高腰海胆胚胎及幼体发育过程

高腰海胆Mespilia globulus又称蓝礼服海胆、短刺海胆，隶属于棘皮动物门Echinodermata、海胆纲Echinoidea、正形目Centrochinotda、刻肋海胆科Temnoplearidae、Mespilia属，自然分布于太平洋西南沿岸和印度洋等海域[1-2]。高腰海胆外壳间步带区有5个宽的蓝色纹理，棘刺红白相间或褐白相间，极具观赏价值。此外，饲养于海水水族缸中的高腰海胆还能清除附着于缸壁、珊瑚石及沙底中的硅藻和细菌等，有益于水族缸的净化。

在海水水族市场，高腰海胆的需求量较大。目前，市场上的高腰海胆均自然捕捞于印度洋等海域，之后空运至各目的地。经长途运输后高腰海胆成活率较低，且运输成本较高。为缓解自然资源的采捕压力，解决运输成本高和运输后成活率低等问题，开发高腰海胆的人工繁育技术极其重要。由于高腰海胆不是可食种类，关于其繁育的研究相对较少，仅见Kobayashi[2]研究了高腰海胆的产卵周期，Kitazawa等[3]对高腰海胆早期发育期间所具有成胆特点的形态发生进行了研究。目前，关于高腰海胆的胚胎和幼体发育及人工育苗技术国内外尚未见报道。本试验中，首次对高腰海胆的胚胎和幼体发育进行了研究，旨在为其人工繁育提供数据资料。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用亲胆于2017年7月购自辽宁省大连市水族市场，亲胆壳径为3～4 cm，活力好表面无损伤。亲胆运至大连海洋大学农业农村部北方海水增养殖重点实验室暂养，暂养水温为(25.0±1.0)℃，盐度为29～31，暂养期间投喂马尾藻，24 h不间断充气，每日全量换水1次，自然光周期。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的获得与观察采用注射KCl溶液法[4]，视亲胆大小分别从围口膜处向体腔内注射0.5～1.0 mL 0.5 mol/L的KCl溶液进行催产。分别收集精子和卵子后，在卵液中加入适量精子轻轻搅动进行授精。授精后取样，显微镜下观察受精卵的变化，并测量受精率。受精率计算公式为

受精率=2细胞数量/总卵数量×100%。1.2.2 胚胎和幼虫发育观察受精卵于25～26 ℃下孵化，孵化密度为20～30 ind./mL。胚胎发育到纤毛囊胚期后上浮于水面，此时用虹吸法吸取上层胚胎移入幼体培育池进行培育。选优后的胚胎发育至棱柱幼体时期，投喂牟氏角毛藻Chaetoceros muelleri，棱柱幼体、二腕幼体和四腕幼体期每日投喂量为5000～10 000 cells/mL，六腕幼体和八腕幼体时期每日投饵量逐渐增加至15 000～25 000 cells/mL。浮游幼体培育过程中，幼体密度为0.3～0.5 ind./mL，水温为25～26 ℃，盐度为29～31，微量充气。培育期间在显微镜下拍摄胚胎及幼体，确定各胚胎和幼体期的发育时间，观察胚胎和幼体的主要特征，并测量尺寸。各期胚胎和幼体发育时间以随机样本中出现50%为准。

2 结果与分析

2.1 人工催产与受精

亲胆采用注射法催产，经催产的亲胆在3 min内即能产卵或排精。经镜检精子活力较好，卵子饱满且色泽均匀。对7个视野下共计259个卵子的受精率进行统计，受精率为89.7%～94.3%，平均为92.3%±1.4%。

2.2 胚胎发育

生殖细胞:高腰海胆成熟卵细胞的卵径为(131.3±13.8) μm，卵呈椭圆形，具备较明显卵膜，属均黄沉性卵(图1-A)。精子长为20～30 μm，可分为头部、中段与尾部，头部前端顶体尖锐，中段短粗，尾部呈鞭状，长约15 μm。精子和卵子结合后在卵细胞周围举起一层薄的受精膜，精卵结合后卵径增大至(189.9±11.5) μm(图1-B)。

卵裂:受精卵经约60 min后进入卵裂期。卵裂为辐射卵裂，卵细胞中部凹陷，分裂成两个相同细胞(图1-C)，第一次卵裂1 h后进入第二次卵裂，受精卵分裂成4个大小相等的细胞(图1-D)。此后，每隔30 min胚胎发生一次分裂，经历8细胞期(图1-E)、16细胞期(图1-F)、32细胞期(图1-G)、64细胞期(图1-H)和128细胞期(图1-I)等。

