紫锥菊Echinacea purpora又称松果菊，属于被子植物门、双子叶植物纲、桔梗目、菊科、松果菊属的多年生草本植物[1]。该属共有9个种，其中紫花紫锥菊E.purpora、狭叶紫锥菊E.angustifolia、白花紫锥菊E.pallida已开发成药品，在医学上被广泛应用。紫锥菊原产于北美，是欧洲和美国使用最广泛的膳食补充剂之一，常用于感冒的预防或早期治疗，是世界著名的“免疫”草本植物。现代药理研究表明，紫锥菊具有提高机体免疫力[2]、抵抗感染和减轻炎症损伤的功能[3-5]，常用来治疗流感及促进伤口愈合[6-7]。大量体内外试验表明，紫锥菊可以增强机体免疫力，且其免疫刺激和抗炎作用对细菌和病毒性疾病有很好的防控作用。
近年来，紫锥菊及其提取物已作为一种饲料添加剂被广泛应用在畜禽生产中，在鱼虾等水产动物中也表现出较好的促生长及免疫调节效果。2012年6月，紫锥菊及其制剂被中国农业农村部批准为国家一类新兽药，这使得紫锥菊在水产养殖上有了广泛的研究和应用前景。本研究中，综述了紫锥菊的主要活性成分、免疫调节作用与机制，以及在水产养殖中的应用研究情况，并对其在水产养殖中的应用前景和发展趋势进行了展望，旨在为其在水产养殖上的推广应用提供参考。
1 紫锥菊的活性成分、免疫调节作用及其机制
紫锥菊的化学成分十分复杂，其主要的活性成分包括极性成分(咖啡酸及其衍生物)、非极性成分(烷基酰胺类物质)及多糖和糖蛋白等高分子量成分[8]。紫锥菊活性成分的含量及作用随着产地、生长时期、部位及加工方法的不同呈现较大差异。2004年，Gertsch等[9]首次探讨了关于紫锥菊发挥抗炎作用可能的分子机制，认为紫锥菊的活性成分烷基酰胺可结合大麻素2型受体(cannabinoid type2，CB2)，调节一系列信号通路，从而调控肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)的表达，提高机体抗炎能力。随后又有许多团队研究了紫锥菊的免疫调节作用机制，但是仍有许多不明确的地方[10]。目前认为，紫锥菊的免疫调节作用主要是通过提高机体抗氧化能力、减轻炎症损伤及增强机体免疫功能来实现的。
1.1 紫锥菊的活性成分
1.1.1 咖啡酸及其衍生物咖啡酸是紫锥菊常见的酚酸之一[11]，咖啡酸衍生物(caffeic acid derivatives, CADs)，是一类含有咖啡酸基本结构单元的羟基肉桂酸酯的代谢产物，是紫锥菊主要的极性活性成分。CADs在植物中分布广泛，除紫锥菊外，在丹参Salviae miltiorrhiza、鼠尾草Salvia japonica、迷迭香Rosmarinus officinalis、蓝莓Vacciniumspp.、苹果Malus domestica、咖啡CoffeaLinn等均有较多含量[11-13]。目前，获得CADs的主要途径包括从天然产物中提取分离及化学合成法富集。迄今为止，已从紫锥菊中分离鉴定出了咖啡酸、菊苣酸、绿原酸、紫锥菊苷、洋蓟酸等15种CADs[14]。CADs有多种生物活性作用，能够抑制细菌感染中涉及的关键酶透明质酸酶，具有明显的免疫刺激功能和抗炎作用，同时还具有很强的抗氧化作用[8,15-16]。
