草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵培养基的优化及其在发酵罐的生长试验

铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa原称绿脓杆菌，是一种常见的条件致病菌，在自然界分布广泛，水、空气，以及人或动物的皮肤、呼吸道和肠道等均有该菌存在[1]，该菌是一种人兽共患菌。目前，铜绿假单胞菌对人、牛、羊、兔、大熊猫、鸭、长江江豚、宽吻海豚、鱼等动物的感染已有大量报道[2-6]。此菌虽为条件性致病菌，但流行甚广，在中国各养殖水域均有流行，对各种养殖鱼类危害严重。因捕捞、运输、放养等操作造成的机械损伤、冻伤，或体表有寄生虫寄生而受损时，病原菌会乘虚而入，引起鱼类赤皮病，可造成严重的经济损失。

草鱼Ctenopharyngodon idellus是中国池塘淡水养殖的主要种类之一，该鱼生长速度快、肉味鲜美,市场需求与价格较稳定,但在养殖过程中草鱼易受病原体的侵袭而导致病害发生。赤皮病是草鱼的一种常见病，常与细菌性肠炎病、烂鳃病等并发，可引起草鱼大量死亡, 给草鱼养殖业带来巨大的损失[7]。目前，该病的治疗仍以抗生素和化学药物为主，效果不甚明显，但随着抗生素的大量使用，病原菌的耐药性特别是多重耐药性日益严重，出现了大量的耐药菌株，同时，药物残留也会降低鱼肉品质，危及环境及食品安全。国外水产养殖业对多种鱼类进行了疫苗接种免疫，已取得了较好的预防效果[8-12]，并充分证明疫苗接种免疫是预防鱼类细菌性病害的有效措施。目前，中国尚无商品化的预防草鱼赤皮病疫苗产品，该疫苗的产业化生产研究及应用也未见报道。因此，开发预防草鱼赤皮病的相关疫苗，对于水产养殖业的发展和水产品安全具有十分重要的意义。本研究中，通过对草鱼铜绿假单胞菌灭活疫苗发酵培养基的优化，培养优质的铜绿假单胞菌菌液，旨在为疫苗的产业化生产工艺提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用铜绿假单胞菌JP802由中国水产科学研究院珠江水产研究所从患赤皮病草鱼病灶分离、鉴定、保存并提供。

营养肉汤：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠5 g/L，pH 7.2±0.2。

试验仪器：恒温摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司，ZWY-211B)；5 L自动发酵罐(日本Bioneer-N，5 L MDL-8c)；紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司，UV1800PC)

1.2 方法

1.2.1 二级种子液的制备将铜绿假单胞菌JP802菌种用营养肉汤培养基溶解后，划线接种于营养琼脂平板，28 ℃下培养24 h，挑取典型菌落接种于含营养肉汤的液体培养基中，28 ℃下震荡培养14～16 h，作为一级种子液。将一级种子液按培养基总量的10%接种于三角瓶中，28 ℃下以180 r/min 恒温培养，每2 h取样1次，测定OD600 nm值，直到菌液OD600 nm值不再增长。取样进行活菌计数，并绘制生长曲线。

1.2.2 氮源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响试验以营养肉汤为基础培养基，分别以等量2.0%的蛋白胨、牛肉膏、酵母膏代替营养肉汤中的氮源进行试验，培养基其他成分不变。按照10%的接种量接种上述培养基，培养12 h时收获菌液，测定其OD600 nm值，比较不同氮源对培养菌液浓度的影响。

1.2.3 碳源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响试验以营养肉汤为基础培养基，分别以等量0.5%的葡萄糖、甘油、蔗糖、麦芽糖代替营养肉汤中的碳源进行试验，培养基其他成分不变。按照10%的接种量接种上述培养基，培养12 h时收获菌液，测定其OD600 nm值，比较不同碳源对培养菌液浓度的影响。

1.2.4 磷源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响试验以营养肉汤为基础培养基，分别以等量0.5%氯化钠、氯化钾代替营养肉汤中的无机盐进行试验，培养基其他成分不变。按照10%的接种量接种上述培养基，培养12 h时收获菌液，测定其OD600 nm值，比较钠、钾离子对培养菌液浓度的影响。

以营养肉汤为基础培养基，分别添加等量0.5%的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾进行试验，培养基其他成分不变。按照10%的接种量接种上述培养基，培养12 h时收获菌液，测定其OD600 nm值，比较不同磷源培养基对培养菌液浓度的影响。

1.2.5 正交试验根据单因素试验结果，对蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾用量5因素，各取4个水平，设计L16(45)正交试验优化培养基组成，试验因子水平见表1。

