从而使免疫功能增强。本试验中，鲤血清中T-AOC各组均未有明显差异，但肝胰脏中T-AOC、T-SOD和MAD均随着蚯蚓虫沙添加量的不同而变化，试验组肝胰脏中T-AOC、T-SOD指标较对照组均有较大幅度的提高，D2组T-AOC较对照组提高了222.9%， D1组T-SOD较对照组提高了102.9%、丙二醛含量较对照组降低了32%，这与高金岗等[22]、丁桂凤等[23]对黄腐酸能够增强机体免疫机能的研究结果相一致。因此，有可能是蚯蚓虫沙中的腐殖酸对鲤起到了增强免疫的作用。另外，蚯蚓粉富含多种营养物质(如各种维生素、微量元素及生物活性酶抗菌肽等)[2]，也可能是这些营养物质的作用提高了鲤肝胰脏免疫能力，与添加蚯蚓相比，蚯蚓虫沙营养物质种类相对缺乏，所以本试验中添加蚯蚓粉的D组鲤肝胰脏中T-AOC指标，与其他仅添加蚯蚓虫沙组相比有显著提高。

4 结论

本研究中对蚯蚓虫沙微量元素和重金属含量安全进行了评估分析，证明本次蚯蚓虫沙添加到鲤饲料中用量安全。本试验中添加蚯蚓及蚯蚓虫沙的各试验组在终末尾重、增重率、特定生长率方面较对照组均有不同程度的提高，在饲料系数方面试验组较对照组有不同程度的降低，但未达到显著水平(P>0.05)，仅添加5.0%晒干蚯蚓虫沙组较对照组在终末体质量、增重率、特定生长率方面均有显著性提高(P<0.05)；不同添加量的蚯蚓虫沙对鲤肠道消化酶无显著性差异(P>0.05)；饲料添加蚯蚓虫沙能够显著提高鲤血清、肝胰脏中超氧化物歧化酶水平和降低丙二醛含量(P<0.05)。

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