1.1.2 烷基酰胺类物质 烷基酰胺类物质是紫锥菊的一大类非极性活性成分，主要存在于根部。目前已鉴定出超过20种紫锥菊源烷基酰胺类物质，这类物质主要是具有烯烃和/或乙炔键直链脂肪酸的异丁烯酰胺[17-18]，烷基部分为4或5个碳的烷基。烷基酰胺类物质还存在于千日菊Gerbera jamesonii和花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim等多种植物中[19]，与植物的抗炎活性关系密切[20]，其含量可作为紫锥菊制剂重要的质量控制指标[21]。紫锥菊中的烷基酰胺类物质分离难度高，不易得到。目前，可以通过高速逆流色谱与高效液相色谱联用技术提高样品回收率，能够有效控制紫锥菊制品的质量[22]。在提取过程中，烷基酰胺类物质所在的部位、干燥新鲜程度及使用的萃取溶剂的比例等，均会影响烷基酰胺类物质的含量及生物活性。烷基酰胺类物质本身具有抗炎、调节免疫的作用，因此，其是影响紫锥菊药理活性的关键因素之一。
1.1.3 多糖和糖蛋白 紫锥菊含有多种多糖和糖蛋白等大分子物质。从紫锥菊地上部分的水提取物中发现了相对分子质量为35 000的4-甲氧基-葡萄糖醛-阿拉伯糖-木聚糖聚糖和相对分子质量为50 000的阿拉伯糖-鼠李半乳糖聚糖这2种免疫多糖[23-24]。从紫锥菊根中可以分离到相对分子质量分别为17 000、21 000和30 000的3种糖蛋白。上述糖蛋白中糖的成分主要为阿拉伯糖，最高可达80%以上，其次还有半乳糖及葡糖胺等成分，其蛋白质部分主要为天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸和丙氨酸[23，25]。紫锥菊多糖的含量及活性与多种因素有关。有研究表明，四倍体紫锥菊中的多糖含量高于二倍体紫锥菊[26]。紫锥菊多糖与糖蛋白有较强的免疫活性，具有抗炎、抗氧化及增强免疫的功能。
1.2 免疫调节作用
1.2.1 降低机体氧化水平 自由基即活性氧自由基，包括羟自由基、超氧自由基和脂自由基，具有极强氧化能力，能与体内核酸及糖类等生物大分子作用，破坏细胞结构和功能，损害机体健康。紫锥菊及其提取物中的活性成分能够提高机体抗氧化能力。基于TLC—DPPH薄层层析法的DPPH自由基清除试验证实，含有紫锥菊多酚的鲤鱼饲料具有很强的自由基清除能力，且其清除能力与饲料中紫锥菊多酚含量呈正相关[27]。更多研究证实，紫锥菊发挥抗氧化功能主要通过以下两个途径实现：
(1)紫锥菊直接清除机体自由基。紫锥菊所含的CADs是多酚类化合物，能够将氢供给脂类化合物自由基，同时自身转变为稳定的酚氧自由基，直接吸收自由基实现抗氧化，延缓氧化过程[14]。
(2)紫锥菊通过调节抗氧化酶的活性来阻止机体的进一步氧化。紫锥菊可以通过调节动物体内的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽还原酶(GR)等活性，清除体内的有机过氧化物，降低丙二醛(MDA)含量，减轻或阻止脂质过氧化反应的发生[28]。此外，紫锥菊的多糖成分不仅能通过上述途径发挥抗氧化作用，还可以与Fe2+、Cu2+等金属离子发生络合反应，抑制自由基产生，且多糖与烷基酰胺类物质、CADs协同作用时抗氧化作用更强[29]。
1.2.2 抗炎作用 紫锥菊及其提取物能够提高机体的抗炎能力。Oskoii等[30]发现，饲料中添加紫锥菊提取物可提高虹鳟Oncorhynchus mykiss血液中白细胞总数、淋巴细胞数及红细胞压积值等参数，增强虹鳟的抗炎能力。紫锥菊及其提取物的抗炎作用机制可能包括以下途径：
(1)紫锥菊的主要活性成分烷基酰胺类物质可以与CB2结合,并激活一系列相关的信号转导途径以提高动物抗炎功能[31]。Manayi等[10]研究表明，烷基酰胺类物质作为配体结合G蛋白偶联受体CB2后，调节环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，激活p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)途径，同时下游激活核因子-κB(NF-kappaB，NF-κB)和转录激活因子-2/cAMP应答元件结合蛋白的活性，调控TNF-α的表达，从而调节机体免疫反应。此外，紫锥菊烷基酰胺可刺激白细胞介素-10表达，抑制环氧合酶和5-脂氧合酶的产生，从而使机体产生一系列的免疫应答反应，激活抗炎活性[32]。
