魁蚶加工副产物酶解工艺及酶解产物抗氧化效果研究

魁蚶Scapharca broughtonii俗称赤贝、血贝等，是中国北部沿海一种大型海洋底栖经济贝类，在中国东海、渤海、黄海及日本海等海区也有广泛分布[1]。研究表明，魁蚶组织干基蛋白质含量大于70%，脂肪含量低，氨基酸、维生素、矿物元素含量丰富[2]。近年来，因其重要的经济价值，已成为山东省大力开发的新型贝类资源，2016年中国海水蚶类养殖总量为3.64万t，占当年贝类养殖总量的2.68%。魁蚶斧足部呈橘红色或橘黄色，营养丰富，常被加工为蝴蝶状贝肉，而其加工副产物(裙边及内脏团等约占全组织鲜质量的60%左右)多被丢弃，未得到充分利用。目前，开发科技含量高的海洋生物产品，尤其是海洋生物资源高值利用已成为食品科学、医药科学等领域的研究热点。

酶解技术是发掘天然产物资源的一项重要工艺手段，通过选择性的可控酶解，可释放许多生物活性功能被掩盖或被多种共存杂质干扰的多肽类水解产物，表现出各种生理活性，如抗病毒、抗癌、抗氧化、抗高血压、免疫调节、激素调节、抑菌、降胆固醇等作用[3]。不同蛋白酶制备的抗氧化肽的构效不同。Kim等[4]利用多种蛋白酶酶解废弃鱼皮制得不同构效的抗氧化肽；杨涛等[5]利用碱性蛋白酶酶解海参内脏制得的海参多肽具有较高的抗氧化性。因此，对魁蚶加工副产物进行适当处理，并根据其营养成分研发水产饲料或水产调味品等高附加值产品，可高效利用海洋资源，避免副产物对环境的污染。本研究中，通过最适蛋白酶筛选试验、单因素试验和响应面试验，探索并优化魁蚶加工副产物酶解条件，并对优化后酶解产物进行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny-1-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基、超氧阴离子自由基

和羟自由基(·OH)清除率等反映抗氧化水平的指标分析，探究了酶解产物的抗氧化效果，以期为后续利用其开发功能性水产饲料或水产调味品提供研究基础，同时实现高效利用魁蚶加工副产物、提高魁蚶产品附加值的目的。

1 材料与方法

1.1 材料

魁蚶浆：试验用魁蚶裙边及内脏团购自青岛即墨某魁蚶加工厂，清除其杂质，洗净，高速(3000 r/min)匀浆即为魁蚶浆。

试验试剂：肽标准品杆菌肽(相对分子质量为1422.69)购自德国LGC GmbH实验室；乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(相对分子质量为189.1)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(相对分子质量为451.2)、抑菌肽(相对分子质量为6511)、细胞色素C(相对分子质量为12 355)均购自德国Biosun 公司；其他试剂均为分析纯，酶制剂信息见表1。

试验仪器及设备：紫外分光光度计(UV-2450)购自日本岛津公司；滴定仪(ET18) 购自瑞士梅特勒托利多仪器公司；自动凯氏定氮仪(KT8400)购自丹麦(FOSS)仪器公司；真空冷冻干燥设备(FD-10)购自北京博医康医学设备有限公司；高效液相色谱仪(LC-20A，带GPC软件)购自日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 指标的检测与计算

(1)蛋白酶活力、总氮含量、氨基态氮含量测定。采用蛋白酶活力法(GB1886.174—2016)[6]测定蛋白酶活力；采用凯氏定氮法(GB 5009.5—2016)[7]测定总氮含量；采用酸度计法(GB5009.235—2016)[8]测定氨基态氮含量。水解度计算公式为

水解度(DH)=水解液中氨基态氮含量/样品中总氮含量×100%。

(2)抗氧化指标测定。将最佳工艺条件下获得的酶解产物冻干，设置不同浓度(0.01～0.50 mg/mL)的VC作为阳性对照，按照文献[9-11]的检测方法，对比不同浓度(1.0～5.0 mg/mL)酶解产物清除DPPH自由基

