传染性胰腺坏死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)是由传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)引起的严重危害虹鳟Oncorhynchus mykiss健康养殖的急性、传染性疾病之一[1]。根据病毒株、鱼龄和饲养环境的不同，IPN一般可造成虹鳟死亡率为10%～90%[1-3]。该病最早发生于美国和加拿大[4]，随后在欧洲、亚洲、非洲等地暴发，并于20世纪80年代末传入中国山西[5]、甘肃[6]、山东[7]等省份及东北[8]等地，造成虹鳟死亡率高达90%，给虹鳟养殖带来了巨大的经济损失。
IPNV是属于双RNA病毒科Birnaviridae、水生双RNA病毒属Aquabirnavirus的无囊膜病毒[9]，呈二十面体对称，直径为50～75 nm[10]，基因组由A、B两段双链RNA构成[11]。A段基因含有2个开放阅读框(ORFs)，其中，一个ORF编码约106 000的pVP2-VP4-VP3多聚蛋白前体，另一个ORF编码约15 000的非结构蛋白VP5[12]；B段基因编码约94 000的聚合酶蛋白VP1[13]。VP2蛋白是IPNV病毒表面的主要结构蛋白，含有病毒抗原决定簇，能够诱导机体产生免疫中和抗体，在病毒侵入机体时起到关键的作用，因此，被广泛用于检测和预防IPNV的研究中[11，14]。
本研究中结合前期序列比对结果，对从中国云南省某虹鳟养殖场分离出的IPNV分离株进行了系统进化分析[15]，并利用生物学分析软件对VP2蛋白的跨膜区、亲水性和抗原性等进行分析后，对其特定区段进行了原核表达，利用表达的VP2蛋白制备鼠抗血清，初步进行了免疫学鉴定，旨在为以VP2为目的蛋白的IPN流行病学检测及疫苗研究提供试验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
IPNV病毒株，分离自云南省某养殖场患病虹鳟，记为ChRtm213，由黑龙江水产研究所鱼病实验室保存；大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells，CHSE)由中国水产科学研究院长江水产研究所鱼类病害教研室提供；Balb/c小鼠购自黑龙江中医药大学实验动物中心。
pMD19-T simple克隆载体、限制性核酸内切酶、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver 2.0试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司；SV Total RNA Isolation System购自Promega公司；HRP标记的羊抗鼠IgG、FITC标记的羊抗鼠IgG购自Abcam公司；pET-27b表达载体、大肠杆菌DH5α、Rosetta菌株由黑龙江水产研究所鱼病实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 引物合成 根据黑龙江水产研究所鱼病实验室分离的IPNV表面蛋白VP2的基因序列(NCBI登录号：KX234591)，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，上游引物VP2-F带有BamH Ⅰ酶切位点：5′GGATCCTGGTTCCAGAGTCGGTGCC 3′，下游引物VP2-R带有Hind Ⅲ酶切位点：5′AAGCTTTCATGCCTTTGAGGTTGGTAGGTCACTTGTG AAGT 3′，引物由哈尔滨博仕生物公司合成。
1.2.2 IPNV 病毒的扩增及RNA的提取 病毒的扩增及RNA提取方法参照文献[14]。
1.2.3 同源性分析 以IPNV的VP2基因为比对基因，利用MegAlign生物学软件对分离得到的IPNV病毒株与GenBank中收录的IPNV病毒株进行核苷酸同源性分析，并建立系统进化树。本研究中所用比对毒株如表1所示。
1.2.4 VP2基因的克隆 以“1.2.2”节中提取的IPNV RNA为模板，以VP2-F和VP2-R为引物，利用一步法RT-PCR试剂盒对VP2基因进行扩增。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳胶分离后，利用胶回收试剂盒对克隆片段进行回收。胶产物与克隆载体pMD19-T simple连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落经PCR鉴定正确后，提取质粒进行测序，测序正确的重组质粒命名为pMD19-T-VP2。
