任永丽，齐林星，杨志军，王锦秀，聂竹兰
(塔里木大学 动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300)
摘要:为了对杂交鲟(达氏鳇Husodauricus♀×施氏鲟Acipenserschrenckii♂)外周血液中血细胞形态进行观察，采用瑞氏染色法研究其形态学特征，并依此分类。结果表明：杂交鲟血细胞由红细胞、白细胞和血栓细胞组成，其中红细胞占大多数，血栓细胞的数量仅次于红细胞，嗜酸性粒细胞较少,嗜碱性粒细胞未有发现；单核细胞体积最大，平均大小(长径×短径)为(18.9±1.7)μm×(16.8±1.7)μm，细胞核形态多样；血栓细胞的体积最小，平均大小为(8.2±1.2)μm×(6.5±1.3)μm，其着色深，一般不单独出现。本试验结果可丰富鱼类血液学研究内容，为鱼类血细胞的分类提供基础数据，并为鱼类病理及免疫等方面的研究提供基础资料。
关键词:杂交鲟；血细胞；形态学
鲟Acipenser隶属于硬骨鱼纲、辐鳍鱼亚纲、硬鳞总目、鲟形目，是世界上最古老的鱼类之一，也是目前中国重要的冷水性养殖鱼类。近年来，随着人工养殖技术的提高，鲟养殖产业得到了较大的发展[1]。中国境内水域辽阔，比较适合鲟产业的发展，现如今中国已知的鲟种群有8种，是鲟种数最多的国家之一[2]。鲟起源早，分布广泛且生命周期较长，具有重要的研究价值和经济价值。鲟全身没有肌间刺，食用部分均为软骨，营养丰富；其卵可以制成鱼子酱，被称为“软黄金”[3-4]。杂交鲟(达氏鳇Husodauricus♀×施氏鲟Acipenserschrenckii♂)是中国重要的养殖鱼类。鲟在自然条件下性成熟迟，种群遭到破坏后恢复时间较长，但杂交后的鲟繁殖能力高于亲本[5]，具有明显的杂交优势。
动物血液中含有丰富的血细胞，在其自身生理、生化调节中起重要作用[6]。血液起源于中胚层的间充质。在鱼类的血液中，血细胞的组成和高等哺乳动物相似但又有所不同，均含有红细胞、白细胞(包括有粒白细胞和无粒白细胞)，不同的是鱼类血液中不存在血小板，而是由血栓细胞替代。鱼类的血液学指标受较多因素影响，主要包括养殖密度、个体发育和栖息环境等[7]。例如，张墨等[8]在研究大杂交鲟大规格鱼种在不同放养密度条件下血液生理生化指标的变化时，发现高密度下产生的拥挤胁迫会导致大杂交鲟鱼种血液的生理指标发生明显变化。在达氏鲟血液指标的测定中，将血细胞分为红细胞系、粒细胞系、单核细胞系、淋巴细胞系和其他细胞；同时研究发现，其外周血中也有少量未成熟的红细胞[9]。鱼类的血液指标还可以反映鱼类的繁殖状况和疾病。匙吻鲟Polyodonspathula[10]与中华鲟Acipensersinensis[11]血液中红细胞的数量少于其他鱼类，同时受外界环境的影响较大，这种现象的出现应该是与二者的运动能力弱相关。
本研究中采用瑞氏染色法制作杂交鲟血细胞涂片，观察血细胞的形态特征；并依据其形态特征对杂交鲟的血细胞进行分类，旨在丰富鱼类血液学研究内容，为鱼类的病理及免疫等方面的研究提供基础资料。
试验用杂交鲟由新疆伊河鲟业科技股份有限公司提供，选择活泼健康的杂交鲟10尾，体质量为(425±25)g。
采血时，用经体积分数为0.1% 的肝素钠浸润过的2.5 mL一次性注射器，自鱼尾柄侧线鳞下方的尾静脉处抽取静脉血2 mL，整个过程不超过1 min。采用常规方法将新鲜血液即刻制成血涂片，每尾鱼2～3张；经Wright染液染色后，在油镜下进行血细胞的观察与测量；使用明美数码成像系统观察拍照，并对血细胞进行分类计数。
采用Photoshop CS 8.01软件对试验照片进行后期处理，同比例缩放图像与标尺；试验结果均以平均值±标准差(mean±S.D.)表示，用Excel软件与SPSS 17.0软件进行统计分析。
杂交鲟的血细胞是由红细胞、白细胞和血栓细胞组成。红细胞是血细胞中最常见的一种，白细胞含量较少，血栓细胞则是2个及以上聚集在一起。白细胞包括有粒白细胞和无粒白细胞。有粒白细胞可见嗜中性粒细胞与嗜酸性粒细胞。无粒白细胞可见单核细胞、淋巴细胞。杂交鲟红细胞的大小以及白细胞的分类和大小分别见表1与表2。
