含量显著高于对照组(P<0.05)，而
和TP含量则与对照组无显著性差异(P>0.05)；试验组青蛤存活率、壳长、湿体质量均优于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。研究表明，本研究中制备的饵料微藻缓释饼具有较高的生态安全性，可用于海水贝类养殖中。摘要:为应对近岸海域褐潮频发及贝类养殖密度过大而导致的饵料微藻丰度不足的现象，以小球藻Chlorella与螺旋藻Spirulina混合藻粉、海藻酸钠、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis等为原料制作成规格适中、黏性适宜的饵料微藻缓释饼，并开展了饵料微藻缓释饼对青蛤Cyclina sinensis养殖的应用效果研究。结果表明：试验组的饵料微藻缓释饼在青蛤池塘中可缓释15 d左右，相比于未使用饵料微藻缓释饼的对照组，试验组青蛤养殖池塘水体中以原甲藻Prorocentrumsp.、鼓藻Cosmariumsp.、隐藻Cryptomonassp.和纤维藻Ankistrodesmussp.为主的浮游植物优势种密度显著增加(P<0.05)，浮游植物生物最高达到15.0 mg/L；试验组水体NH3-N含量前期(1～6 d)下降趋势明显，由0.99 mg/L下降至0.68 mg/L，后又小幅上升，对照组则变化不大；试验组间含量显著高于对照组(P<0.05)，而和TP含量则与对照组无显著性差异(P>0.05)；试验组青蛤存活率、壳长、湿体质量均优于对照组，但无显著性差异(P>0.05)。研究表明，本研究中制备的饵料微藻缓释饼具有较高的生态安全性，可用于海水贝类养殖中。
2016年中国海水贝类养殖产量占中国海水养殖总产量的72%以上，然而大规模的高密度养殖导致养殖贝类放养密度远远超过近岸海区的贝类养殖容量，进而导致养殖贝类规格降低、养殖产量下降，影响贝类养殖产业整体经济效益[1-3]。近年来，渤海近岸海域频繁暴发的褐潮对中国海水贝类养殖业亦造成较大冲击[4-6]。以抑食金球藻Aureococcus anophagefferens为主要藻种引起的褐潮严重抑制了海水贝类摄食，同时在褐潮暴发期间也抑制其他藻类正常生长[7]。毕相东等[7]、张达娟等[8]研究发现，小球藻Chlorella、三角褐指藻Phaeodactylum tricornutum等藻类对于抑食金球藻的生长具有显著的抑制作用。为此，已有养殖技术人员试图采用饵料微藻浓缩液或鲜藻泥等置于贝类养殖环境中进行应急处理，但受应用成本及养殖环境水流过强等诸多因素影响，导致其未能规模化应用。
目前，中国海水贝类养殖业亟须开发出低成本、高营养、抗冲刷的滤食性养殖贝类饵料，以及养殖贝类的精准投喂技术，从而促进中国海水贝类养殖业健康可持续发展。对青蛤养殖的研究主要集中在生物学及其繁殖技术等方面[9-11]，为此，本研究中依据滤食性贝类摄食习性[12]及缓释材料相关理论，以饵料微藻藻粉为主要原材料开发制备饵料微藻缓释饼，并经前期实验室模拟试验筛选出最适宜的投放方式后将其应用于青蛤养殖池塘中，并对养殖池塘中浮游植物群落结构特征、相关水化学特征、青蛤生长指标等进行监测，旨在验证饵料微藻缓释饼的实际应用效果及其生态安全性，以期为饵料微藻缓释饼在贝类养殖中的应用提供参考。
制备饵料微藻缓释饼主要材料：小球藻Chlorella与螺旋藻Spirulina混合藻粉(比例为1∶1)、芽孢杆菌粉Bacillus subticis和豆粕粉，均购自天津现代晨辉科技集团有限公司；海藻酸钠购自青岛明月海藻集团有限公司；氯化钙(分析纯)购自天津市华鑫有限公司。
1.2.1 饵料微藻缓释饼的制备 将小球藻与螺旋藻混合藻粉、豆粕粉、芽孢杆菌粉和海藻酸钠按照8.00∶1.80∶0.12∶0.08比例混匀，加入适量0.35%氯化钙溶液制成黏性较强的团状混合料，后经模具压制成型并切割成长×宽×高为10 cm×5 cm×5 cm、质量约为0.25 kg的长方体饵料微藻缓释饼(图1)。
图1 饵料微藻缓释饼模型图及模具图
Fig.1 Model and mold drawing of a microalga slow-release cake
1.2.2 饵料微藻缓释饼投放 将饵料微藻缓释饼装入不同网目大小的网袋中，其中，试验组设置60目、80目和100目3种网袋，对照组未使用网袋，将4组样品放入盛有海水的容器中，将容器置于转数为30 r/min的摇床中，用干重法每3 d记录一次，记录至第15天，筛选合适的投放方式(即网袋网目)。根据筛选出的最合适投放方式，将一块饵料微藻缓释饼装入网袋中，再将网袋系于竹竿上，以5 m为间隔距离将竹竿均匀插入池塘并使饵料微藻缓释饼浸没于水中使其缓释。试验在天津大港地区青蛤养殖池塘(长×宽为200 m×100 m，水深为2 m)，青蛤投放密度约为80粒/m2。试验期间池塘水表层温度为(23±2)℃。
