水温是影响水生动物繁殖、发育、生长、代谢、地理分布等的重要因素之一。不同贝类都有其生长代谢适宜的温度，超过其正常生活的温度适宜范围会直接或间接影响其生理功能和生化代谢等，甚至导致死亡[1]。中国北方海水温度变化较大，冬季近岸海水及海水池塘温度低至-1 ℃甚至更低，远低于贝类适宜生存温度范围，对贝类养殖业造成很大影响[2]。因此，研究贝类的低温耐受能力对降低贝类养殖产业风险、提高养殖效益、选育抗寒新品种具有重要意义。近年来，国内外学者在贝类低温耐受性方面的研究取得很大进展，本研究中就贝类应对低温胁迫的生理生化反应和冷应答基因调控方面的研究进行综述，并提出预防和调控措施，以期为贝类越冬养殖及抗寒机制的研究提供参考。
温度是影响贝类生理代谢的重要因素之一，许多研究表明, 贝类的代谢率在适宜的温度范围内随温度的变化而变化,当温度过高或者过低时, 贝类的代谢就会出现异常[3]。低温条件下，贝类的代谢等生理活动被抑制，能量获取和能量消耗之间的平衡被打破，能量利用率降低[4]。胥贤等[5]报道了低温对菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum斑马蛤、白蛤及两者杂交所得白斑马蛤3个壳色品系幼贝存活率、耗氧率和排氨率的影响，菲律宾蛤仔幼贝在-1.6～7.6 ℃范围内, 耗氧率随温度降低直线下降，排氨率随温度降低呈波动式下降，而且当温度接近-1.6 ℃时，耐低温能力较弱的白蛤群体的耗氧率和排氨率更低，随温度下降的幅度也较大。存活率结果表明，当温度由7.6 ℃逐渐降低至-2.1 ℃，并且在冰水混合状态下胁迫7 d，3种壳色蛤仔的存活率依次为白斑马蛤(98.6%)>斑马蛤(93.3%)>白蛤(74.6%)[5]。扇贝的摄食率、吸收效率、代谢率、排氨率等生理活动低温时显著降低[6-7]。Han等[8]的研究也证明，菲律宾蛤仔成贝在5～25 ℃温度范围内的滤水率、摄食率、耗氧率和排氨率变化均与温度相关，5 ℃时滤水率、摄食率、耗氧率和排氨率最低，但同化率不受低温影响。贝类受低温胁迫时，生物体内的酶活性降低，生化反应速度下降，代谢速率减慢应该是导致贝类低温时代谢水平降低的原因。已有研究证明，贝类同化率几乎不受温度影响[9]。所以，低温时贝类生长缓慢甚至停止生长的主要原因是，同化率不变的情况下贝类摄入能量用于代谢耗能和排泄耗能的比例增加，同化能所占比例减少，导致贝类被分配用于生长的能量减少。
低温时贝类摄食等部分生命活动受影响，机体内酶活力降低，代谢模式紊乱。菲律宾蛤仔低温(3 ℃)保活前3 d体内乳酸含量明显上升，之后乳酸含量有所下降[10]。海湾扇贝Argopecten irradians低温(4 ℃)保活20 d过程中体内乳酸含量持续升高[11]。乳酸含量变化趋势的差异可能是由不同物种对低温适应能力不同引起的，当菲律宾蛤仔适应低温环境后无氧呼吸减弱，乳酸含量不再上升。
有报道表明，耐寒性昆虫主要通过调节体内生化物质的种类和含量变化维持虫体的过冷却状态以应对越冬期间的严寒[12-13]。近年来，国内外的研究表明，低温条件下贝类体内的生化成分可直接或间接参与其对低温的耐受过程，在机体抗寒系统中发挥重要作用。有研究证实，贻贝Mytilus edulis和波罗的海白樱蛤Macoma balthica体内游离氨基酸的种类变化与温度改变存在相关性[14-15]。福寿螺Pomacea canaliculata通过在越冬期到来前改变体内糖原、脂肪、水分、氨基酸和蛋白质等的含量增强其耐寒能力[16]。