和·OH效果，进而评价产物的抗氧化能力。

(3)酶解液中肽相对分子质量分布。参考海洋鱼低聚肽粉高效凝胶过滤色谱法(GB/T 22729—2008)[12]测定肽相对分子质量。修正后的色谱条件如下：色谱柱为东曹(上海)生物科技有限公司的TSK gel G2000 SWXL(7.8 mm ×300.0 mm)；流动相为30%乙腈-水+0.1%三氟乙酸(CV)，超声脱气；检测器为紫外检测器(220 nm)；流速为0.5 mL/min；进样量为10 μL；室温检测时间为35 min。试验中利用GPC软件，以标准品分子质量(Y)与出峰时间(X)做3次方程拟合，计算各酶解液中肽相对分子质量分布。

1.2.2 酶解工艺流程采用不同料液比制备样品，根据不同试验条件调整加酶量、pH、温度等条件，酶解后沸水浴灭酶10 min，室温冷却，以8000 r/min离心10 min，取上清液待测。

1.2.3 最适蛋白酶筛选由于蛋白酶具有作用位点专一的特点[13]，不同蛋白酶水解位点不同，同一种蛋白质使用不同外源性蛋白酶进行酶解时，水解效果会有明显差异。本研究中选用碱性蛋白酶、风味蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶5种蛋白酶，在各种蛋白酶最适温度及pH条件下对其进行酶解，以水解液中氨基态氮含量和产物相对分子质量大小作为判断蛋白质水解程度的指标，确定水解的最适蛋白酶。酶解条件如表2所示。

1.2.4 酶解工艺单因素试验以碱性蛋白酶为单因素试验的研究对象，除要考察的因素重新设定外，其他因素均设定一致，即pH为9.0，反应温度为50 ℃，加酶量为800 U/g(样品)，反应时间为3 h，料液比(g∶mL，下同)为1∶3。

(1) 料液比的确定。在其他因素不变的条件下，分别考察料液比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5时对碱性蛋白酶酶解效果的影响。

(2) 酶解温度的确定。在其他因素不变的条件下，分别考察酶解温度为40、45、50、55、60 ℃时对碱性蛋白酶酶解效果的影响。

(3)pH的确定。在其他因素不变的条件下，分别考察反应pH为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0时对碱性蛋白酶酶解效果的影响。

(4) 酶解时间的确定。在其他因素不变的条件下，考察酶解时间为0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h时对碱性蛋白酶酶解效果的影响。

(5)加酶量的确定。在其他因素不变的条件下，分别考察加酶量为200、400、600、800、1000、1200 U/g时对碱性蛋白酶酶解效果的影响。

1.2.5 响应面优化试验在单因素试验基础上，根据响应面软件Degin Expert 8.0中 Box-Benhnken中心组合试验设计原理[14]，综合考虑单因素影响试验结果，以水解度为响应值，采用5因素3水平的响应面分析方法进行试验设计，试验因素水平及编码见表3。

1.3 数据处理

试验结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 18.0 统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVN)，采用LSD法进行组间多重比较，显著性水平设为0.05，极显著水平设为 0.01。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶筛选结果

从图1可见：碱性蛋白酶的酶解程度最高，酶解液中氨基态氮含量可达 0.27 g/100 mL，与风味蛋白酶、酸性蛋白酶酶解液中的氨基态氮无显著性差异(P>0.05)；胰蛋白酶酶解液中氨基态氮含量最低，为 0.17 g/100 mL，极显著低于其他4组(P<0.01)。5种蛋白酶的水解能力从大到小依次为碱性蛋白酶>风味蛋白酶>酸性蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶。

2.2 酶解产物中相对分子质量分布

根据图2中肽标准品GPC计算标准曲线图，拟合标准方程为

Y=2.656273e-3X3-0.1478131X2+2.445461X-8.57143(R2=0.9989)。

利用该方程计算不同蛋白酶酶解产物中肽段分布结果如表4所示。

由表4可知，未酶解的原液相对分子质量在6511～12 355有明显分布，经过酶解后，这一分子段的分子除中性蛋白酶外，其余几乎为零，说明不同蛋白酶对这一分子段的蛋白进行解链降解程度不同。这可能是不同蛋白酶对肽键的专一性不同，导致不同蛋白酶的水解能力不同，从而使酶解后肽相对分子质量分布有所差别。各产物中含有大量小分子肽(相对分子质量189～6511)和氨基酸(<189)，其中,碱性蛋白酶酶解产物中小分子肽含量最高，达68.92%，比小分子肽含量最低的中性蛋白酶酶解产物(54.17%)高14.75%；胰蛋白酶酶解产物中小分子肽含量次之，为68.32%。研究表明，该相对分子质量较小的肽段有利于水产动物的吸收，同时具有免疫调节的功能[12]，如抗菌、抗氧化等活性。根据水解度和相对分子质量大小，后续试验重点研究碱性蛋白酶的酶解效果和工艺参数。