1.2.3 浮游植物群落结构分析与水质测定 将筛选出的投放适宜目数网袋饵料微藻缓释饼作为试验组，在试验组和对照组青蛤养殖池塘中各设置3个采样点，每3 d进行1次采样，时间为10:00—11:00，连续进行6次采样。采集的水样用便携式冷藏箱保存，及时送回实验室检测分析。种类鉴定参照GB12713.6—2007中的方法，以浮游植物种类鉴定、计数等统计数据为基础，对每次调查池塘中水生浮游植物进行进一步分析。分别采用锌镉还原法、重氮—偶氮比色法、纳氏试剂比色法、钼酸铵分光光度法测定水质指标
(GB 7493-87)、NH3-N(GB 7479-87)和TP(GB/T 11893-1989)含量。
1.2.4 青蛤生长性能测定 试验结束后，从试验组和对照组池塘中随机抽取300枚青蛤进行青蛤壳长和湿体质量的测定及存活率的计算。
1.2.5 浮游植物密度和优势度计算 水体中浮游植物数量(N)和优势度(Y)计算公式为
N=SC/(SF×nF)×V/VC×nP，
(1)
Y=(ni/N)×fi。
(2)
其中：SC为计数框面积(mm2)；SF为 每个视野的面积(mm2)；nF为计数过的视野数；V为1 L水样经沉淀浓缩后的体积(mL)；VC为计数框的体积(mL)；nP为计数出的浮游植物数量；ni为样品中第i种物种的数量；N为样品中所有种类的总个体数量；fi 为第i种在站点或月份出现的频率。优势度(Y)大于0.02的种类被认定为浮游植物优势种。
试验数据用SPSS 18软件进行统计分析，采用t检验进行组间多重比较，显著性水平设为0.05。
饵料微藻缓释饼为长方体(长×宽×高为 10 cm×5 cm×5 cm)，颜色呈墨绿色(图2)，在未接触水体前呈黏性适中状，投入水体后黏性增大。制作完成的藻饼需在0 ℃下保存以防止其腐败。根据试验设计的投放方式，每块饵料微藻缓释饼在池塘中的理论缓释效应面积约为20 m2。
试验期间，试验组与对照组饵料微藻缓释饼的缓释情况如图3所示。鉴于水流因素对饵料微藻缓释饼缓释的影响，对其进行套袋处理寻求最佳投放方式，经过模拟海流试验研究发现，对照组(无网袋)缓释效果极为明显，试验进行第3天时其质量已减少一半，试验进行至第9天时基本已完全缓释。对比3个试验组的缓释结果，100目网袋中饵料微藻缓释饼缓释速度最慢，试验进行至第15天时其质量由250 g减少至109 g；80目网袋中饵料微藻缓释饼缓释速度较为均一，且达到预计缓释15天的应用效果；60目网袋中饵料微藻缓释饼在试验进行至第12天时基本缓释完全(图3)。基于以上结果，结合贝类养殖生产特征，并考虑青蛤养殖池塘中水流流速与相较于海流较慢等因素，60目网袋下饵料微藻缓释饼的缓释效果更符合养殖池塘实际应用。
图2 制作的饵料微藻缓释饼成品图
Fig.2 Prepared product of a microalga slow-release cake
图3 不同网目网袋饵料微藻缓释饼的缓释情况
Fig.3 Slow-released situation of a microalga slow-release cake in different mesh bags
根据对青蛤养殖池塘6次采样水体获得的浮游植物，共鉴定出浮游植物7门18属种。其中硅藻门包含种类最多，为8种；绿藻门次之，为3种；裸藻门2种；蓝藻门2种；隐藻门、金藻门和甲藻门各1种[13]。从图4可见：试验组池塘中绿藻门比例明显高于对照组，而隐藻门比例明显低于对照组，其他藻门类比例无明显差异；在对照组与试验组中绿藻门、甲藻门、隐藻门藻类在密度上占较大比例，共占浮游植物总数的87.9%～94.3%。
经浮游植物优势度Y计算可知，原甲藻Prorocentrumsp.、鼓藻Cosmariumsp.、隐藻Cryptomonassp.和纤维藻Ankistrodesmussp. 4种藻类为优势种。从图5可见：试验组4种藻类在前期密度增长缓慢，之后呈现高速增长趋势，后期逐渐趋于平缓并呈小幅下降趋势；而对照组4种藻类增长速率较为平缓；除初始7月17日采样期外，其他采样期4种藻类密度均显著高于对照组(P<0.05)。
图4 青蛤养殖池塘水体中浮游植物门类比例
Fig.4 Phytoplankton phyla in aquaculture ponds of Chinese verusCyclina sinensis
从图6可见：试验组生物量试验期间呈现先增长后下降的趋势，而对照组总体保持不变；试验组与对照组生物量最高值均出现在7月26日，试验组高达15.0 mg/L，而对照组仅为5.7 mg/L，试验组生物量为对照组的2.6倍。
从图7-A可见：试验组
