大菱鲆Scophthalmus maximus俗称多宝鱼，肉质鲜美、营养丰富，是中国北方地区主要海水养殖鱼类品种之一[1]。近年来，随着大菱鲆养殖业逐渐向集约化、规模化发展，养殖过程中病害频发，常见症状有腹水病、红体病、爱德华氏症等一系列疾病[2]。为了预防疾病的暴发，促进动物生长发育和提高饲料利用率，大量化学合成的饲料添加剂和抗生素药品在饲料中普遍使用，导致鱼体耐药性和严重的药物残留问题，其中，2006年出现的“多宝鱼药残超标事件”，严重影响了大菱鲆养殖业的持续发展。因此，研制大菱鲆配合饲料绿色添加剂，提高健康养殖水平是推动大菱鲆等海水养殖业可持续发展的关键之一。
中草药主要起源于中国，在中医理论体系中，多数兼有药用和食用双重作用。中草药作为一种天然绿色饲料添加剂，含有丰富的生物活性物质和营养成分，既可提高消化酶活性，促进营养物质的消化吸收，提高水产动物的生长性能，又可提高水产动物非特异性免疫功能，避免化学药物和抗生素引起的药残超标和耐药性等一系列问题[3-5]。国内外学者研究发现，中草药黄芪、党参、杜仲、白术、茯苓、甘草、陈皮、牛膝、旱莲草等多种中草药对水产动物的消化吸收及生长有不同程度的促进作用[6-11]。目前，中草药饲料添加剂在生产过程中多为原料药粉碎后直接搅拌添加到饲料中，因添加量大，饲料适口性受到影响。本试验中选取河北农业大学水产经济动物增养殖重点实验室配制的几种中草药添加剂，采用砂锅熬煮方式，将熬煮中药汤汁过滤后定量加入基础饲料中，以此研究几种不同配方中草药对大菱鲆生长、免疫性能的影响，旨在为大菱鲆疾病防控及健康养殖提供参考。
大菱鲆幼鱼购于黄骅市鑫海生物技术有限公司。
1.2.1 试验饲料的配制 中草药添加剂：根据中药配伍理论设计4组复方中草药配方。配方Ⅰ由甘草(15 g)、当归(30 g)、茯苓(30 g)、白芍(30 g)、白术(30 g)、柴胡(30 g)组成；配方Ⅱ由炒枳实(60 g)、白术(120 g)组成；配方Ⅲ由金银花(30 g)、杏仁(30 g)、五味子(30 g)、山楂(30 g)组成；配方Ⅳ由炒白术(60 g)、炒白芍(40 g)、陈皮(30 g)、防风(40 g)、黄芪(90 g)。分别按配方抓取中草药，在冷水中浸泡30 min，加入1 L蒸馏水在砂锅中大火煮沸10 min，文火熬制30 min，熬制成汤药，过滤残渣，留中草药水煎液备用。
试验饲料：在河北农业大学水产经济动物增养殖重点实验室对大菱鲆配合饲料配方的研究基础上[12]，以鱼粉、豆粕和虾粉为蛋白源，鱼油、玉米油作脂肪源，淀粉为糖源，设计蛋白质水平为50%、脂肪水平为10%的基础饲料配方。试验基础饲料中所有原料均经粉碎机粉碎，过60目筛，按表1比例均匀混合。置于搅拌机中搅拌9 min，搅拌过程中按饲料质量的2%添加不同配方中草药浸出液及蒸馏水(基础饲料只加蒸馏水)，饲料经膨化机膨化后制作成颗粒状饲料，自然风干12 h，装袋后于-20 ℃条件下保存备用。不同中草药配方饲料营养成分测定(干物质基础)结果显示(表2)，各组试验饲料的营养水平符合大菱鲆幼鱼饲料营养成分的需求。各组饲料的粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分各营养指标与对照组均无显著性差异(P>0.05)。
表1 试验饲料配方(干物质基础)
Tab.1 Ingredients of experimental diets(dry matter basis)w/%
组别group鱼粉fish meal豆粕soy bean meal虾粉shrimp meal面粉wheat flour其他1)others中药配方Chinese herbal medicine compoundD0(对照)50.020.03.017.49.6—D1(配方Ⅰ)50.020.03.017.49.6甘草、当归、茯苓、白芍、白术、柴胡D2(配方Ⅱ)50.020.03.017.49.6炒枳实、白术D3(配方Ⅲ)50.020.03.017.49.6金银花、杏仁、五味子、山楂D4(配方Ⅳ)50.020.03.017.49.6炒白术、炒白芍、陈皮、防风、黄芪
注：1)其他为鱼油3.0%，玉米油3.0%，卵磷脂1.0%，胆碱0.5%, VC磷酸酯0.5%，DMPT 0.1%，复合维生素1.0%，复合矿物盐0.5%