表1 比对毒株信息
Tab.1 Information of IPNV isolates
序号No.分离株isolate宿主hostGenBank accession number国家country1ChRtm213TroutKX234591中国2JasperTroutAF342735.1加拿大391-137SalmonAF343570.1美国4RenoTroutAY026345美国5Canada2TroutAF342733.1加拿大6Canada3TroutAF342734.1加拿大724RTroutAJ489227.1西班牙8578TroutAJ489228.1西班牙92464TroutAJ489226.1西班牙10TeTellinaAF342731.1英国11ASVAtlantic salmonAY026490.1加拿大12Canada1TroutAF342733.1加拿大13Sp103UnkAY823632.1挪威14OV2OysterAY026484美国15SpTroutAF342728.1爱尔兰16HePikeAF342730.1德国17YTAV-06YellowtailAB281673日本18H1FlounderAY283783.1日本19NC1FlounderAY283784.1韩国20POBVOysterEU161285.1中国
1.2.5 VP2表达载体的构建 将测序完全正确的重组质粒pMD19-T-VP2和pET-27b表达载体，分别经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后，利用胶回收试剂盒进行回收。回收产物利用T4 DNA连接酶连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单菌落进行Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pET-27b-VP2。
1.2.6 VP2蛋白的表达及纯化 将重组质粒pET-27b-VP2转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中，挑取Rosetta/pET-27b-VP2单菌落置于含卡那霉素的LB液体培养基中，于37 ℃下振荡培养。当OD600 nm值达到0.3～0.4时，加入终浓度为0.25 mmol/L的IPTG诱导剂，于37 ℃下诱导表达VP2蛋白。分别于诱导前及诱导后2～7 h收集菌体，经PBS重悬菌液后进行超声破碎。超声破碎后的产物进行12% SDS-PAGE凝胶电泳，分析VP2蛋白诱导表达情况。
将超声破碎后的菌体于4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，离心后的沉淀加入含有2 mol/L尿素的复性液洗涤3遍，再将沉淀用含有8 mol/L尿素的变性液溶解，待沉淀全部溶解后，缓慢加入30倍体积的复性液，于4 ℃下复性10 h后放入PBS溶液中(pH 8.0)透析24 h。透析结束后于4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，收集上清，并进行12% SDS-PAGE电泳分析。
1.2.7 IPNV VP2 蛋白抗血清的制备 采用对Balb/c小鼠进行皮下多点注射免疫的方法制备IPNV VP2蛋白抗血清，VP2蛋白的免疫剂量为0.5 mg/kg，每次免疫间隔为10 d，共免疫3次。本研究中，将弗氏完全佐剂与纯化的VP2蛋白等体积乳化后进行首次免疫，将弗氏不完全佐剂与VP2蛋白乳化后进行第2、3次免疫，同时以PBS与佐剂乳化进行免疫作为对照组。免疫结束后，从小鼠眼球取血，将血清分装于无菌管中于超低温冰箱(-80 ℃)中保存备用。
1.2.8 IPNV VP2蛋白抗血清效价的检测 采用“1.2.5”节中表达纯化的VP2蛋白包被酶标试剂板，并分别设置阴性对照及空白对照孔。以“1.2.6”节中制备的鼠抗血清作为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗；待二抗反应结束用PBST充分洗涤后，加入TMB底物液于37 ℃下避光显色5 min，加入终止液终止反应，于450 nm波长下检测酶标孔的OD值。当OD450 nm所读数值符合(阳性孔-空白孔)/(阴性孔-空白孔)>2.1时，此时的血清最大稀释倍数即为所制备的鼠抗血清的效价。