表1杂交鲟红细胞的大小
Tab.1Sizesoferythrocytesinthehybridsturgeonμm
细胞cell细胞长径long diameter of cell细胞短径short diameter of cell核长径long diameter of nucleus核短径short diameter of nucleus早期成红细胞 early erythroblast17.6±1.514.9±1.08.9±0.87.9±0.9红细胞 erythrocyte17.3±1.212.7±0.87.7±0.56.4±0.6
表2杂交鲟白细胞的分类和大小
Tab.2Classificationandsizesofleukocytesinthehybridsturgeonμm
细胞 cell细胞长径 long diameter of cell细胞短径 short diameter of cell白细胞leukocyte有粒白细胞嗜中性粒细胞neutrophil嗜酸性粒细胞eosinophil18.0±2.517.1±1.715.8±1.916.1±1.6无粒白细胞单核细胞monocyte大淋巴细胞large lymphocyte小淋巴细胞small lymphocyte18.9±1.717.0±3.09.8±0.116.8±1.715.8±2.69.3±0.1
杂交鲟红细胞为椭圆形，细胞核为圆形或椭圆形，位于细胞中央被染成深蓝色，细胞质则被染成浅蓝色(图1-A实线箭头)。红细胞在杂交鲟血细胞中占绝大多数，白细胞和血栓细胞只有很少的一部分。红细胞的长径为(17.3±1.2)μm，短径为(12.7±0.8)μm，细胞大小为(17.3±1.2)μm×(12.7±0.8)μm；核长径为(7.7±0.5)μm，核短径为(6.4±0.6)μm，细胞核大小为(7.7±0.5)μm×(6.4±0.6)μm。红细胞中散落分布有近圆形的早期成红细胞(17.6±1.5)μm×(14.9±1.0)μm，其细胞核为(8.9±0.8)μm×(7.9±0.9)μm，明显大于红细胞核，核染色质清晰可见，胞质嗜碱性(图1-A虚线箭头)。
杂交鲟白细胞包括有粒白细胞和无粒白细胞两大类。有粒白细胞主要有两种：嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。无粒白细胞主要有单核细胞和淋巴细胞。
2.2.1 杂交鲟嗜中性粒细胞形态 杂交鲟嗜中性粒细胞是颗粒白细胞中最多的一种，比红细胞略微大一些。细胞长径为(18.0±2.5)μm，短径为(15.8±1.9)μm。细胞一般呈椭圆形、圆形或不规则形，在细胞的表面有突起。经染色后可见细胞核呈带状、肾形或2叶(图1-B)、3叶(图1-C)、4叶(图1-D)、5叶(图1-E)、6叶(图1-F)状，各分叶之间有丝状或带状相连。部分细胞核的位置发生偏移，偏在细胞的一侧。
2.2.2 杂交鲟嗜酸性粒细胞形态 杂交鲟嗜酸性粒细胞数量比较少，细胞呈圆形，比红细胞体积大。染色可见红色嗜酸性颗粒，分布均匀。细胞核分2叶(图1-G)、3叶(图1-H)、4叶(图1-I)不等，且偏向细胞一侧，呈蓝色。细胞的长径为(17.1±1.7)μm，短径为(16.1±1.6)μm。细胞一般呈圆形，所以它的长径和短径相差不大。
2.2.3 杂交鲟淋巴细胞形态 杂交鲟淋巴细胞是白细胞中最多的细胞。其细胞核比较大，占据整个细胞的大部分，细胞质较少，一般细胞核质比为3∶1。经过染色后可以观察到细胞核被染成深蓝紫色，细胞质被染成蓝色，像一层薄膜包裹在核周围。根据杂交鲟的淋巴细胞直径大小，将其分为大淋巴细胞(长短径10～20 μm)和小淋巴细胞(长短径均小于10 μm)2种。大淋巴细胞表面粗糙(图1-J)，伸出伪足样突起，其长径为(17.0±3.0)μm，短径为(15.8±2.6)μm；小淋巴细胞表面光滑(图1-K)，其长径为(9.8±0.1)μm，短径为(9.3±0.1)μm。
2.2.4 杂交鲟单核细胞形态 杂交鲟单核细胞呈圆形或椭圆形，细胞核为不规则形(图1-L实线箭头)、肾形(图1-L虚线箭头)、S形(图1-M)或U形(图1-N)，染色质较疏松，呈蓝紫色；胞质弱碱性，呈蓝色；其长径为(18.9±1.7)μm，短径为(16.8±1.7)μm。
