25种中草药及其联合用药配伍对5种水产养殖常见致病菌的抑菌作用

近年来，集约化水产养殖发展迅猛，各种疾病也随之发生，尤其是细菌性流行病频发，已成为制约养殖业持续健康发展的重大障碍，给养殖业造成了巨大的经济损失[1]。常见的细菌性致病菌有嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila[2]、副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus[3]、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus[4]、假单胞菌Pseudomonas fluorescens[5]和弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii[6]等。嗜水气单胞菌是危害鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类动物的一种条件致病菌，广泛分布在河口、淡水及沿海等水域[7]，其分泌的肠毒素可引起腹水病、腐皮病等多种疾病[8]。副溶血弧菌产生的溶血毒素可使对虾及海水鱼类体表充血、发炎，同时对蛤、鲍、牡蛎、扇贝等贝类危害性很大[9]。蜡样芽孢杆菌会引起水产动物肠道出血性死亡[10]。荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌属条件性致病菌[11]，能引起动物败血症甚至急性死亡。2017年6月22日农业农村部印发了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017—2020年)》，并提出推进兽用抗菌药物减量化使用、优化兽用抗菌药物品种结构等 5 条行动目标[12]。在养殖生产中，预防和治疗细菌性疾病最常用的就是各类抗生素，这不仅使病原菌产生耐药性，还易产生抗生素残留，影响水产品的食物安全性和水体环境[13]。随着水产养殖中细菌耐药形势越来越严峻，迫切需要新型抗菌药物。其中中草药作为中国传统医学的重要组成部分，历史悠久，药源丰富，可利用其含有的多种活性成分，通过多途径发挥抑菌杀菌作用，在水产养殖对象受到急慢性感染时，不仅可以抗菌消炎，不易产生耐药性，还具有全面的调理作用[14]，同时还可减少农药残留、保护环境[15]。

单味中草药的抑菌作用研究已多见诸文献中，彭金菊等[16]研究发现，石榴皮对致病菌的抑菌作用很弱，与曹良等[17]的研究结果不同。肖辉等[18]与罗新等[19]关于黄连和白头翁抑菌效果的研究结果不同。即不同研究者报道的同一种药物对同一种病原菌的抑菌作用，其结果不同。此外，仅用单一的中草药对细菌进行抑制，一旦细菌适应产生耐药性，此种中草药材的效果就大大降低[20]。联合用药，即采用两种或两种以上药物配伍达到治疗目的，可使药物互相作用的概率增加，增强药效，降低耐药性，减少不良反应发生的同时，保证药物达到抑菌杀菌的作用[21]。邓家刚等[22]、张文青等[23]利用药物之间的协同作用进行抑菌药物配伍，在治疗水产动物疾病时选用中草药组成的复合方剂取得了良好防治效果。鉴于所报道的中草药对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌的体外抑菌效果不尽一致[13]，且尚未见联合用药对这5种致病菌综合比较的抑菌作用报道，本试验中测定了25种中草药对水产养殖中常见的5种细菌致病菌的抑制作用，通过药物间配伍，研究中草药体外联合抗菌效果并进行药物配伍对5种致病菌抑制作用的综合比较，筛选出具协同抗菌效果的组合，旨在为实际生产中的病害防控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌等病原，从江西南昌县的8个草鱼养殖场分离、鉴定并保存。

试验用固体培养基包含酵母浸粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、琼粉1.5%，121 ℃下灭菌备用。液体MH培养基，购自杭州微生物试剂有限公司(批号20160307-00)。

试验用中草药购自大连市沙河口区同仁堂大药房，试验中草药及其供试部位见表1。

1.2 方法

1.2.1 中草药提取液制备将供试中草药于60 ℃恒温干燥箱中烘至恒重，各取50 g，非挥发性块状中草药可直接放到洗净的砂锅中，粉末状中草药需用纱布包裹起来投入砂锅，各加500 mL水，浸泡3 h以后煎煮，煮沸后文火30 min，将滤液移至锥形瓶，重复煎煮3次，合并滤液后浓缩至生药含量1000 mg/mL，调pH值至中性，通过121 ℃高温湿热灭菌后，置于4 ℃冰箱保存待用[24]。