1.2.9 间接免疫荧光(IFA)检测免疫原性 参照文献[14，16]中的方法制备CHSE单层细胞爬片，并接种本实验室分离的IPNV毒株。按照文献[14]中的方法处理细胞后，分别加入本研究中制备的鼠抗血清，于37 ℃下反应1 h后孵育FITC标记的羊抗鼠IgG二抗，用PBS洗涤后置于荧光显微镜下观察结果。
1.3 数据处理
试验数据采用SPSS 22软件进行方差分析，采用t检验进行两组间显著性比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 IPNV分离株的进化分析
利用IPNV的A链基因对其进行系统进化分析，结果表明，本实验室分离的IPNV分离株ChRtm213与美国株Reno、加拿大株Jasper和91～137菌株聚为一簇，同属于基因1型(图1)，ChRtm213分离株与中国已经报道的双链RNA病毒不同，为中国目前流行的IPNV毒株。
图1 云南分离株ChRtm213基于A链序列的系统发育关系
Fig.1 Phylogenetic tree of ChRtm213 isolate from Yunan,China based on complete genome of segment A
2.2 VP2蛋白的疏水性及抗原性分析
利用TMHMM Server在线分析软件及DNAStar 6.0(Protean)软件，分别对VP2蛋白的跨膜区、亲水性和抗原性等进行了分析。结果表明：VP2蛋白在第450～486位氨基酸处存在跨膜区(图2-A中红色区域)，且该蛋白区段呈现出疏水性(图2-B)；VP2蛋白在第48～60、160～170、248～280、345～371和453～478位氨基酸处存在较强的疏水性(图2-B)。因此，综合考虑VP2蛋白的跨膜区、亲水性、抗原性及表面可能性后，本研究中选取VP2蛋白的第68～451位氨基酸进行克隆及原核表达，选定表达区域为图2中黑色矩形框圈定区域。
2.3 VP2基因的克隆及表达载体的构建
以提取的IPNV病毒悬液的RNA为模板、VP2-F/VP2-R为引物扩增目的基因，扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳显示，PCR产物为单一的特异性条带，大小约为1149 bp，与目的片段大小相符(图3)。将连接pMD19-T载体测序正确的片段酶切后，连接pET-27b载体，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒进行PCR及双酶切鉴定，结果与目的片段相符(图4)，表明pET-27b-VP2重组质粒构建成功。
图2 VP2蛋白的跨膜区、抗原表位及疏水性分析
Fig.2 Transmembrane domain，hydrophobicity and antigenic determinants of VP2 protein
注：M为DL2000分子量标准；1为阴性对照；2～3为VP2基因片段
Note：M, DL2000 DNA Marker; 1, Negative control; 2-3, RT-PCR product of VP2 gene
图3 VP2基因克隆产物琼脂糖凝胶电泳图
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of VP2 gene from RT-PCR
注：M1为DL15000分子量标准；M2为DL2000分子量标准；1为BamH Ⅰ酶切后的重组质粒；2为Hind Ⅲ酶切后的重组质粒；3为BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后的重组质粒；4为未酶切的重组质粒；5为PCR鉴定阴性对照；6～7为PCR鉴定产物
Note：M1，DL15000 DNA Marker; M2，DL2000 DNA Marker; 1，Digested plasmid by BamH Ⅰ; 2，Digested plasmid by Hind Ⅲ; 3，Dual-digested plasmid by BamH Ⅰ and Hind Ⅲ; 4，Recombinant plasmid pET-27b-VP2; 5，Negative control; 6-7，PCR product of pET-27b-VP2 recombinant plasmid
图4 pET-27b-VP2重组质粒PCR及酶切鉴定
Fig.4 PCR and dual-digestion of pET-27b-VP2 recombinant plasmid
2.4 VP2蛋白的诱导表达