注： A为红细胞(Er)和早期成红细胞(Eae)(×40)；B、C、D、E、F为嗜中性粒细胞(分叶，Sne)(×100)；G、H、I为嗜酸性粒细胞(分叶，Seo)(×100)；J为大淋巴细胞(Ll)(×100)；K为小淋巴细胞(Sl)(×100)；L、M、N为单核细胞(Sm)(×100)；O、P、Q为血栓细胞(Th)(×100)
Note: A，Erythrocyte(Er) and early erythroblast (Eae)(×40); B,C,D,E,and F，Neutrophil segmented granulocyte (Sne)(×100); G,H,and I，Eosinophil segmented granulocyte(Seo)(×100); J，Large lymphocyte (Ll)(×100); K，Small lymphocyte(Sl)(×100); L,M,and N，Monocyte segmented granulocyte (Sm)(×100); O,P,and Q，Thrombocyte(Th)(×100)
图1 杂交鲟外周血细胞的显微图
Fig.1 Microstructure of the peripheral hematocytes in hybrid sturgeon
杂交鲟血栓细胞呈纺锤形或近圆形，在血涂片上往往有2个(图1-O)、4个或5个(图1-P)甚至大量(图1-Q)血栓细胞聚集在一起。细胞质浓密，着色深，而且细胞质较少，一般出现在细胞核两端，有时较难看到；细胞核几乎占据整个血栓细胞，细胞质在其周围只有薄薄一层。血栓细胞的个体较小，为(8.2±1.2)μm×(6.5±1.3)μm，略大于红细胞的细胞核。
红细胞在血细胞中广泛存在，它能携带大量的氧气输送到全身各组织。在高等哺乳动物进化过程中细胞核消失的现象，其目的是增加携氧面积，进而携带更多的氧气。不同的生理条件或病理状态下红细胞的形态、大小和数量可发生变化。据研究，在产卵、长期饥饿或寒冷的情况下，鲤的红细胞数量减少；在缺氧条件下，红细胞的数量激增；而由于寄生虫所引起的机体疾病则会使红细胞和血红蛋白降低[12]。鱼类红细胞的大小因种类和生活环境不同而存在一定的差异[13]。由于环境的变化，鱼类的红细胞并未彻底的分化，而是失去了分化能力，甚至停止分裂[14]。本研究中并未发现处于分裂状态的红细胞，这与对达氏鳇[9]及中华鲟[11]的研究结果一致。而对驼背鲈Cromileptesaltivelis[15]、条石鲷Oplegnathusfasciatus[16]、史氏鲟[17]、叶尔羌高原鳅Triplophysa(Hedinichthys)yarkandensis(Day)[18]等的研究发现，其外周血的红细胞核可见分裂现象，这与对杂交鲟红细胞的研究结果不同。杂交鲟外周血中可见早期成红细胞，与达氏鳇[9]相似，但不同于中华鲟[11]与史氏鲟[17]。早期成红细胞在高等哺乳动物的正常外周血中一般不存在，但存在于鱼类中，说明鱼类在动物进化中处于较低等水平；此外，早期成红细胞的存在也表明，鱼类的红细胞可以在自己的外周血环境中逐步发育成熟。
杂交鲟的血涂片中未发现嗜碱性粒细胞。嗜碱性粒细胞在血液中存在的数量最少，中华鲟[11]与史氏鲟[17]的外周血中也未发现嗜碱性粒细胞，这可能与它在制作中易解体的性质有关，所以不容易被发现[19]。本研究中，杂交鲟的嗜中性粒细胞胞质嗜弱碱性，颗粒不明显，核的形态多样，分叶由2叶到6叶不等，核位于细胞的中央。目前，尚未见鱼类外周血中有具体统计嗜中性粒细胞核分叶数方面的报道。而杂交鲟嗜酸性粒细胞表面有粗大的红色颗粒，核偏于细胞的一侧，分叶有2叶至4叶不等，这明显不同于金鱼嗜酸性粒细胞为杆状、肾形、半圆形或偶见二分叶形核[20]。达氏鳇[9]外周血中也未见分叶形嗜酸性粒细胞的存在，中华鲟[11]中虽指出嗜酸性粒细胞有分叶的现象，但并未指出具体的分叶数。本研究中，杂交鲟外周血中的单核细胞最大，核多见于S形、U形、近圆形和不规则形，细胞质明显多于淋巴细胞。而大淋巴细胞有伪足，小淋巴细胞未见有伪足的现象。对于淋巴细胞的分类，不同的学者见解不同：Ellis[21]指出，淋巴细胞虽然有大小两种状态，但实际上是处于不同功能状态的同一种细胞；Barber等[22]也认为，不能以细胞的直径大小用于淋巴细胞的分类；林光华[23]则将细胞大小与形态特征相结合，将成年草鱼的淋巴细胞分为大小两种。本研究中也根据细胞大小与形态特征将淋巴细胞分为大小两种，这与达氏鳇[9]相似。