2.3 料液比对酶解效果的影响

从图 3可见：随着料液比的增加，氨基态氮含量呈先升高后降低的趋势；当料液比为1∶3时，氨基态氮含量达到最高，为0.26 g/100 mL；当料液比为1∶5时，氨基态氮含量达到最低。这是因为酶与底物的结合程度会受到料液比的影响，从而进一步影响到蛋白酶的水解效果，当料液比过低时，反应液的流动性不高，酶和底物结合不充分，不利于反应；而酶促反应速度与酶分子的浓度成正比，当料液比过高时，酶浓度较低，酶促反应速度下降。实际生产中，料液比太大会增加浓缩成本的投入，综合考虑，在本试验条件下，料液比为1∶3时酶解效果最佳。

2.4 反应温度对酶解效果的影响

从图4可见：随着温度的升高，氨基态氮含量呈先升高后降低的趋势；50 ℃时，氨基态氮含量达到最高，为0.21 g/100 mL；当温度从40 ℃升高到50 ℃时，氨基态氮含量较 40 ℃时上升18%左右，当温度从50 ℃升高到60 ℃时，氨基态氮含量的变化开始呈现下降的趋势，下降14.50%。说明温度对碱性蛋白酶酶解效果影响较大，这是因为蛋白酶实质上是一种蛋白质，在温度过高或过低条件下，都会影响蛋白酶的活性甚至使其失活，从而影响反应速度及反应效果[13]。因此，本试验条件下，最佳酶解温度为50 ℃。

2.5 pH对酶解效果的影响

从图5可见：当pH值从8.0上升到9.0时，氨基态氮含量呈现上升趋势；当pH值为9.0时，氨基态氮含量达到最高，为0.24 g/100 mL；而当pH值从9.0继续上升时，氨基态氮含量则开始下降。这是因为pH可直接对酶和底物蛋白分子的某些基团的结合、反应状态产生作用，从而影响蛋白酶的水解效果。因此，本试验条件下，最适酶解pH为9.0。

2.6 反应时间对酶解效果的影响

从图6可见：水解液中的氨基态氮含量随水解时间延长而升高，这是由于在碱性蛋白酶的作用下，时间越长将底物中蛋白质水解成小肽和氨基酸等成分越充分；反应0.5 h时，氨基态氮含量为0.13 g/100 mL， 3 h时上升了61.5%，为0.21 g/100 mL，水解4 h时氨基态氮提高速度明显减小，仅比3 h时上升了1%，这是由于随着酶解时间的延长，蛋白酶活力逐渐降低。考虑时间与得率成本，本试验条件下最适酶解时间为3 h。

2.7 加酶量对酶解效果的影响

从图7可知，随着加酶量的增加，氨基态氮含量持续升高，当加酶量超过800 U/g时，通过增加酶量来提高氨基态氮含量是不经济的。试验结果说明，蛋白水解过程中加酶量要控制适当，加酶量过少，氨基态氮含量不能实现设定目标；加酶量过高，则会增加酶用量成本。考虑经济成本因素，本试验条件下碱性蛋白酶最适添加量为800 U/g。

2.8 响应面试验结果

响应面试验的因素水平及对应的试验结果如表5所示。使用Design-Expert 8.0.6软件对表5试验数据进行多元化拟合，获得响应值水解度DH对自变量料液比(A)、pH(B)、温度(C)、加酶量(D)、酶解时间(E)的多元回归模型方程为