IPTG诱导前及诱导后2～7 h的菌体经超声破碎离心后，进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明，在约46 000处有特异性蛋白条带表达，与VP2蛋白的预期理论值相符，该蛋白在IPTG诱导6 h后表达量达到最大值(图5)。对VP2蛋白表达的可溶性分析表明，VP2蛋白主要存在于菌体破碎离心后的沉淀中，说明本研究中表达的VP2蛋白以包涵体的形式存在(图6)。
注：M1、M2为蛋白分子量标准；1为未诱导的菌体蛋白；2、3、4、5、6、7分别为诱导7、6、5、4、3、2 h后的菌体蛋白
Note：M1and M2,protein Marker; 1, Uninduced bacterial protein; 2 to 7, protein expression induced for 7，6，5，4，3，and 2 h
图5 不同诱导时间下VP2蛋白的表达
Fig.5 VP2 protein expression induced for different hours
注：M1、M2为蛋白分子量标准；1为未诱导菌体总蛋白；2为未诱导菌体破碎后上清中蛋白；3为未诱导菌体破碎后沉淀中蛋白；4为诱导后破碎菌体总蛋白；5为诱导后破碎菌体上清中蛋白；6为诱导后破碎菌体沉淀中蛋白
Note：M1and M2, Protein Marker; 1, Uninduced bacterial protein; 2, Supernatant of uninduced bacteria; 3, Sediment of uninduced bacteria; 4, Induced bacteria; 5, Supernatant of induced bacteria; 6, Sediment of induced bacteria
图6 VP2蛋白的可溶性分析
Fig.6 Solubility analysis of VP2 protein
2.5 VP2蛋白的纯化
表达VP2蛋白的菌体破碎后离心收集沉淀，并经蛋白质变性及复性纯化后获得可溶性VP2蛋白，复性后的可溶性VP2蛋白于PBS溶液中透析24 h后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明，经蛋白质变性、洗涤、复性和PBS透析后得到了可溶性VP2蛋白，且纯化后的VP2蛋白为单一条带(图7)，其纯度可用于VP2蛋白鼠抗血清的制备。
2.6 IPNV VP2蛋白鼠抗血清效价的检测
用IPNV病毒培养物和纯化的VP2蛋白分别作为抗原包被酶标板，以不同稀释度的鼠抗血清作为一抗，进行ELISA检测。结果表明，满足(阳性血清OD450 nm-空白孔OD450 nm)/(阴性血清OD450 nm-空白孔OD450 nm)>2.1时，鼠抗血清的最大稀释倍数分别为1∶20 000(包被IPNV病毒培养物)和1∶40 000(包被VP2蛋白)(图8)。这表明，本研究中制备的鼠抗血清能够识别IPNV病毒的VP2蛋白，证明表达的VP2蛋白与IPNV病毒的VP2蛋白具有相近的免疫原性。
注：M为蛋白分子量标准；1为纯化后的VP2蛋白
Note：M，Protein marker; 1，Purified VP2 protein
图7 VP2蛋白纯化后的SDS-PAGE分析
Fig.7 SDS-PAGE gel analysis of purified VP2 protein
注：*表示与对照组有显著性差异(P<0.05)
Note: *means significant difference compared with the control (P<0.05)
图8 抗血清效价检测
Fig.8 ELISA analysis of anti-serum titre
2.7 间接免疫荧光检测免疫原性
将制备的CHSE单层细胞爬片接种本实验室分离的IPNV毒株，以此细胞作为间接免疫荧光检测的抗原，以本试验中制备的鼠抗血清作为检测抗体，进行免疫原性的间接免疫荧光检测。结果表明，在细胞感染病毒24、48 h后，本试验中制备的鼠抗血清均能与IPNV毒株发生特异性反应，并呈现出绿色荧光(图9)，说明本试验中制备的鼠抗血清能够较好地识别病毒表面VP2蛋白，也再次证明经试验所表达的VP2蛋白与实验室分离的IPNV病毒VP2蛋白具有相近的免疫原性。
注：A为无病毒感染对照细胞形态；B为无病毒感染对照细胞免疫荧光检测结果；C为细胞感染IPNV 24 h后细胞形态；D为细胞感染IPNV 24 h后免疫荧光检测结果；E为细胞感染IPNV 48 h后细胞形态；F为细胞感染IPNV 48 h后免疫荧光检测结果