Note:1)The others include 3.0% fish oil, 3.0 % corn oil, 1.0% lecithin, 0.5% choline, 0.5% ascorbic acid, 0.1% DMPT, 1.0% witamin mix, and 0.5% mineral mix
表2 不同中草药配方饲料营养成分(干物质基础)
Tab.2 Approximate nutrition of diets containing different Chinese herbal medicine compounds(dry matter basis)w/%
组别 group粗蛋白质 crude protein粗脂肪 crude fat粗灰分 crude ashD050.51±0.0110.72±0.3813.69±0.04D150.03±0.6510.46±0.7813.33±0.09D250.59±0.3610.33±0.9913.72±0.03D350.48±0.2111.81±0.1013.57±0.05D450.47±0.1110.47±0.9313.63±0.03
1.2.2 试验设计及饲养管理 将240尾平均体质量为10 g的大菱鲆幼鱼随机分为5组，每组设3个重复，每个重复放16尾幼鱼，养殖箱为玻璃水族箱(0.4 m×0.5 m×0.6 m)。整个养殖期间采用循环流水系统，养殖用水为渤海自然海水(消毒、沉淀、沙滤)，盐度为30.20±0.02，24 h连续充氧，日光灯照射10 h，冷暖机控制温度为(17±1)℃，每天定量投喂2次(8:00和18:00)，每两周称重一次，日投喂量为体质量的2%～3%。每天定时换水，每两周测定溶解氧和氨氮等指标，试验周期为8周。
1.2.3 样品采集 试验结束后，对所有鱼禁食1 d，称重、测量其体长；从每组取3尾鱼做体成分分析；从每组取6尾鱼，用1.5 mL一次性无菌注射器(肝素钠润洗)从心脏抽血用于免疫指标和理化指标的测定。采血后解剖，取其胃、前肠组织用于消化酶的测定。将血样置于冰箱(-20 ℃)中过夜，于4 ℃下以3000 r/min 离心10 min，得到血浆样品，用于葡糖糖、甘油三酯和胆固醇等生化指标测定。
1.2.4 指标的测定与计算 大菱鲆幼鱼的存活率(%)、增重率(WGR,%)、特定生长率(SGR，%/d)、蛋白质效率(PER，%)、饲料系数(FCR)、肥满度(CF，%)、肠脂体比(IPR，%)、脏体比(VSI，%)计算公式分别为
存活率=100%×N0/Nt，
增重率=100%×(Wt-W0)/W0,
特定生长率=100%×(lnWt-lnW0)/t,
蛋白质效率=100%×(Wt-W0)/(F×P),
饲料系数=F/(Wt-W0)，
肥满度=100%×Wt/L3,
肠脂体比=100%×Wc/Wt,
脏体比=100%×Wn/Wt。
其中：N0、Nt分别为试验开始和试验结束时大菱鲆体数量(ind.)；W0、Wt分别为试验开始和试验结束时大菱鲆体质量(g)；Wc为肠系膜脂肪质量(g)；Wn为内脏团质量(g)；L为体长(cm)；F为饲料摄食量(g)；P为饲料中蛋白质含量(%)；t为试验时间(d)。
采用国标法、微量凯氏定氮法、索氏抽提(石油醚)法和马弗炉550 ℃灼烧法分别测定体成分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分含量。
消化及免疫指标：胃组织蛋白酶PPS(福林试剂比色法)、前肠脂肪酶LPS(比浊法)，以及血浆溶菌酶LZM(自身对照法)、碱性磷酸酶ALP(铁氰化钾法)、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px(二硫双硝基苯甲酸法)、总超氧化物歧化酶T-SOD(羟胺法)活力均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定。
试验结果采用平均数±标准差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 17.0软件进行单因子方差分析(One-way ANOVA)，若组间有显著性差异，再采用LSD法进行多重比较，显著性水平设为 0.05。
从表3可见：D2组大菱鲆幼鱼增重率、特定生长率和蛋白质效率显著高于对照组D0(P<0.05)，饲料系数显著低于D0组(P<0.05)；D3、D4组增重率、特定生长率显著低于D2组(P<0.05)，但与对照组无显著性差异(P>0.05)；D1组各指标均与对照组无显著性差异(P>0.05)；各组间成活率无显著性差异(P>0.05)。