DH=25.45+0.29A-0.17B-0.59C+0.63D+

3.92E+0.023AB+0.18AC-0.12AD+

0.31AE+1.04BC-0.19BD-0.68BE+

0.61CD-1.09CE+0.39DE+0.26A2-0.60B2+0.40C2+0.14D2-0.20E2。

由表6可知，二次多项式模型的F值为11.13，P<0.0001，模型整体为显著水平，说明建立的模型与试验数据契合较好。模型的决定系数为0.902 7，表明模型中的数据仅有9.73%不能被模型拟合[15]。

失拟检验F=0.3961，P>0.05，表明模型与实际情况拟合较好，可用此模型对试验进行分析和预测。

从表6可见，酶解时间是回归模型的极显著影响因素(P<0.0001)，温度、加酶量是回归模型的显著影响因素(P<0.05)，料液比、pH因素无显著性影响(P>0.05)，各交互项及二次项也无显著性影响(P>0.05)。

酶解温度是显著影响因素，意味着酶解时的温度变化会对酶解效果产生较大影响。这是由于温度不仅影响酶解过程，而且影响酶活性。当温度高于45 ℃时，酶解速率降低，导致水解度降低，可能是酶自身热失活所致。相似的试验结果在一些以食品蛋白源作为底物被酶解时也被观察到，如Kurozawa等[16]用碱性蛋白酶水解鸡胸肉时，发现酶解温度高于50 ℃时，蛋白水解度和蛋白回收率均降低。Bhaskar等[17]用碱性蛋白酶水解卡特拉鱼的内脏蛋白时，同样发现温度高于50 ℃时，酶解度降低。

酶解时间是极显著影响因素，意味着酶解时间变化会对酶解效果产生极大影响。这是由于在试验水平范围内随着酶解时间的延长，酶与蛋白质反应越充分，水解度就越高。加酶量是显著影响因素，意味着加酶量变化会对酶解效果产生较大影响，这是由于在试验水平范围内加酶量越大，单位时间内蛋白质水解速率越快，水解程度就越好。

2.9 验证性试验

根据响应面设计软件对试验数据分析,得出5个影响因子的最优化组合为：料液比1∶3.95、pH 8.5、温度45 ℃、加酶量799.45 U/g、酶解时间3 h，根据模型(1)计算出在此最优条件下的水解度为33.8%。考虑实际试验操作方便性和可行性，将理论值修订为料液比1∶4、pH 8.5、温度45 ℃、加酶量800 U/g、酶解时间3 h，在此条件下进行3次平行试验，实测水解度(DH)为(35.74±0.14)%，与理论值较为接近，表明模型能较好地预测酶解效果。在此最优酶解条件下，本研究中得到的水解度高于银鲫骨(22.73%)[18]，但低于鱼类可溶性浓缩物(50%)[19]，水解度的差异可能是由于蛋白质和酶的类型差别导致的。

Note: *means significant effect(P<0.05)；** means very significant effect(P<0.01)

2.10 酶解产物的抗氧化能力

在最优酶解条件下制得的酶解产物与不同浓度VC的抗氧化效果对比如图8所示。从图8可见：不同浓度的酶解产物对DPPH自由基

和·OH均有清除效果，并与酶解产物浓度呈正相关关系；其中浓度为5.0 mg/mL的酶解产物可清除90%的DPPH自由基，与浓度为0.30 mg/mL VC的抗氧化效果接近；浓度为3.0 mg/mL的酶解产物对

的清除效果约为0.10 mg/mL VC的73.68%；浓度为5.0 mg/mL的酶解产物对·OH的清除效果明显优于0.50 mg/mL VC。综合比较分析得出，该酶解产物的抗氧化能力与十分之一用量的VC相当。

碱性蛋白酶的酶切位点为疏水性氨基酸，可使酶解底物中的蛋白质水解产生大量的丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)等疏水性氨基酸；同时Suetsuna等[21]研究表明，抗氧化肽链终端含有Ala、Leu，易与自由基结合产生良好的抗氧化活性。因此，魁蚶加工副产物碱性蛋白酶酶解液具有较好的自由基清除效果，可用于抗氧化活性物质的制备。