1.2.2 致病菌菌液与药敏片制备将嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌分别划线，28 ℃下恒温培养24 h。用平板计数法计数后，取单菌落接种于肉汤培养基中，28 ℃下以 180 r/min培养4 h。然后吸取100 μL菌液均匀涂布于无菌琼脂平板上，28 ℃下培养4 h，洗下菌苔液，用麦氏比浊法测定其密度，将菌液密度调整为1.0×107 CFU/mL，于4 ℃冰箱中保存待用[25]。将高压灭菌烘干后的圆形滤纸片(直径6 mm)吸收各种药液后烘干，置于灭菌试管中，4 ℃冰箱中保存待用[26]。

1.2.3 药物抑菌试验取100 μL菌悬液均匀涂布于平板上，采用纸片琼脂扩散法(K-B纸片扩散法)[27]，每种药敏片设3个平行，28 ℃下恒温培养24 h。观察并用游标卡尺在抑菌圈不同方向多次测量直径，取其平均值。

参照最小抑菌浓度和最小杀菌浓度计算的结果，进行中草药抑菌效果等级划分。抑菌圈直径为0 mm时，表示无抑菌作用，用“-”表示；0～5 mm为抑菌作用弱，用“+”表示；5～10 mm为抑菌作用中等，用“++”表示；大于10 mm为抑菌作用强，用“+++”表示。

1.2.4 用单一中草药测定其对5种致病菌最小抑菌浓度和最小杀菌浓度采用二倍稀释法[18]测定。根据抑菌试验结果选取其中抑菌作用强的药物，为每种药物准备12支灭菌的10 mL试管，依次编号。在无菌条件下为每种药物配制10个中草药浓度，同时设置阴性和阳性对照组。将100 μL菌液接种到各浓度试管中，28 ℃恒温培养24 h，重复测定3次。观察结果，无菌生长试管清澈透明，其最低药物浓度为最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)；对于难以判断的试管进行平板涂布培养，根据平板上致病菌生长情况来确定试管内菌体生长情况。

在MIC试验基础上，摇动混匀试管中菌液后于28 ℃下继续培养24 h，观察结果，清澈透明无浑浊现象的试管即为无菌生长试管，无菌生长试管中的最低药物浓度，即为最小杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)。

1.2.5 用中草药配伍测定其对5种致病菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度采用二倍稀释法[27]测定，联合用药试剂添加量见表2。将抑菌试验结果中抑菌作用强的药物分别以乌梅+石榴皮、乌梅+黄连、乌梅+白头翁、石榴皮+黄连、石榴皮+白头翁、黄连+白头翁的组合方式组成6组，每组准备12支灭菌的10 mL试管，依次编号。第一个管中加入1.0 mL MH液体培养基，两种中草药原液各0.5 mL，菌液0.1 mL，在无菌条件下配制10个中草药浓度；第11只管为只加菌液不加药液的生长对照(阳性对照)，第12只管为只加药液的空白对照(阴性对照)。用无菌微量移液器吸取100 μL菌液接种到各浓度的试管中，28 ℃恒温培养24 h，重复测定3次。观察结果，无菌生长试管清澈透明，其最低药物浓度为最小抑菌浓度；对于难以判断的试管进行平板涂布培养，根据平板上致病菌生长情况来确定试管内菌体生长情况。

在MIC试验基础上，摇动混匀试管中菌液后于28 ℃下继续培养24 h，观察结果[27]，清澈透明无浑浊现象的试管对应的最低药物浓度，即为最小杀菌浓度。

2 结果与分析

2.1 单一中草药的抑菌效果

从表3可见：25种单一中草药的抑菌活性各不相同，从抑菌圈的直径大小来看，乌梅、石榴皮、黄连、白头翁的抑菌效果最强，其对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌的抑菌圈直径均在10～30 mm范围内，抑菌作用基本上都强(+++)；夏枯草、青蒿、小蓟、赤芍、扁蓄、海金沙、金樱子7种中草药的抑菌圈直径为5～10 mm，抑菌作用大多为中等(++)；野菊花等9种中草药的抑菌圈直径为0～5 mm，抑菌作用低(+)；青黛、半夏2种中草药无抑菌作用(-)，天南星对蜡样芽孢杆菌直径为12.56 mm，有强抑制作用，而对其他致病菌抑制作用弱或无。根据本研究中的体外抑菌结果，选用乌梅、石榴皮、黄连、白头翁作为防治这5种致病菌的首选抑菌药物单方。