鱼类的血栓细胞类似于高等脊椎动物的血小板，是所有血细胞中体积最小的一种细胞。不同鱼类血栓细胞的形态不同，达氏鳇[9]的血栓细胞呈圆形或椭圆形。本研究中，杂交鲟血栓细胞呈纺锤形或近圆形，其大小明显小于小淋巴细胞，但大于红细胞的细胞核。
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REN Yong-li, QI Lin-xing, YANG Zhi-jun, WANG Jin-xiu, NIE Zhu-lan
(College of Animal Science, Tarim University, Alar 843300,China)
Abstract：The morphological characteristics of hemocytes in peripheral blood were investigated in hybrid sturgeon (Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂) by Wright staining method. The results showed that the peripheral hematocytes of the hybrid sturgeon were composed of erythrocytes as the most abundant hematocytes, leukocytes, and thrombocytes as the secondary abundant hematocytes, with the least islandphils and without basophils. The monocytes had mean size of (18.9±1.7)μm in length×(16.8±1.7)μm in width, and the thrombocytes as the smallest blood cell with a mean size of (8.2±1.2)μm×(6.5±1.3)μm did not appear alone. The findings enriching contents of fish hematology provide the basic data for the classification of fish blood cells and offer the basic information on study of fish pathology and immunity.
Keywords：Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂; blood cell; morphology
通信作者：聂竹兰(1979—)， 女， 博士， 教授。E-mail:niezhl2004@163.com
作者简介：任永丽(1993—)， 女， 硕士研究生。E-mail:renyongli2017@163.com
基金项目：新疆维吾尔自治区科技支疆项目(201491161)；塔里木大学高等教育教学研究项目(TDGJ1506)
收稿日期：2017-11-23
文章编号：2095-1388(2018)05-0595-05
DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2018.05.008
文献标志码：A
中图分类号：Q952