3 讨论

3.1 最适蛋白酶对酶解效果的影响

结合本试验结果，通过文献对比，发现不同贝类酶解最适蛋白酶的种类并不相同，即使是同一种贝类、同一评价指标，不同报道中也会出现不同种类的最适酶[20-28]。以牡蛎[29-34]为例，报道中最适酶的种类涵盖了海产品专用蛋白酶、枯草杆菌中性蛋白酶、复合酶、Protease M酶、碱性蛋白酶、537酸性蛋白酶。这可能是因为不同种类的贝类组织结构不同，且不同种类酶的切割位点也不同，导致水解能力出现差异。碱性蛋白酶酶解产物中小分子肽含量最高，达70.47%，与魁蚶组织干基蛋白质含量高(大于70%)有关。碱性蛋白酶属于一种丝氨酸蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。毛蚶Scapharca subcrenata[35-37]最适酶解蛋白酶为碱性蛋白酶，这与本试验结果一致，可能是魁蚶和毛蚶同属蚶类，蛋白质结构与种类相似。此外，在酶种类的应用中，复合酶的使用多有报道，而本试验中只针对单一酶解条件进行了研究，在后续探索中可对复合酶解条件进行探索。

3.2 酶解条件对工艺参数的影响

在酶解温度方面，大多数酶解温度都集中在40～60 ℃，说明酶解最适温度均较为温和，这也与吴园涛等[37]的研究结果一致，而本试验中优化得到的最适温度也符合这一结论。在料液比方面，大多数报道中并未给出明确料液比，或未将料液比作为讨论因素之一，而本试验中则将包括料液比在内的6种影响水解程度的因素都进行了试验，并针对除蛋白酶种类外的5种因素进行了响应面设计试验，与大多数应用响应面方法的报道[18-19,26,30]相比，讨论的因素更为全面。在pH方面，除酸性、碱性蛋白酶外，多数报道均在中性条件下或自然pH下进行，而本试验中所确定的最适pH也符合碱性蛋白酶所适合的碱性环境。在加酶量方面，本试验中测定了5种试验用酶的酶活，与商品标注的酶活有差异，加酶之前测定酶活必不可少。许庆陵等[32]使用添加量为13.34 mkat/L(换算为8004 U/L)的碱性蛋白酶酶解牡蛎，获得水解度为40.38%，高于本试验结果(35.74%)，可能原因与其酶用量是本试验的10倍且酶解原料不同有关。张超等[26]报道使用碱性蛋白酶(酶活20万U/g)酶解扇贝边获得水解度为30.1%，低于本试验结果，但由于加酶量单位不一致，导致无可比性。还有部分报道[21,24,26,40,34-36]采用百分比的形式(酶添加量为0.75%～7.88%)表示加酶量，但这样表示可能会由于样品蛋白酶酶活力不同而出现不同的试验结果，而采用U/g(样品)的形式则可以避免这个问题。水解程度也用不同结果来表示，如氨基态氮[23,29]、蛋白质回收率[33]和水解度[24,30,38-40](25.73%～46.10%)。本试验中优化所得加酶量明显低于其他报道[21-25,31,34,41](多集中在1700.00～4013.47 U/g)，从经济角度来考虑，如果进行工业化生产低成本饲料时，利用魁蚶加工副产物更有成本优势。付晶晶等[25]的酶解时间显著低于其他试验结论，这是由于在其酶解过程中应用了超声处理。因此，在后续优化探索中，也可将超声处理作为一个酶解因素进行深入探究，从而提高水解度，优化水解效果。

4 结论

本研究中根据酶解产物中小肽分布情况，筛选碱性蛋白酶作为魁蚶加工副产物酶解的最佳用酶，在单因素试验基础上运用响应面分析方法对酶促水解制备多肽工艺参数进行优化分析，并构建了相应的数值模型，同时对模型进行了回归与方差分析，并对最优条件下的酶解液进行抗氧化能力检测。结果表明，响应面优化方案为料液比为1∶3.95、pH为 8.5、温度为45 ℃、加酶量为799.45 U/g、酶解时间为3 h，根据模型计算出水解度为33.8%。在此优化条件下修订验证试验条件为料液比1∶4、pH 8.5、温度45 ℃、加酶量800 U/g、酶解时间3 h，平均水解度为35.74%，与模型预测值接近，偏差为1.94%。抗氧化能力检测表明，酶解产物具有清除DPPH自由基、超氧自由基和羟自由基的能力，其抗氧化能力与十分之一用量的VC相当。后续可进行抗氧化肽的分离制备，提高其效价。

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