注：+表示抑菌作用弱；++表示抑菌作用中等；+++表示抑菌作用强；-表示无抑菌作用
Note：+,weak bacteriostasis；++,medium bacteriostasis；+++,strong bacteriostasis；-,no bacteriostasis

2.2 单一中草药的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

选取抑菌圈直径大于10 mm的药物(乌梅、石榴皮、黄连、白头翁)，采用二倍稀释法测定药物的MIC和MBC，结果见表4。乌梅对嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌、蜡样芽孢杆菌的抑菌作用和杀菌作用最强，对前3种致病菌的MIC均为15.63 mg/mL，对蜡样芽孢杆菌的MIC为7.81 mg/mL,对这4种致病菌的MBC均为15.63 mg/mL；黄连对副溶血弧菌的抑菌杀菌作用最大，MIC为15.63 mg/mL，MBC为31.25 mg/mL；石榴皮、白头翁均有一定的抑菌效果，石榴皮对5种致病菌的MIC、MBC在15.63～31.25 mg/mL之间，白头翁对5种致病菌的MIC、MBC在31.25～125 mg/mL之间。

2.3 联合用药的最小抑菌浓度

采用试管二倍稀释法测定药物的MIC，结果见图1，乌梅+石榴皮或乌梅+白头翁的抑菌效果最明显。其中，乌梅+石榴皮对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、弗氏柠檬酸杆菌的抑菌作用和杀菌作用最强，MIC最小，均为7.81 mg/mL；乌梅+白头翁对蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌的抑菌作用和杀菌作用最强，MIC均为7.81 mg/mL；乌梅+黄连对5种致病菌的MIC次之，MIC在15.63～31.25 mg/mL之间，另外3种组合石榴皮+黄连、石榴皮+白头翁、黄连+白头翁对5种致病菌的MIC较大，为31.25～250 mg/mL。

6种配伍组合与单一用药相比，乌梅+石榴皮、乌梅+黄连、乌梅+白头翁这3种组合的抑菌效果明显。其中乌梅+石榴皮(MIC平均值为10.94 mg/mL)、乌梅+白头翁(MIC平均值为14.06 mg/mL)组合抑制嗜水气单胞菌、蜡样芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、荧光假单胞菌的均值效果优于单一抑菌效果最佳的乌梅(MIC平均值为17.19 mg/mL)，且抑制副溶血弧菌效果好于单一抑菌效果最佳的黄连(MIC平均值为25.00 mg/mL)。针对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌，乌梅+石榴皮是最优抑菌组合；针对蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌，乌梅+白头翁是最优抑菌组合；针对弗氏柠檬酸杆菌，乌梅+石榴皮、乌梅+白头翁抑菌作用相同，均为最优抑菌组合。另外3种组合，石榴皮+黄连、石榴皮+白头翁、黄连+白头翁与单一中草药相比均无明显抑菌现象。综合上述，乌梅+石榴皮、乌梅+白头翁可作为此5种致病菌杀菌药物的首选配伍组合。

3 讨论

3.1 不同中草药的抑菌效果

本试验结果表明，在试验条件相同的情况下，乌梅、石榴皮、黄连、白头翁的抑菌效果最好，其抑菌圈均达到10 mm以上。张文青等[23]报道，乌梅对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度达12.5 mg/mL，张海宾等[28]研究显示，乌梅抑制嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为10.2 mm，最小抑菌浓度50 μg/mL。本试验结果表明，乌梅对这5种致病菌的抑菌和杀菌效果最好，抑杀蜡样芽孢杆菌作用最强，抑菌圈直径达19.81 mm，最小抑菌浓度为7.81 mg/mL，对其他4种致病菌最小抑菌浓度为15.63～31.25 mg/mL。对其他4种致病菌无作用的天南星对蜡样芽孢杆菌抑菌作用很强，抑菌圈直径达12.56 mm，与肖辉等[18]报道天南星抑菌圈直径为9.31 mm相近。石榴皮、黄连、白头翁对5种致病菌有一定抑菌作用。李茜等[29]报道，石榴皮对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径达30.18 mm；曹红峰等[30]研究显示，石榴皮对嗜水气单细胞菌的抑菌圈直径为16.56 mm，最小抑菌浓度为6.25 mg/mL。本试验中石榴皮对嗜水气单细胞菌的抑菌圈直径在10 mm以上，最小抑菌浓度为15.63～31.25 mg/mL。本研究结果与上述研究结果有一定差异。张文青等[23]报道黄连抑制嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为50 mg/mL，白头翁的抑菌作用次之；李春涛等[25]报道白头翁抑制嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度为125 mg/mL；罗新等[19]报道白头翁对嗜水气单胞菌的抑菌圈直径为6.5 mm。本研究中，黄连和白头翁对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度分别为31.25、62.50 mg/mL。不同研究者的报道存在一定差异的主要原因可能是菌株的来源不同，田甜[31]研究表明，抗菌药物对不同地区分离到的致病菌抑菌杀菌效果不同。