浓度在前期有所升高，后维持在0.10 mg/L左右；而对照组浓度在试验期间均保持稳定，维持在0.05 mg/L左右。从图7-B可见：试验组NH3-N浓度随试验的进行呈现先下降后小幅提升最后趋于平稳的趋势，7月17日至7月23日NH3-N浓度由0.99 mg/L下降至0.60 mg/L，至7月29日浓度又升至0.68 mg/L；而对照组整体趋势较为平缓，NH3-N浓度在7月17日至8月1日期间由最初的0.99 mg/L到最终下降至0.91 mg/L，下降幅度较小。从图7-C、D可见：试验组和对照组
与TP浓度整体上无显著性变化(P>0.05)；试验组和对照组浓度均维持在0.01 mg/L左右；试验组TP浓度维持在0.36 mg/L左右，对照组维持在平均0.33 mg/L左右。
注：*表示试验组与对照组有显著性差异(P<0.05),下同
Note: *means significant difference compared between the experimental and the control groups(P<0.05), et sequentia
图5 青蛤养殖池塘水体中浮游植物优势种类藻细胞密度随时间的变化
Fig.5 Changes in cell density of dominant phytoplankton species in aquaculture pond of Chinese venusCyclina sinensiswith time
图6 青蛤养殖池塘水体中浮游植物生物量随时间的变化
Fig.6 Changes in phytoplankton biomass in aquaculture pond of Chinese venusCyclina sinensiswith time
图7 青蛤养殖池塘水化指标随时间的变化
Fig.7 Changes in water quality index in aquaculture pond of Chinese venusCyclina sinensiswith time
试验15 d后分别从试验组与对照组池塘中随机各抽取青蛤300个，测定其湿体质量与壳长。从表1可见：试验组平均湿体质量高于对照组0.12 g，平均壳长高于对照组0.69 mm，但两者总体上并无显著性差异(P>0.05)；试验期间,试验组青蛤存活率较高，存活率为98.3%，而对照组池塘存活率为95.6%。
表1 试验组与对照组青蛤生长比较
Tab.1 Comparison of growth of Chinese venusCyclina sinensisbetween feeding microalga slow-released cake and unfeeding
组别group湿体质量/gwet body weight壳长/mmshell length存活率/%survival试验experimental1.66±0.6416.53±0.4398.3对照control1.54±0.3815.84±0.5295.6
近年来，褐潮的暴发对渤海地区的贝类养殖业带来严重冲击，尤其以抑食金球藻为代表的褐潮藻类的暴发。有研究表明，在小球藻滤液中含有的某类化感物质对抑食金球藻的生长有显著的抑制效果[4,14-16]。同时，小球藻与螺旋藻作为贝类滤食的优质微藻饵料，用作饵料微藻缓释饼材料，不仅能为青蛤提供充足的优质生物饵料[17-18]，也可以有效抑制水体中抑食金球藻的生长，防止其暴发而带来的赤潮危害。为避免将饵料微藻缓释饼批量投放池塘中可能出现因水体富营养化而导致污染水质的现象，本试验中在制作饵料微藻缓释饼时加入了芽孢杆菌粉，有效地调节水质，使水体环境维持一个平衡状态，而仝慧芳等[19]研究表明，芽孢杆菌自身合成的酶类可以有效促进水产动物的摄食与消化。本研究中依据海藻酸钠遇到钙离子可迅速发生离子交换而生成凝胶这一特性，将贝类生长所需饵料微藻等营养物质，包裹在韧性较强且可在水流作用下缓慢释放其中物质的海藻酸钠凝胶块中，经实验室前期试验证实，制作的饵料微藻缓释饼可以很好地达到预期缓释效果。
为规模化开展养殖贝类的人工投喂工作，饵料微藻缓释饼的生态安全性是一项重要评价指标。本试验中发现，试验期间试验组水体NH3-N含量持续降低，
含量持续高于对照组，含量与对照组无明显差异且保持稳定状态，这有效解决了大量有机质投放后造成水体突发富营养化的状况，而降低水体中NH3-N含量有助于贝类健康生长。更为重要的是，试验组水体中与TP含量的升高对于青蛤养殖池塘中浮游植物密度增长具有促进作用[20-21]，同时，饵料微藻缓释饼富含的有机质及微量元素等对藻类生长也有一定的促进作用，具体作用机理有待进一步研究。其中原甲藻、鼓藻、隐藻和纤维藻作为池塘中浮游植物优势种密度增长较为显著。优势种类中原甲藻等常被作为赤潮藻类生物，但亦可在短时间作为养殖贝类的饵料维持生长，进而遏制贝类死亡等灾害发生。