低温引起的冷应激反应是一个耗能过程[16]，糖原和脂肪作为生物体内重要的能源物质分解，以保证正常的生命活动。除了为机体提供能量，糖原还可分解转化为甘油、海藻糖、葡萄糖等小分子碳水化合物。其中，甘油在水中溶解度高、无毒，对代谢过程影响小，可以防止生物体内水分低温结晶，是良好的低温保护剂[17]，海藻糖等小分子碳水化合物能起到稳定蛋白质结构的作用，从而增强贝类的耐寒性[18]。脂肪可被水解产生脂肪酸等，脂肪酸是生物膜磷脂的重要组成成分，温度会影响细胞内饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例，进而影响细胞膜的流动性[19]，在温度降低时不饱和脂肪酸含量升高，有利于保持细胞膜的流动性，降低低温对细胞的损伤[20-21]。杨东敏等[21]报道了低温导致菲律宾蛤仔甘油和不饱和脂肪酸含量显著上升，糖原和脂肪含量显著降低。与越冬期前相比，越冬期后菲律宾蛤仔体内糖原、脂肪、甘油、脂肪酸及氨基酸含量发生显著变化，初步证明蛤仔体内生化物质对其耐低温机制有重要作用[21]。元冬娟等[22]测定和比较了广东省湛江地区的青蛤Cyclina sinensis和皱肋文蛤Meretrix lyrata等6种经济贝类冬、夏两季脂肪酸含量，研究发现总脂肪酸含量在冬季高于夏季。这可能是因为湛江终年高温，夏季最高温度达38 ℃，脂肪酸作为能源物质被消耗，冬季贝类新陈代谢减弱，消耗降低，且冬季贝类需要更多脂肪酸维持细胞膜的流动性[22]。
生物体内氧自由基的过量产生会导致脂质过氧化、DNA损伤、生物膜损伤甚至破坏组织的完整性[23-24]。在正常的生理条件下，贝类体内抗氧化防御系统中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶类，可以帮助清除体内的活性氧自由基(ROS)，增强贝类的抗氧化和免疫能力，保护机体免受氧化胁迫的损伤[25]。同时，抗氧化酶类如溶菌酶(LSZ)是贝类非特异性免疫系统中重要的免疫酶之一，这些酶的活性是贝类生理和免疫状况的重要指标。Jiang等[26]报道低温胁迫会抑制海洋贝类抗氧化系统和免疫系统的功能。姜娓娓等[27]对皱纹盘鲍Haliotis discus hannai研究表明，皱纹盘鲍在低温胁迫(5 ℃)9 h 时SOD、CAT比活力与对照组(15 ℃)相比显著降低。另外，四角蛤蜊Mactra veneriformis和菲律宾蛤仔溶菌酶在低温时活性降低，温度升高时酶活性恢复[28-29]。贝类遭受低温胁迫时，细胞膜流动性降低造成体内酶活力下降。
有关低温对水生动物抗氧化酶活性影响的研究主要集中在鱼类，抗氧化相关酶在鱼类低温胁迫应答机制中起到重要作用[30]。在贝类中，李杰等[31]研究发现，菲律宾蛤仔斑马蛤幼贝能通过提高SOD酶活性抵御低温带来的恶劣环境。张博[32]研究了低温胁迫下华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis的闭壳肌、鳃、外套膜中抗氧化酶表达变化， 8 ℃急性胁迫36 h过程中，CAT和SOD比活力在3个组织中均呈现下降趋势，总抗氧化能力整体持续下降，慢性低温胁迫下CAT和SOD比活力出现先下降又回升的变化趋势，总抗氧化能力最终呈现增高趋势。急性与慢性低温胁迫后抗氧化酶活力显现不同变化趋势，这与强俊等[33]、王晓杰等[34]在鱼类中的研究结果相一致。这表明急性低温胁迫下，当胁迫超出生物机体的最大调节能力时，抗氧化酶体系被破坏，失去抗氧化调节能力；慢性低温胁迫下，抗氧化酶比活力下降后最终出现回升的原因，可能是轻度低温胁迫使机体代谢减慢、氧化能力低、自由基少、抗氧化酶活力降低，当胁迫随着温度降低加剧，自由基产生增加，抗氧化酶活力上升[32]。贝类长时间在低温环境中能逐渐适应低温。姜娓娓等[27]对皱纹盘鲍的研究表明，皱纹盘鲍免疫指标LSZ活性在低温胁迫6～12 h时明显降低，随后又逐渐恢复到正常水平。李润玲[35]研究表明，水温从4 ℃降低到冰点温度，菲律宾蛤仔和光滑蓝蛤Potamocorbula laevis体内SOD、CAT等酶活性受到抑制，当贝类适应低温环境后，酶活力有所回升。