表3 复方中草药对大菱鲆生长性能及饲料利用情况的影响
Tab.3 Effects of Chinese herbal medicine compounds on growth performance and feed utilization of turbot
组别group初始体质量/ginitial body weight成活率/%SR增重率/%WGR特定生长率/(%·d-1)SGR摄食量/gFI蛋白质效率/%PER饲料系数FCRD010.39±0.4896.88±4.42183.24±11.18a1.82±0.07a1.61±0.042.07±0.11a0.96±0.04bD110.53±0.6590.63±4.42209.45±24.78ab1.98±0.14ab1.62±0.042.35±0.23ab0.86±0.08abD210.37±0.0087.50±8.84227.95±25.02b2.08±0.13b1.65±0.082.38±0.10b0.83±0.02aD310.23±0.8387.50±0.00189.91±13.61a1.87±0.08a1.65±0.092.11±0.19ab0.93±0.08abD410.25±0.0791.67±7.22194.69±6.05a1.90±0.04a1.59±0.022.20±0.05ab0.90±0.02ab
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note: The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences, et sequentia
从表4可见：不同中草药配方饲料对大菱鲆形体指标的影响表明，D1组脏体比显著高于D0组和D4组(P<0.05)，与其他中草药组均无显著性差异(P>0.05)；各组肠脂比及肥满度均无显著性差异(P>0.05)。
表4 复方中草药对大菱鲆形体指标的影响
Tab.4 Effect of Chinese herbal medicine compounds on physique indices of turbot%
组别 group脏体比 VSI肠脂体比 IPR肥满度 CFD06.53±0.49a0.09±0.03347.81±45.58D17.54±0.69b0.15±0.14349.34±35.70D27.03±0.26ab0.06±0.04377.36±19.13D36.93±0.36ab0.05±0.04346.99±24.74D46.59±0.21a0.07±0.02345.05±52.67
从表5可见：各组大菱鲆幼鱼全鱼水分、粗蛋白质、粗脂肪和粗灰分等指标均无显著性差异(P>0.05)，D2组蛋白质、粗脂肪含量较高。
表5 复方中草药对大菱鲆体内营养成分的影响
Tab.5 Effect of Chinese herbal medicine compounds on whole body approximate composition of turbotw/%
组别 group水分 moisture粗蛋白质 crude protein粗脂肪 crude lipid粗灰分 crude ashD075.41±4.2715.64±2.217.83±1.883.25±0.32D175.39±1.5615.87±0.616.49±0.592.82±0.48D275.03±1.3816.44±0.937.80±0.143.21±0.55D375.77±1.6515.99±0.115.70±1.783.27±0.72D475.57±0.9616.07±0.497.02±0.733.22±0.32
从表6可见：各试验组大菱鲆幼鱼胃组织蛋白酶活力与D0组无显著性差异(P>0.05)，其中，D4试验组显著高于D2组(P<0.05)；D4组前肠脂肪酶活力显著低于D0、D1、D2组(P<0.05)，D4组与D3组无显著性差异(P>0.05)。
表6 复方中草药对大菱鲆消化酶指标的影响
Tab.6 Effect of Chinese herbal medicine compounds on digestive enzyme activities of turbot