1.2.6 验证试验将铜绿假单胞菌JP802种子液按10%比例接种到优化得到的最佳培养基、正交试验中菌体浓度最高的培养基和营养肉汤培养基中，在28 ℃下震荡培养18 h，观察该菌在培养基中的生长情况，验证正交试验结果是否准确。

1.2.7 铜绿假单胞菌JP802在优化培养基条件下的发酵罐生长试验采用优化后的培养基配方，配制3 L培养基，放入5 L的发酵罐中高压灭菌，待冷却至28 ℃时，以10%比例接种铜绿假单胞菌JP802菌液于优化后的液体培养基中，发酵罐培养温度为28 ℃，转速为350 r/min，通气量为4 L/min，每隔 2 h取样测定OD600 nm值，绘制该菌16 h的生长曲线。

1.3 数据处理

每组试验设3个重复，结果取其平均值，试验数据采用Excel 2010软件、SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 种子液培养时间的确定

从图1可见，铜绿假单胞菌JP802二级种子液培养12～14 h后，OD600 nm值到达高峰，菌液浊度最大，14 h后OD600 nm值开始下降，表明铜绿假单胞菌二级种子液的培养时间不能超过14 h，以12～14 h为佳，取样活菌计数结果为2.94×109 cfu/mL。

2.2 氮源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

从图2可见：以蛋白胨+牛肉膏+酵母膏作为培养基复合氮源时，铜绿假单胞菌的浓度最高且显著高于其他氮源培养基组(P<0.05)，OD600 nm值为3.70；以蛋白胨+酵母膏及蛋白胨+牛肉膏作为氮源时，铜绿假单胞菌浓度次之，OD600 nm值为3.40；而以蛋白胨作为单一氮源时，铜绿假单胞菌浓度最低，OD600 nm值仅为2.30。说明复合氮源比单一氮源效果更好。因此，选择蛋白胨+牛肉膏+酵母膏组成的复合氮源作为培养基氮源。

2.3 碳源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

从图3可见，在葡萄糖、甘油、麦芽糖、蔗糖4种碳源中，以葡萄糖作为培养基碳源时菌体浓度最高且显著高于其他碳源组(P<0.05)，OD600 nm值为3.50，其次为蔗糖、麦芽糖，以甘油为碳源时，铜绿假单胞菌生长菌液浓度最低。因此，选择葡萄糖作为培养基最佳碳源。

2.4 磷源种类对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

从图4可见，培养基中添加等量的氯化钠、氯化钾，对铜绿假单胞菌菌液的浓度无显著性影响(P>0.05)。

从图5可见，含钾的磷酸盐对铜绿假单胞菌菌液浓度的影响大于含钠的磷酸盐，以磷酸氢二钾(K2HPO4)作为培养基磷源时，铜绿假单胞菌菌液的浓度最高且显著高于其他组(P<0.05)，OD600 nm值为3.33，其次为磷酸二氢钾(KH2PO4)，最低为磷酸氢二钠(Na2HPO4)。因此，选择磷酸氢二钾作为培养基磷源。

2.5 正交试验

对蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾用量5因素，各取4个水平，设计L16(45)正交试验，以确定最佳组合培养基用量。正交设计各培养基因子用量、正交试验设计及结果见表1、表2。正交试验结果显示，6号试验组中铜绿假单胞菌浓度最高(OD600 nm=3.84)，13号试验组中菌体浓度最低(OD600 nm=2.73)。经极差分析显示，5种培养基对铜绿假单胞菌培养浓度的影响大小依次为蛋白胨>牛肉膏>酵母膏>磷酸氢二钾>葡萄糖，培养基最佳用量组合为A2B2C1D2E3，即蛋白胨10 g/L、牛肉膏5.0 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L和磷酸氢二钾0.75 g/L。

表2 培养基不同成分对铜绿假单胞菌浓度影响的正交试验设计及试验结果
Tab.2 Design and results of the orthogonal test on different ingredients of medium on growth of Pseudomonas aeruginosa JP802

2.6 验证试验

将铜绿假单胞菌JP802在正交试验中优化得到的最佳培养基、正交试验中菌体浓度最高的6号试验组培养基和营养肉汤(NB)培养基进行验证试验，培养条件均为28 ℃、pH 7.2±0.2、180 r/min，振荡培养18 h，结果见图6，经统计分析显示，用正交试验得到的优化培养基培养18 h时的菌体 OD600 nm值显著高于其他2种培养基(P<0.05)，培养时间为10～18 h用优化培养基培养的菌体OD600 nm值比用营养肉汤(NB)培养基培养的平均提高30%(图6)。