抗氧化系统及时清除机体氧自由基的能力，在贝类非特异性免疫系统中最为重要。低温环境能够打破机体氧化与抗氧化系统平衡，使机体氧化应激反应加剧，抗氧化防御系统机能下降。当贝类受到低温胁迫时，机体通过调节抗氧化酶比活力平衡体内自由基含量，调节低温对其造成的损伤，但由于调节适应低温的机制有其局限性，持续低温胁迫会破坏机体的抗氧化防御系统，体内损伤细胞若不能及时被修复，超出贝类机体调节能力，就会引起贝类各种生理反应甚至死亡。
应对冷胁迫的能力对于自然条件下水生物种的生存非常重要。低温会引起贝类的冷应激反应，贝类通过调节与低温耐受及低温胁迫的相关基因，如冷休克蛋白(CSPs)、热休克蛋白(HSPs)、抗氧化酶等基因的表达量，翻译合成抗寒相关蛋白，从而减少低温对其造成的损伤。
冷休克蛋白(Cold shock proteins，CSPs)，是广泛存在于细菌、动物、植物中的一类在进化上高度保守的多功能蛋白[36]。CSPs在生物体适应低温、促进细胞生长等多种生理功能上起着重要作用。低温对冷休克蛋白基因在贝类组织中的表达量影响显著。目前，已在海兔Aplysia caltfornica[37]和扇贝[38-39]中分离鉴定出相关基因。研究表明，海兔的 ApY1蛋白能够在体外与 RNA 相互作用[37]。
无脊椎动物冷休克结构域结合蛋白(Cold shock domain containing proteins，CSDPs)是 C 端含有若干精氨酸-甘氨酸-甘氨酸(Arg-Gly-Gly，RGG)基序的CSPs[40]。华贵栉孔扇贝在低温(4 ℃)下胁迫36 h时，闭壳肌和血细胞中CnCSDPmRNA的相对表达水平分别在1 h和24 h时显著上调[39]。Yang等[38]报道了栉孔扇贝Chlamys farreri的冷休克蛋白CfCSP是一种真核生物低温调节核苷酸结合蛋白，在栉孔扇贝低温适应过程中可能起到体内RNA分子伴侣的作用。急性冷休克处理(4 ℃)后，栉孔扇贝闭壳肌CfCSP转录水平迅速上调，在1 h时达到最高水平，为对照组(16 ℃)的5.98倍，血细胞中CfCSPmRNA表达水平在26 h时达到最高水平，为对照组(16 ℃)的3.11倍[38]。Y-box蛋白-1(YB-1)是一种DNA和RNA的结合因子，具有保守的冷休克结构域[41]，在低温下，Y-boxmRNA能够成功合成冷休克蛋白[42]。Nie等[43]对菲律宾蛤仔低温转录组分析表明，低温(-1 ℃)胁迫组Y-boxmRNA表达量与对照组(15 ℃)存在显著差异，推测Y-box参与调节菲律宾蛤仔冷胁迫相关基因的转录和翻译。
众多研究表明，CSPs在低温下具有与HSPs相似的分子伴侣作用，能够促使转录和翻译，减少细胞凋亡，稳定蛋白质结构及保持膜流动性[44]。Yang等[37]报道的冷休克蛋白基因CfCSP细菌互补试验表明，CfCSP能有效促进冷生长缺陷大肠杆菌突变株BX04在低温环境下的生长。有学者推测，在低温条件下CSPs的高表达很可能参与了对器官的保护作用[45]。
热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是机体在应激情况下细胞内迅速合成的一组蛋白，具有高度保守性和应激性[46]。已有研究表明，低温胁迫能够诱导鱼类热休克蛋白基因表达。如低温(1 ℃)诱导大菱鲆Scophthalmus maximus HSP70 mRNA表达量显著上升[47]。HSP70作为热休克蛋白的一种，其在正常细胞中水平较低，在应激状态下表达量显著升高, 可作为应激反应和评价组织细胞处于危险状态的分子生物标志[48]。研究证明，贝类热休克蛋白基因表达量可以被低温诱导显著升高。曲凌云[49]研究发现，冷休克(10 ℃±1 ℃)诱导后，海湾扇贝、栉孔扇贝和虾夷扇贝Patinopecten yessoensis血淋巴中HSP70 mRNA表达量升高，分别为对照组的2.33、1.63和1.96倍。