组别 group胃蛋白酶/(U·mg-1prot)PPS前肠脂肪酶/(U·g-1prot)LPSD06.39±1.27ab102.95±5.63bD15.17±0.77ab115.44±5.57bD24.78±0.09a98.02±23.99bD35.11±1.51ab78.14±4.12abD46.79±0.36b54.71±27.61a
从表7可见：不同中草药配方饲料对大菱鲆幼鱼血浆中部分生化指标有显著性影响；其中，D1、D2、D3组血浆葡萄糖浓度显著高于D0组，且D1组还显著高于D2、D3、D4组(P<0.05)，D4组与对照组无显著性差异(P>0.05)；D1组甘油三酯浓度显著高于D0组(P<0.05)，D3、D4组显著低于D0组(P<0.05)，D2组与D0组无显著性差异(P>0.05)。
表7 复方中草药对大菱鲆血浆生化指标的影响
Tab.7 Effect of Chinese herbal medicine compounds on plasma biochemical indices of turbotmmol/L
组别group葡萄糖glucose甘油三酯triglyceride胆固醇cholesterolD00.54±0.05a1.79±0.21bc3.11±0.65abD11.68±0.34c2.71±0.18d3.61±0.51bD21.05±0.07b1.87±0.25c3.11±0.34abD31.14±0.30b1.42±0.10ab3.04±0.92abD40.80±2.06ab1.35±0.17a2.50±0.67a
从表8可见：D3组大菱鲆幼鱼血浆中碱性磷酸酶活力显著高于D0、D1、D4组(P<0.05)，其他各组间无显著性差异(P>0.05)；D3组谷胱甘肽过氧化物酶活力显著高于其他各组(P<0.05)；试验各组总超氧化物歧化酶和溶菌酶活力均无显著性差异(P>0.05)。
本试验中，4组配方中草药对大菱鲆生长均表现出不同程度的促进作用，并一定程度上降低了饲料系数，其中，由甘草、当归、茯苓、白芍、白术、柴胡组成的D1组和由炒枳实、白术(1∶2)组成的D2组，比对照组大菱鲆增重率分别增加了14.3%和24.9%，后者已构成统计学上显著性差异，因枳实和白术的配伍最早见于《金匮要略》枳术汤，用治“心下坚，大如盘，边如旋盘”。枳实辛散温通，破气消积，以泻为主，白术甘温补中，益气生血，以补为药，一消一补，相辅相成，从而补而不滞、消而不伤、健脾强胃、消食化积[13]。历代医者对两者的配伍比例多有论述，结论尚不统一，一般枳、术配伍比例约为 2∶1时消重于补；枳、术配伍比例为1∶2时补重于消[14-15]。李新旺等[16]研究也表明，单味枳实、白术及配伍均能明显改善动物肠胃运动功能，以1∶2作用最佳。因此，本试验中D2组复方中草药对大菱鲆的显著促生长作用不无道理。此外，郭萍萍等[9]将甘草、白术、茯苓等中草药粉碎后，按0.5%添加到大菱鲆饲料中投喂发现，20 d时大菱鲆增重率较对照组增加4.4%，但随投喂时间的延长，增重率出现降低的趋势。本试验中D1组复方中草药也包含甘草、白术、茯苓，试验过程中并未发现增重率有明显的先增加后降低的现象，试验结束时增重率较对照组增加了14.3%。推测除了配方略有不相同外，中草药的添加形式和添加剂量也对中草药药效的发挥产生了影响。
表8 复方中草药对大菱鲆血浆非特异性免疫指标的影响
Tab.8 Effect of Chinese herbal medicine compounds on plasma non-specific immune indices of turbot
组别group碱性磷酸酶/(U·L-1)ALP总超氧化物歧化酶/(U·mL-1)T-SOD谷胱甘肽过氧化物酶/(U·mL-1 ) GSH-Px溶菌酶/(U·mL-1)LZMD024.50±0.25a189.51±16.1348.46±15.86a2.99±0.14D124.70±0.22a196.49±2.7235.38±4.66a2.92±0.09D226.80±0.36ab201.94±6.9354.81±13.87a2.95±0.07D331.70±0.33b201.17±7.99114.23±6.53b2.94±0.22D42.48±0.50a189.24±9.0753.08±3.26a2.80±0.17