(2)紫锥菊CADs能够增强精氨酸酶活性，抑制炎症介质一氧化氮(nitricoxide，NO)、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的合成和促炎细胞因子的分泌，从而发挥抗炎作用[33-34]。
(3)通过其活性成分多糖实现抗炎作用。Fast等[35]研究发现，紫锥菊根水提取物通过激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路抑制三酰脂肽刺激单核巨噬细胞(THP-1)产生TNF-α，从而使蛋白激酶B和核糖体S6蛋白磷酸化，促进抗炎作用。由于水提物中不存在多酚类及烷基酰胺类等物质，所以其抗炎作用应该是通过其活性成分多糖来实现的，这可能是紫锥菊及其提取物发挥免疫调节作用的一种新机制。
1.2.3 增强免疫功能 紫锥菊及其提取物对机体免疫功能的增强作用包括以下几个途径：
(1)通过提高体液抗体水平及免疫器官B淋巴细胞转化率来提高动物的体液免疫功能，从而促进免疫器官的生长发育。灌胃试验表明，紫锥菊及其提取物能够增强小鼠机体的抗体分泌功能，上调非特异性免疫基因的表达，使正常小鼠的脾脏指数提高，从而促进小鼠脾脏生长发育，使机体免疫功能增强[36]。同时对经过环磷酰胺诱导后的抑制状态下小鼠的免疫功能有缓解作用，同样能够提高小鼠的胸腺指数和脾脏指数[37]。关于紫锥菊及其提取物对水产动物免疫器官发育的影响还未见深入研究报道。
(2)直接作用于免疫细胞，增强细胞免疫功能。紫锥菊及其提取物使机体淋巴细胞数量增加、活性增强，诱导白细胞介素-2、γ-干扰素含量升高，显著提高细胞免疫水平[38]。
(3)紫锥菊及其提取物能够调控Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)信号转导，激活下游关键信号分子MAPK通路，使细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、JNK磷酸化，之后激活NF-κB，上调共刺激分子CD80、CD86和主要组织相容性复合体Ⅱ类分子(Major histocompatibility complex class Ⅱ，MHCⅡ)的表达，从而使巨噬细胞功能上调[39]。2017年，Fu等[40]发现，紫锥菊提取物通过激活JNK信号传导途径使小鼠骨髓来源巨噬细胞向经典活化巨噬细胞表型极化，诱导巨噬细胞活化和抗原呈递，发挥其抗感染功能。
(4)紫锥菊活性成分多糖和糖蛋白可促进巨噬细胞γ-干扰素、β-干扰素、白细胞介素-2和白细胞介素-6的产生和分泌，增强呼吸爆发活性，从而进一步增强吞噬能力，提高免疫功能[41-42]。
2 紫锥菊在水产养殖中的应用
2008年，任永林[43]首次将紫锥菊用于鲤CyprinuscarpioL.，发现紫锥菊提取物能够促进鲤的生长，以及提高鲤的免疫能力。此后，紫锥菊及其提取物在水产养殖动物中的应用日益增多，在多种鱼类和对虾中都表现出较好的抗氧化、提高免疫能力、抗感染及促进生长的作用。
2.1 增强水产动物抗氧化功能