3.2 中草药联合用药配伍的抑菌效果

邓家刚等[22]报道，利用不同药物间的协同作用，将两种或两种以上的药物进行配伍，使其共同作用于致病菌，对水产动物整体治疗有良好效果。本试验中选取抑菌圈直径大于10 mm的药物乌梅、石榴皮、黄连、白头翁，对其进行不同组合配伍，并研究各配伍组合对5种致病菌的抑菌作用，结果表明，乌梅+石榴皮对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌抑菌效果最好，乌梅+白头翁对蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌抑菌作用最强；乌梅+石榴皮、乌梅+白头翁对弗氏柠檬酸杆菌抑菌作用相同，均为最优抑菌组合。药物配伍的效果优于单方药物，且针对这5种致病菌，乌梅+石榴皮或乌梅+白头翁可作为抑菌药物的首选配伍组合。张文青等[23]在探讨中草药对嗜水气单胞菌的最佳配伍组合时发现：儿茶、五倍子、五味子、乌梅配伍最小抑菌浓度为5.86 mg/mL。张海宾等[28]研究表明，选用黄芩、黄连、五倍子等配伍用药，对治疗鳖的白点病效果显著。同本试验相比，有相同的乌梅、黄连组成成分。本研究结果与其他研究报道的差异可能是由于供试菌株的分离源、菌株血清型、中草药采集地不同。在防治水产疾病的实际生产中，将抑菌效果不同的中草药组合成具有协同作用的复方制剂可发挥更好的抑菌作用[32-33]。此外，由于在离体和在体的作用环境下，中草药的活性成分相差甚大，还需通过测定水产动物体内一些指标的变化来研究中草药配伍对体内致病菌的抑制作用[34]。

3.3 中草药在水产养殖业中的潜在应用价值

中草药具有潜在的可开发成安全环保水产抗菌药物的价值，其抗菌效果的研究已经成为国内外关注的焦点。中草药是天然药物，具有高安全性、低毒性、不容易产生耐药性、易降解、价格低廉及不会造成环境重大污染等特点，在水产养殖业中，中草药作为饲料添加剂，其药用与营养价值有机结合，可促进水产养殖业发展[35-36]。同时中草药含有的多种抑制细菌生长作用的活性物质[20,37]，可有效增强水产养殖动物的免疫力[38-39]。本试验中，采用的25种中草药对5种常见致病菌均有抑制作用。除了应用单方中草药抑菌外，中草药联合应用的抑菌效果也很理想[33]。在本试验中，将中草药进行配伍,联合配伍的抑菌效果明显优于单方中草药。所以，以联合用药的思路开发渔用中草药的同时，也要结合中医学理论体系，从整体的角度去把握疾病的发生、发展，强调内外环境统筹兼顾、有机协调、和谐统一，更加全面地发挥中草药在水产养殖病害防控中的效用。

4 结论

25种中草药对5种致病菌(嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、蜡样芽孢杆菌、荧光假单胞菌和弗氏柠檬酸杆菌)均有抑制作用，乌梅、石榴皮、黄连、白头翁的抑菌作用最强，其抑菌圈直径达10～30 mm，MIC<62.5 mg/mL，MBC<125 mg/mL。其中对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌抑菌作用最明显的是乌梅，MIC均为15.63 mg/mL，对副溶血弧菌抑菌作用最明显的是黄连，MIC为15.63 mg/mL，对蜡样芽孢杆菌抑菌作用最明显的是乌梅，MIC为7.81 mg/mL。利用乌梅、石榴皮、黄连、白头翁之间的协同作用进行配伍，共同作用于这5种致病菌，其抑菌效果优于单方药物，且针对这5种致病菌，乌梅+石榴皮或乌梅+白头翁可作为抑菌药物的首选配伍组合。

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