关于中草药对大菱鲆消化酶的影响已有相关报道。有研究表明，小剂量的白术、甘草、当归等不同复方中草药可以提高消化酶活性[17-18]。在李顺才[19]的研究中，由黄芪、党参、白术、茯苓、山楂、甘草等20余种中草药组成的添加剂，在添加量为1%时可显著提高大菱鲆的胃蛋白酶活性，但添加量超过1%时则活性下降。本试验中4组中草药配方理论上均有保肝健脾和促消化的功能。D1组中当归具有活血、补血、益气之功用；白芍、白术、茯苓有保肝、健脾、促消化的作用。D2组中枳实、白术也能改善肠胃功能，促进消化吸收。D3组中杏仁具有消食化积、润肺宽胃、润肠通便的作用；金银花、五味子则有利胆保肝、抗炎解热之功效。D4组中炒白术则缓和了生白术的燥性，具有增强健脾益气之功能；炒白芍与白芍相比药效有所减缓，主要以养血敛阴为主。结果表明，各组大菱鲆胃组织蛋白酶无显著性差异，D4组前肠脂肪酶活力显著低于对照组，并未得出中草药可促进大菱鲆消化酶活性的结论，具体原因还有待进一步研究。脾脏是有颌脊椎动物的主要外周淋巴样器官，也是重要的免疫器官，随着鱼类肝、脾所占体质量比例的增大，机体免疫力也在增强[20]。李顺才[19]发现，添加中草药组大菱鲆的脾脏指数显著高于未添加组，这与本试验中D1组显著提高了大菱鲆的脏体比结论相一致。D1组中白芍含有芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷等成分，对肝脏、肾脏起保护作用，因此，白芍对于D1试验组脏体比的显著增加功不可没。
血糖可以反映动物机体的营养状况，主要来自对食物消化吸收后的葡萄糖及肝糖原的分解和异生作用，受到胰岛素、肾上腺激素的控制和机体的各种调节[21-22]。养殖过程中的急性或慢性应激可显著影响鱼类血清中葡萄糖水平，而面对应激，机体组织利用血糖作为主要能量来源。本研究中发现，4组复合中草药均不同程度地提高了大菱鲆葡萄糖含量，与齐茜等[23]用紫草、桑叶、金银花等组成的复方中草药对闪光鲟Acipenser stellatus的影响一致。因此，在维持葡萄糖动态平衡基础上，葡萄糖的适量增加有助于提高鱼类机体抗应激能力。
甘油三酯和胆固醇是分析血脂的重要指标，可以作为饲料中脂类代谢的指标。本研究表明，D4组显著降低了血清中甘油三酯含量，胆固醇含量也较对照组降低了19.6%，D3组甘油三酯和胆固醇含量较对照组分别降低了20.7%和2.3%，虽与对照组未构成统计学差异，但显著低于D1组甘油三酯和胆固醇水平。原因可能是在于D3组中金银花、杏仁通过与胆固醇结合及抑制胆固醇合成等发挥降脂作用，D4组中的黄芪主要药用活性成分黄芪多糖、黄芪皂苷、黄芪黄酮等也均可降低甘油三酯和胆固醇含量，具有降脂作用[24]。
中草药对于免疫系统调节的功能已有报道，现已发现多种中草药一方面通过活化机体内抗氧化酶，增强机体抗氧化能力；另一方面通过激活补体、巨噬细胞和T、B淋巴细胞，诱生多种细胞因子等方式促进机体非特异性免疫功能。本试验中4组复方中草药均有一定的抗氧化和促免疫作用，如D1组的甘草、茯苓，D2组的枳实、白术，D3组的金银花、杏仁、五味子，D4组的陈皮、防风、黄芪等均可一定程度地清除机体自由基，改善机体抗氧化系统。由金银花、五味子、苦杏仁和山楂组成的D3组显著提高了大菱鲆血浆中谷胱甘肽过氧化物酶活力，其他组对大菱鲆血浆总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶活性和非特异性免疫酶活性有一定改善，但促进作用不显著。其原因与D3组中金银花、五味子、苦杏仁均有抗菌、抗病毒及抗氧化功能，且五味子的抗氧化、调节免疫系统的作用尤为突出有关。任丽佳等[25]研究表明，五味子多糖能显著降低大鼠血清中丙二醛含量，并显著提高血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性。Leong等[26]也发现，五味子乙素能通过激活 AML12 细胞中 ERK1/2 及 Nrf2，从而激活 MAPK 通路，最终使谷胱甘肽的表达显著增强，这均与本试验结果一致；另一方面可能与方剂的配伍和作用侧重点有关。因此，各组中草药配方仍需进行中草药添加量及配方优化的深入研究，以期为复方中草药在大菱鲆养殖中的应用提供更为可靠的参考。
在本试验条件下，实验室自制4组复方中草药配方均不同程度地促进了大菱鲆的生长，4组配方作用各有所长。D1、D2组复方中草药在提高增重率、降低饵料系数等指标中作用显著，以D2组复方中草药最佳；D4组复方中草药调节血脂作用显著，可显著降低大菱鲆血浆中甘油三酯和胆固醇含量；D3组复方中草药可通过显著提高大菱鲆血浆中谷胱甘肽过氧化酶活力，以提高大菱鲆非特异性免疫能力。
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