通过人工喂食饵料微藻缓释饼可以从源头上解决养殖贝类所面临的仅依靠自然环境生长的问题。通过本试验结果也可以发现，饵料微藻缓释饼在使用过程中，藻饼中的营养物质使水体营养化程度逐渐增加，为养殖水体中原有浮游植物提供养分，使其密度显著增加，从而提高了养殖水体的初级生产力，饵料微藻缓释饼的使用并不只是停留在“治标不治本”的应急使用，而从根本上解决了养殖池塘中饵料生物量不足的问题。在面临外界突发因素而导致饵料缺乏时，饵料微藻缓释饼更能展现出其优势，具有较好的应急处理效果。
饵料微藻缓释饼在静水青蛤养殖池塘中缓释效果良好，达到预期缓释15 d的效果。同时，饵料微藻缓释饼不仅自身可以作为优质饵料对青蛤的生长有着促进作用，其营养物质也可促进池塘中浮游植物的生长,显著提高青蛤养殖池塘水体中浮游植物的密度，进而提高池塘中饵料微藻生物量。在试验期间，水体营养盐状况除外总体保持稳定状态，还可有效降低NH3-N含量。因此，饵料微藻缓释饼的应用在滤食性海水贝类养殖业中有着重大的突破性意义，具有很好的应用前景。
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Abstract：A proper size and viscosity marine microalga slow-release cake was prepared from mixture of green algaChlorellaandSpirulina, sodium alginate, andBacillus subtilisand put into 60, 80, and 100 mesh bags for feeding Chinese venusCyclina sinensiscultured in a 200 m in length×100 m in width×2 m in depth pond at water temperature of (23±2)℃ in order to cope with the low abundance of marine microalgae and frequent occurrence of brown tides. The microalga slow-release cakes were shown to release the contents for about 15 days in the aquaculture ponds, with significant increase in biomass (maximal up to 15.0 mg/L) of dominant phytoplankton species in microalga slow-release cake pond, includingCosmariumsp.,Cryptomonassp.,Prorocentrumsp. andAnkistrodesmussp.(P<0.05), compared with the control group without marine microalga slow-release cakes. The content of NH3-N in the water was significantly decreased in the test group from 0.99 mg/L to 0.68 mg/L in early period, and then slightly increased, with slight decrease in the control group. The was significantly higher
level in the test group than that in the control group (P<0.05), without significant differences in
and total phosphorus levels between the two groups (P>0.05). The Chinese venus had higher survival rate and relative index of growth (shell length and fresh weight) in the experimental group than those in the control group, without statistically significant difference during the experiment (P>0.05). The findings indicate that the microalga slow-release cakes here play an important ecological role in aquaculture industry of marine shellfish.