机体氧化水平是动物健康状况的重要影响因素[28]，而紫锥菊的活性成分具有很好的抗氧化作用，可以降低机体的氧化水平。紫锥菊及其提取物通过调节抗氧化酶水平，以及直接降解自由基，从而改善机体氧化水平与健康状况，已在鲫Carassius auratus和大菱鲆Scophthalmus maximus等鱼类中得到证实，且紫锥菊提取物添加量在2～4 g/kg范围内抗氧化能力达到最佳[44-45]。饲料中添加4 g/kg紫锥菊提取物能够显著提高鲫血清及脏器组织中SOD、CAT及GR活力(P<0.05)，显著降低MDA及羟自由基含量(P<0.05)[44]，同时，还能够显著上调鲫肝脏的8种miRNAs表达，增强鲫的抗氧化功能，从而改善健康状况[46]。秦志华等[45]在大菱鲆上也得到相似结果，3.2 g/kg(鱼体质量)注射量的紫锥菊提取物能够极显著提高大菱鲆血清SOD活力(P<0.01)。此外，添加紫锥菊提取物的鲤饲料能够直接清除自由基，在生产中，紫锥菊提取物可以作为天然的自由基清除剂，预防氧化应激引起的鱼类疾病[28]。
2.2 提高水产动物免疫能力
紫锥菊及其提取物可作为水产动物的“免疫触发器”[47]，可以通过改善鱼类生化指标、血液学指标，以及提高非特异性免疫水平来提高水产动物的免疫能力。
Aly等[48]研究发现，紫锥菊提取物可以提高罗非鱼Orechromis niloticus和灰鲻Mugil cephalus的中性粒细胞黏附率和红细胞压积值，显著增加白细胞，尤其是淋巴细胞数量，从而提高鱼类存活率。在血液生化指标方面，投喂紫锥菊提取物可以显著提高灰鲻血清白蛋白、球蛋白及总蛋白含量(P<0.05)[47]。此外，投喂或注射紫锥菊提取物还能够提高某些鱼类如魾Barbus grypus[49]、灰鲻[47]及大菱鲆[45]的溶菌酶活性、吞噬活性及呼吸爆发活性，增强非特异性免疫能力。投喂紫锥菊提取物可以提高魾、灰鲻的免疫水平，其提升效果与剂量呈正相关；进一步研究发现，注射紫锥菊提取物能够极显著增强大菱鲆血清中溶菌酶活性及呼吸爆发活性(P<0.01)，同时上调大菱鲆头肾中的免疫基因如溶菌酶、C3补体、转化生长因子β1(TGF-β1)、白细胞介素-1h(IL-1h)及转铁蛋白基因的表达，从而提高大菱鲆免疫功能[50]。
2.3 提高水产动物抗感染能力
病原微生物感染是制约水产动物健康持续发展的要素之一，紫锥菊提取物通过增强非特异性免疫系统对病毒和细菌的抑制能力，提高水产动物的抗感染能力与存活率[51-52]。
紫锥菊提取物能够阻止或减轻某些病原微生物对虹鳟的侵害，其保护作用与添加量有关：饲料中添加1.5 g/kg紫锥菊提取物能够增强虹鳟对海豚链球菌Streptococcus iniae的抗病力[53]，而饲料中添加0.1 g/kg添加量的紫锥菊提取物对感染鳗弧菌Vibrio anguillarum的虹鳟保护率最好，其死亡率比对照组降低32%[42]。对于鲻鱼，由美人鱼发光杆菌杀鱼亚种Photobacteriumdamselae引起的发光杆菌病，是海水养殖主要病害之一，死亡率极高。饲料中添加0.2 g/kg的紫锥菊提取物能够增强鲻鱼对美人鱼发光杆菌杀鱼亚种的抗病力，使鲻鱼的死亡率降低46%[47]。在大菱鲆中也有相似结果，注射3.2 g/kg(鱼体质量)的紫锥菊提取物可以增强大菱鲆对迟缓爱德华氏菌的抗性，降低死亡率[45]。在抗病毒感染方面，Medina-Beltrán等[54]发现，在凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei饲料中添加0～4 g/kg的紫锥菊提取物时，随着添加量的增加，凡纳滨对虾对白斑综合征病毒(WSSV)的感染率显著降低(P<0.05)，添加量为4 g/kg时，感染率由对照组的100%下降到8.3%。这表明，紫锥菊提取物能够有效降低凡纳滨对虾感染WSSV的机率。