囊胚期:受精卵历经约8 h进入囊胚期(图1-J)，囊胚期胚胎直径平均为(196.3±11.6)μm，2～3 h 后，静止囊胚脱去卵膜，开始旋转，在水中自由转动。

原肠期:受精卵经历15 h发育，胚胎进入原肠期(图1-K)。原肠期胚胎平均长度为(207.4±10.8)μm。

Note:The developmental stage is determined by the developmental characteristics of 50% individuals

2.3 幼体发育

棱柱幼体：在25～26 ℃水温下，卵细胞受精后约23 h发育至棱柱幼体。棱柱幼体体长为169.7～192.7 μm，平均为(180.6±11.5)μm，体表生有纤毛，幼体靠纤毛运动在水中旋转游动(图1-L)。

二腕幼体：在25～26 ℃水温下，受精卵经历1 d 14 h发育至二腕幼体(图1-M)。高腰海胆的二腕幼体整体呈三角锥形，且幼体反口端的“锥顶”部较为圆润。二腕幼体长为289.0～306.6 μm，平均为(298.9±9.1)μm。此时幼体消化道基本成形，胃部膨大呈椭圆形，口的上方可见口前纤毛环。此时可见幼虫依靠口前环纤毛的摆动进行摄食，食管开始蠕动，胃部和肠道有节律收缩。在二腕幼体后期，体长达306.6 μm，位于口叶中线的横枝凸起，顶端形成前侧腕的芽突。

四腕幼体：在25～26 ℃水温下，受精卵发育 2 d 10 h进入四腕幼体期(图1-N)。相较于二腕幼体，高腰海胆四腕幼体的口叶凸起，顶端又生出2个前侧腕，幼体前部原有的2个口后腕明显变长，腕连接处呈圆弧形，幼虫反口端的“锥顶”进一步圆润。四腕幼体体长为421.2～436.7 μm，平均为(430.6±14.1)μm，随着幼体的发育，前侧腕和口后腕逐渐变长，食道和肠胃也逐渐膨大、加厚。

六腕幼体：在25～26 ℃水温下，受精卵经历7 d 13 h进入六腕幼体(图1-O)，相较于四腕幼体，高腰海胆的六腕幼体前侧腕和口后腕间的口端面周缘生出2个后背腕。六腕幼体体长为590.2～697.0 μm，平均为(657.0±39.6)μm。由于幼体体长和体宽的增加，原有的2个口后腕进一步变长，且根部不再相连。幼虫反口端由锥形变为半球形，口后腕及新生的2个后背腕的根部及中部均逐渐加粗，胃部膨大成卵圆形，颜色变深，胃壁变厚。六腕幼体末期， 2个前侧腕根部内侧，即口叶中线的横枝上再次凸起，形成最后1对口前腕的芽突。

八腕幼体：在25～26 ℃水温下，受精卵经历9 d 18 h进入八腕幼体(图1-P、图1-Q)，相较于六腕幼体，高腰海胆的八腕幼体从前侧腕的内侧生出1对口前腕。八腕幼体体长为669.5～815.1 μm，平均体长为(710.4±56.3) μm。此阶段后背腕与前侧腕进一步加粗，使幼体体宽增加，几乎与体长相等。原六腕幼体半球形的反口端顶部凹陷，此处体壁内侧几乎与胃连接，同时反口端两侧突起2个肉褶，呈角状，外部有纤毛做急速旋转摆动，内部有骨针支撑。随着幼体发育，胃的一侧出现前庭复合体且不断增大。八腕幼体后期，反口端顶部凹陷处生出2个叉棘，口前腕和前侧腕开始缩短，前庭复合体进一步增大，将幼体的胃向一侧挤压，其内的初生管足开始蠕动。

稚胆：在25～26 ℃水温下，受精卵经历11 d进入稚海胆阶段(图1-R)。八腕幼体末期幼虫前庭复合体中的初生触手和初生棘都伸出体壁之外，使复合体内的口与外界相通，幼体结束浮游状态，变态成为稚海胆，开始附着生活，其原有的腕及体壁均分解至水中。稚海胆的口面位于原来幼体的左侧面，反口面位于原来幼体的右侧面。稚海胆壳径为(428.6±14.9) μm。稚海胆最初生出5只管足，并以管足在附着基上爬行。随后管足开始增多，可灵活伸缩，并能附着在基质上运动觅食，棘刺开始布满外壳。