Note：A, control cells without virus infection; B, the IFA result of control cells without virus infection; C, cells infected with IPNV for 24 h; D, the IFA result of cells infected with IPNV for 24 h; E, cells infected with IPNV for 48 h; F, the IFA of cells infected with IPNV for 48 h
图9 VP2蛋白鼠抗血清间接免疫荧光检测结果
Fig.9 IFA of the antisera against VP2 protein
3 讨论
3.1 IPNV ChRtm213分离株的进化分析
随着世界范围内水产品贸易的增加，IPNV已扩散至亚洲的多个国家。从20世纪80年开始，代传染性胰腺坏死病在中国黑龙江、吉林、山东、辽宁、甘肃等地相继暴发[5,17-19]。但这些IPNV毒株的全基因组序列均未被GenBank收录，ChRtm213全基因组序列是中国提交的第一个IPNV全序列[15]。IPNV ChRtm213全基因组的相关信息，如基因组序列、基因型和血清型将为中国以后IPNV毒株的研究提供重要参考。IPN主要发生在中国北部，本研究中IPNV ChRtm213株从位于中国西南的云南省分离获得，是中国传染性胰腺坏死病暴发的现行毒株。与中国学者前期报道的其他IPNV分离株相比较，ChRtm213株具有不同的血清型及病毒毒力[20]，具有非常重要的研究意义。
3.2 VP2蛋白的表达分析
由于VP2蛋白是IPNV病毒表面的主要结构蛋白，能够诱导机体产生免疫中和抗体，在病毒侵入机体时起到关键的作用，目前多将其用于传染性胰腺坏死病的检测及免疫预防研究中[21-23]。由于前期研究表明，异源蛋白在跨物种表达时存在表达困难的情况[24]，而pET表达载体作为高效的异源蛋白表达载体，能够表达多种异源蛋白[25-26]，因此，本研究中利用pET表达载体对VP2蛋白进行原核表达。已有研究表明，利用pET表达载体表达的蛋白多为包涵体[25-26]，而蛋白的跨膜区及疏水区对于其复性过程中的正确折叠有较大影响，因此，本研究中通过已有研究报道及生物学软件分析相结合的方式，对VP2蛋白进行了截断表达。已有研究表明，VP2蛋白的高变区位于183(243)～335位氨基酸[27]，同时，其217～221位氨基酸与病毒的毒力密切相关[28]。本研究中利用TMHMM Server在线分析软件及DNAStar 6.0(Protean)软件，分别对VP2蛋白的跨膜区、亲水性和抗原性等进行了分析。在综合考虑VP2蛋白的跨膜区、亲水性、抗原性和表面可能性后，选取了VP2蛋白的第68～451位氨基酸对应的核苷酸序列进行克隆及原核表达。结果表明，在经过蛋白质的变性及复性后，成功获得了可溶性的VP2蛋白；SDS-PAGE分析结果表明，本研究中所得VP2蛋白在纯度及浓度上与连科讯等[29]及王健楠等[30]的研究相比均有明显提高。这一结果可能是由于去掉跨膜区及部分蛋白质疏水区对VP2蛋白进行表达的缘故。
3.3 VP2抗血清分析
虽然王健楠等[30]于2012年针对IPNV的VP2蛋白已经制备了多克隆抗体，其抗体效价达到了1∶12 800，但其研究中所采用的IPNV病毒是从美国ATCC购买的标准毒株，其血清型为A2，与本研究中报道的中国现行IPNV ChRtm213血清型不同。而本研究中所制备的抗VP2血清为中国现行的IPNV毒株，对中国目前IPNV的检测及研究有较好的指导作用。加之间接ELISA和间接免疫荧光试验结果显示，鼠抗血清可与IPNV分离株细胞培养物或VP2蛋白产生特异反应，效价分别为1∶20 000(包被IPNV病毒培养物)和1∶40 000(包被VP2蛋白)，说明本试验中获得的VP2蛋白具有与IPNV ChRtm213株相近的免疫原性，可用于IPNV的特异性检测和免疫预防[31]。
综上所述，本研究中所用的IPNV ChRtm213病毒株是中国西南地区的现行毒株，对应的血清型为A9或A1，具有与以往毒株不同的病毒毒力[20]，对现行A9或A1血清型毒株的免疫防控和疫苗开发更具有针对性，可为中国不同地区尤其是西南地区的IPNV监测及免疫预防工作提供了技术支持。
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