2.4 促进水产动物生长
紫锥菊及其提取物在不同水产动物中都体现出了显著的促生长作用。任永林[43]首次将紫锥菊应用在水产动物中时，发现了紫锥菊提取物对鲤生长的促进作用，表现在鲤的增重率及特定生长率提高，饵料系数降低。此后，更多研究证实了紫锥菊提取物对不同鱼类有较好的促生长作用。用紫锥菊提取物投喂虹鳟[30]和欧鳇Husohuso[55]的最适饲料添加量均为0.5 g/kg，在此剂量下的促生长作用达到最佳。Kasiri等[56]以神仙鱼Pterophyllum scalare为研究对象，比较了紫锥菊提取物和常用的促生长剂左旋咪唑的促生长作用，发现用添加紫锥菊提取物的饲料喂养的神仙鱼终末体质量、增重率、特定生长率均优于左旋咪唑组。Oniszczuk[27]首次使用挤压蒸煮法制备含有紫锥菊的鱼饲料，这种鱼饲料成分均衡，蛋白质、脂肪、钙、氮和磷等营养元素丰富，能够作为营养补充剂应用在促进水产动物生长中。另外，紫锥菊本身具有提供营养素的能力，且能够提高鱼类对饲料营养的利用率。Akbary等[57]在饲料中添加紫锥菊提取物投喂鲻鱼，显著提高了鱼的增重率和蛋白质效率比(P<0.05)，表明紫锥菊可以提高鲻鱼对饲料中蛋白质的利用率，从而改善鲻鱼的生长性能。
此外，紫锥菊及其提取物能够降低饵料系数及饲料转化率，促进鱼类体质量的增加，可能是通过影响肠道菌群、诱导消化酶的分泌[58]、调节氨基酸代谢等方式来实现的。有研究表明，紫锥菊多糖具有调节肠道微生态的潜在应用价值[59]，这可能是紫锥菊及其提取物能够改善消化系统的功能、提高能量利用率、促进生长的原因之一[60]。Guz等[61]发现，在孔雀鱼Poecilia reticulata饲料中添加紫锥菊提取物能够增加鱼体甘氨酸、半胱氨酸、组氨酸和丝氨酸含量。这表明，紫锥菊能够通过调节氨基酸代谢促进鱼类生长和维持健康。
3 存在问题及展望
紫锥菊富含多种生物活性物质，具有显著的调节免疫及促进生长作用，已广泛应用于人类医学和动物养殖。在人类医学上，有关紫锥菊的活性成分、药理功效与作用机制已有较为深入的研究。比较而言，紫锥菊在动物养殖尤其是在水产养殖上的研究尚处于起步阶段，仍有许多问题亟待解决。
(1)紫锥菊应用物种的多样性应深入探究。应用过紫锥菊的水产动物种类还较少，特别是在无脊椎动物上的研究几乎是空白，鉴于水产动物养殖种类较多，有必要进一步加强紫锥菊在不同水产养殖动物上的相关应用研究。
(2)紫锥菊对水产动物的促生长及调节免疫作用机制需进一步探明。紫锥菊对不同水产动物的详细作用机制还不十分清楚，如紫锥菊对水产动物免疫尤其是黏膜免疫的研究几乎未见报道，紫锥菊对水产动物肠道菌群的调节效果及其在促生长过程中的详细作用机制需进一步阐明。应用紫锥菊后，其在不同物种上表现出的生物活性作用存在较大差异，其背后的具体机制同样有待深入探究。
(3)紫锥菊的使用策略也需要进一步完善。针对不同养殖对象、生长阶段、生活环境及不同的病原种类，探讨其最佳的使用时机、使用剂量及添加方式。
(4)紫锥菊的复合使用效果有必要加强研究。紫锥菊能否和其他水产投入品如中草药、寡糖或多糖类免疫增强剂及益生菌等进行复合使用，以及复合使用后的药用效果、安全性和作用机制等问题还需深入验证、探讨。
(5)紫锥菊的来源与提取工艺对其活性成分的影响值得进一步探讨。紫锥菊的引种、种植、提取工艺等对其活性成分的含量和效果会有显著影响，相关方面的研究仍需要进一步推进。相信随着相关研究的不断深入，紫锥菊在水产动物养殖中将会有广阔的应用前景。
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