Wang等[50]对马氏珠母贝Pinctada fucata martensii耐低温群体和普通群体转录组分析表明，HSP70在普通群体中高表达，HSP40在耐低温群体中高表达，两个群体中HSP70和HSP40的多样性进一步表明，HSP系统在低温适应中的复杂动态变化。贝类HSP70表达存在季节差异，Lesser等[51]报道，偏顶蛤Modiolus modiolus HSP70在夏季和冬季存在差异表达，冬季HSP70表达量显著增加，表明HSP70可能在偏顶蛤的冷胁迫适应中发挥重要作用。热休克蛋白是重要的分子伴侣，在维持细胞稳态中发挥关键作用[52]。HSP家族的HSP70、HSP40等是分子伴侣系统中的重要组成部分，参与了贝类抵御低温胁迫的过程。
抗氧化酶可以清除体内过多自由基，保护细胞免受过氧化损伤。SOD、CAT等抗氧化酶基因的表达量受多种因素影响，其中温度胁迫是一个重要因子[53]。近年来研究表明，贝类可以通过调节抗氧化酶基因的表达来克服逆境胁迫[54]。华贵栉孔扇贝CnMnSODmRNA表达量在低温下处理 0～6 h时其活性降低，在处理12 h后活性急剧升高[55]。皱纹盘鲍血细胞中Cu/Zn-SODmRNA相对表达量在低温胁迫9～12 h时明显增加[27]。对菲律宾蛤仔冷胁迫处理的转录组分析表明，编码硫氧还蛋白过氧化物酶(TPx)(一种关键抗氧化酶)基因在低温(-1 ℃)胁迫下显著上调[42]。机体受到低温胁迫时体内氧自由基产生增多，贝类抗氧化酶基因表达量增加，酶比活力升高，保护机体免受低温损伤。
对于滩涂贝类养殖区，进入冬季后要关注滩涂结冰情况，一旦出现结冰在涨潮期要及时清理，使浮冰随海流飘走，避免浮冰堆积。对于室外池塘养殖，要选择避风条件较好的位置，适当提高养殖池水位，避免冬季结冰后池塘水盐度变化加大，对贝类造成损害，可以增加冬季防寒加温措施，适当提高养殖温度。对于福寿螺Pomacea canaliculata等不耐低温的贝类最好采取室内越冬的方法，在养殖池上加盖防寒薄膜，搭建塑料大棚，并且水位适宜及定期换水以避免水体污染[56]。
引进养殖新品种和通过杂交选育耐低温新品系是提高贝类抗寒能力的有效育种方法。如自2005年起，闫喜武教授团队已对不同壳色的菲律宾蛤仔进行了选择性育种[57]，通过选择育种选择并培育了几代蛤仔新品系[58]。其中斑马蛤和橙蛤是主要的两个品系，通过之前的耐低温试验发现，斑马蛤和橙蛤具有很好的低温耐受能力，斑马蛤表现出了抵御环境压力的杂交优势。
转基因技术是一种既快速又较容易跨越种、属间的改良品种特性的方法。利用转基因技术提高水产动物抗寒能力主要是利用抗冻蛋白(Antifreeze protein，AFP)低温下能保护机体免受冻寒的作用[59]。李卫东等[60]将美洲大绵鲥Macrozoarces americanus的Ⅲ型AFP转入杂色鲍肌动蛋白启动子初步获得转杂色鲍AFP的表达载体，该研究为贝类抗寒转基因技术奠定了基础。
低温从多方面、不同水平影响贝类生存，主要从贝类能量收支、体内酶活力和基因表达等方面影响贝类生理反应和免疫能力，但其影响机理还需要进一步研究验证。低温对冷应答基因表达有显著影响，但冷应答基因调节贝类适应低温环境的分子机制还需进一步研究。
贝类受到低温胁迫时机体对低温的响应机制受诸多因素影响，各因素之间相互影响，而且水温的变化常常伴随盐度、溶氧等环境因子的变化，所以，贝类响应低温胁迫的机制研究目前尚不完善，今后应加强以下几方面的研究：
(1)多种环境胁迫因子的综合作用对贝类抵抗外界多重逆境的适应性影响，重点解决抗冻复合基因的转化及表达特性与调控机制的问题。
(2)了解低温对贝类冷应答基因影响的分子机制，从根本上了解贝类响应低温胁迫机制。
(3)深入开展有关贝类抗寒转基因技术、细胞信号通路、DNA甲基化等方面的研究。
(4)通过改善养殖环境、选育新品种、使用转基因技术等措施降低低温对贝类的损害。
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