从表3可见，优化培养基、6号试验组培养基不同培养条件极显著影响TP802菌株的生长。可以初步判断，正交试验结果准确，得到的优化培养基比初始培养基好。

2.7 铜绿假单胞菌JP802在优化培养基条件下的发酵罐生长曲线

根据正交试验优化结果，配制含蛋白胨10 g/L、牛肉膏5.0 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L、磷酸氢二钾0.75 g/L、氯化钠5.0 g/L、pH 7.2±0.2的发酵培养基，在 28 ℃、350 r/min条件下发酵培养16 h，铜绿假单胞菌生长曲线见图7。结果显示，铜绿假单胞菌发酵培养12～14 h进入生长高峰期，发酵14 h达到生长高峰，发酵16 h后进入衰亡期。

3 讨论

3.1 氮源对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

铜绿假单胞菌培养一般采用营养肉汤(NB)培养基(含蛋白胨)，也有采用LB、TSB培养基(含胰蛋白胨)[13]，在大规模培养时要求使用成本低、得率高、原材料易得到的培养基进行细菌培养，以降低生产成本，其中，胰蛋白胨成本价格远高于蛋白胨。本研究中选取的菌株是从患赤皮病草鱼病灶分离、鉴定并经筛选出的铜绿假单胞菌，从草鱼赤皮病疫苗研发应用的角度出发，研究了氮源对铜绿假单胞菌发酵菌液产量的影响，研究结果表明，以蛋白胨、牛肉膏、酵母膏组合的复合氮源比单一氮源更能促进铜绿假单胞菌的生长。张秀明等[14]研究表明，乳酸乳球菌N302在2%蛋白胨+3%酵母粉的培养液中，无论是菌体量还是乳酸链球菌素活性均优于其他单一氮源浓度；卢金珍等[15]研究发现，乳链菌肽Nisin在2%蛋白胨+1%酵母膏组成的复合氮源中培养，乳链菌肽Nisin效价最高，为890.18 IU/mL，与本研究结果相似。

注：**表示有极显著性影响(P<0.01)
Note: ** means very significant effect(P<0.01)

3.2 碳源对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

黄秀敏等[16]研究了蜡样芽孢杆菌的生长碳源优化，最佳碳源为可溶性淀粉，OD值达14，其次是葡萄糖，最差的为玉米淀粉。但是考虑到可溶性淀粉为多糖，而葡萄糖作为速效碳源，能迅速启动菌体生长，缩短发酵周期，故选择葡萄糖和水溶性糖类淀粉搭配使用作为复合碳源。夏立群等[17]研究了葡萄糖、甘油、麦芽糖和蔗糖4种碳源对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响，4种不同碳源对鰤鱼诺卡氏菌的菌体浓度有明显影响，以葡萄糖为碳源时菌体浓度最高，其次为蔗糖，在以麦芽糖为碳源时生长最为缓慢。黄秀敏等[18]研究了植物乳杆菌发酵的最佳碳源为蔗糖，其次是葡萄糖，最差的是可溶性淀粉，这可能跟可溶性淀粉为多糖，不易被植物乳杆菌利用有关。糖类是最广泛利用的碳源，其中葡萄糖的利用优于其他糖类[19]。本试验中以葡萄糖作为最佳碳源的研究结果与上述研究结果相近。

3.3 磷源对铜绿假单胞菌JP802生长的影响

磷酸氢盐可为细菌生长提供4种生长需要量最大的元素[19]，夏立群等[17]研究了K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、CuSO4、FeSO4、ZnSO4、MnSO4 8种无机盐对鰤鱼诺卡氏菌生长的影响，结果表明，对鰤鱼诺卡氏菌生长有明显促进作用的是K2HPO4和CaCl2。阙斐[20]研究了MnSO4、FeSO4·7H2O、CaCO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、CaCl2 6种不同种类的无机盐培养基成分对枯草芽孢杆菌芽孢生成的影响，结果表明，K2HPO4对细菌生长及芽孢的促进作用与其他种类无机盐相比为同浓度下最大。卢金珍等[15]研究了K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4为磷源时对乳链菌肽发酵的影响，结果表明，K2HPO4为磷源时发酵液效价最高，磷酸盐的主要作用可能在于它的缓冲能力，它可以阻止发酵液酸度的过分下降，从而有利于菌体生长和乳链菌肽的合成。本试验中以磷酸氢二钾作为最佳磷源的研究结果与上述结果相近。

4 结论

铜绿假单菌株在优化后的培养基中经摇瓶培养18 h后，其菌液OD600 nm值比优化前(营养肉汤培养基)提高了30%，通过验证培养试验确立了铜绿假单胞菌发酵培养基的最佳优化组成为蛋白胨10 g/L、牛肉膏5.0 g/L、酵母膏2.5 g/L、葡萄糖5.0 g/L、磷酸氢二钾0.75 g/L、氯化钠5.0 g/L，在此条件下，铜绿假单胞菌在5.0 L发酵罐发酵培养14 h时,菌体浓度达到最大(OD600 nm值为6.44)。

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