3 讨论

3.1 高腰海胆的繁殖特征

本研究中，高腰海胆亲本为7月中旬获得，此时一直到9月初是高腰海胆的繁殖盛期[2]。Kobayashi[2]研究表明，日本濑户海域的高腰海胆排放精卵与月相盈亏紧密相关，在每月的满月和新月时是排放盛期。本研究中对获得的高腰海胆进行催产时发现，并非所有的海胆都能排放，解剖发现，不能排放的个体体内生殖腺较小，这表明此时有部分海胆已经完成排放。高腰海胆属正形目海胆，具有5个生殖孔，可同时排放生殖细胞。在产卵时，观察到雌海胆会将反口面一端的管足伸长，按照一定的节奏以生殖孔为圆心内外摆动，可将刚从生殖孔排出的聚在一起的生殖细胞搅散在海水中，这可能有利于排出的卵子尽快与精子结合，完成受精，高腰海胆此种产卵行为在其他海胆类中未见报道。高腰海胆成功受精后未释放极体，这与其他海胆类相同，极体在卵子排出前已经释放[5]。

3.2 高腰海胆的胚胎和幼体发育特征

在水温为25～26 ℃条件下，高腰海胆进入囊胚期、原肠期的时间分别为8 h和15 h，此发育速度与常亚青等[6]报道的冷水性光棘球海胆Mesocentrotus nudus和中间球海胆S.intermedius在16 ℃水温下的发育速度相近(光棘球海胆囊胚期、原肠期时间分别为5.5～10 h、15 h，中间球海胆分别为5～11 h、18 h)，并且与暖水性的白棘三列海胆Teipneustes gratilla在25.8～27.5 ℃水温下的发育速度相近(囊胚期时间5～9 h)[7]，而较暖水性的紫海胆Heliocidanris crassispina在28.5～30.4 ℃下的胚胎发育速度慢(囊胚期时间为4 h)[8]。就幼体发育速度来说，高腰海胆发育至四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体时间分别为2 d 10 h、7 d 13 h和9 d 18 h，此发育速度，尤其是六腕幼体后的发育速度快于18 ℃水温下光棘球海胆和中间球海胆(前者发育至四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体的时间分别为1 d 2 h、8 d 16 h、19 d 1 h，后者分别为1 d 3 h、9 d 18 h、21 d 2 h)[9]，并且较白棘三列海胆在25.8～27.5 ℃水温下的发育速度也快(发育至四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体的时间分别1 d 16 h、12 d、13 d)[7]，而较紫海胆的发育速度慢(发育至四腕幼体、六腕幼体、八腕幼体的时间分别22 h、2 d 10 h～3 d 8 h、5～8 d)[8]。

除了种类差异带来的不同，海胆胚胎和浮游幼体的发育速度与水温、营养状况、培育密度等外部条件也紧密相关。由于上述研究和本研究中海胆的幼体均能正常发育至稚海胆，因此，可认为上述研究和本研究中的培育条件均为适宜。基于以上比较可见，虽然高腰海胆胚胎发育速度较慢，但是幼体发育速度较快，尤其是六腕幼体后期至变态为稚海胆，高腰海胆仅用了4 d时间，而冷水性的光棘球海胆和中间球海胆则分别用了10 d 9 h和11 d 8 h[9]，暖水性的紫海胆和白棘三列海胆则分别用了8 d左右[10]和12 d[7]，因此，高腰海胆的胚胎和幼体发育速度存在一个由慢变快的过程。高腰海胆各期幼体的体长与已有报道的高腰海胆[3]、紫海胆[10-11]、中间球海胆[11-13]等相近，说明海胆幼体长度在种间差异不大，而可能主要与营养状况、培育密度等外部条件关系较大。

4 结论

本研究中探讨了高腰海胆人工催产、采卵、受精及幼体培育技术。研究表明，在25～26 ℃的水温和0.3～0.5 ind./mL的培育密度下，通过适量投喂海胆浮游幼体培育常用的牟氏角毛藻，完全可以在室内对高腰海胆进行人工育苗。由于高腰海胆幼体发育速度快、浮游期短，其人工育苗生产较其他种类的海胆更为容易，这对于开发该物种的人工养殖，缓解其自然资源的采捕压力，以及解决水族市场上该种运输成本高和运输后成活率低等问题十分有利。本研究结果将为高腰海胆引种、人工繁育和养殖技术提供参考。

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