谷氨酰胺(glutamine, Gln)是动物体内含量最丰富的游离态氨基酸，在机体内参与多种代谢物质的合成，也是体内蛋白质和氨基酸的重要来源[1-3]。通常动物机体内 Gln 可以内源合成或通过外源添加获得，但当机体处于病理或应激状态时，内源性Gln的合成量较少，通常远不能满足动物机体的正常需求，此时动物机体内 的Gln含量 相对缺乏[4]。研究显示，在饲料中添加外源性Gln 能够改善鱼体肠道结构和功能，促进肠道发育[5-6]。然而，外源性 Gln 极不稳定，受热后容易分解生成有毒物质[7]。鉴于此，不同学者对其相关替代物进行了深入研究[8-9]。李晋南等[10-11]的研究表明，饲料中添加α-酮戊二酸(AKG)、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)、谷氨酸(Glu)可显著影响鱼体肠道的消化酶活性及肠道发育。从代谢角度分析，Gln 的前体物，如AKG、Glu、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)、OKG、α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)等均可在动物机体中与Gln发挥相同或相似的功能。
松浦镜鲤Cyprinus carpio Songpu作为黑龙江水产研究所成功选育的经济新品种，因其较好的体型优势和经济性状，在全国范围内已被广泛推广[12]。本试验中，以 Gln 的代表性前体物AKG、AAKG、Glu、OKG和 2Na-AKG作为添加剂，研究了Gln前体物对镜鲤肌肉成分、氨基酸组成和碱性磷酸酶(AKP)活性的影响，旨在为松浦镜鲤饲料的科学配制提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验鱼为中国水产科学研究院黑龙江水产研究所培育。选择3000尾规格整齐、体质健壮的松浦镜鲤，在循环水养殖系统中暂养并驯化1周。暂养期间，每日7:30、12:30、16:30饱食饲喂基础饲料，每天换水20%，水温维持在(25.0±2.0)℃，溶解氧大于5.0 mg/L。
α-酮戊二酸(AKG)购自Sigma公司，谷氨酰胺(Gln)、L-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)(AKG与L-鸟氨酸质量比为1∶1)、谷氨酸(Glu)、L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)(AKG与L-精氨酸质量比为1∶2)和α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)均购自鼓臣生物技术有限公司(上海)，各物质纯度均≥98.0%。
1.2 方法
1.2.1 试验饲料的制备 以鱼粉和豆粕作为蛋白源，鱼油、豆油和磷脂作为脂肪源，根据NRC(2011)[13]及SC/T1026-2002《鲤鱼配合饲料》[14]要求配制基础饲料。分别用Gln、Glu、AKG、OKG、AAKG、2Na-AKG替代基础饲料中1.5%的葡萄糖，制成6种等能等氮饲料。基础饲料的组成及营养水平见表1。将饲料原料粉碎、称重、逐级混合均匀后，制成颗粒饲料(粒径为2 mm)，在常温条件下风干，于冰箱(4 ℃)中保存备用。
1.2.2 试验设计及管理 驯化结束后，挑选松浦镜鲤1050尾(体质量为40.27 g±3.96 g)随机分为7组，每组设5个重复，每个重复放养试验鱼30尾。各处理组均随机饲喂一种试验饲料，空白对照组投喂基础饲料。试验鱼在室内循环水系统内养殖(鱼缸高0.6 m、直径1.2 m)，每天7:30、12:30、16:30饱食投喂3次。养殖期间，系统内每天换水20%，水温保持在(25.0±2.0)℃，溶解氧不低于5.0 mg/L，养殖周期为8周。
1.2.3 样品的采集 养殖试验结束后，各组试验鱼均停食24 h，之后进行样品采集。从每个缸中随机取试验鱼2尾，用丁香油麻醉后从尾静脉处采血，将血液离心(3500 r/min，15 min)后分离血清，血清样品于冰箱(-20 ℃)中保存待测。在冰盘上解剖采血后的试验鱼，分别取其前肠、中肠、后肠和肝脏，肠道样品用预冷的0.86%的生理盐水清洗，并通过滤纸吸干。将组织样品与预冷的生理盐水按1 mg∶9 mL的比例进行稀释并匀浆，根据不同检测指标所需条件进行离心，将离心后的上清液置于冰箱(-20 ℃)中保存待测。取鱼体两侧的肌肉，去皮后放入烘箱中，在(65±2)℃条件下烘36～48 h，通过干燥器冷却后，用小型粉碎机粉碎后置于干燥器中保存待测。
表1 基础饲料的组成及营养水平
Tab.1 Ingredient and nutrient levels of the basal diet
组成 ingredient 含量 content/%豆粕 soybean meal38.10鱼粉 fish meal5.00豆油 soybean oil3.30鱼油 fish oil1.00磷脂 phospholipid1.00次粉 wheat middling43.40原料玉米淀粉 corn starch2.00 ingredient矿物质预混料 mineral premix1)0.20维生素预混料 vitamin premix2)0.30L-苏氨酸 L-Thr3)0.43DL-蛋氨酸 DL-Met4)0.56L-赖氨酸 L-Lys5)0.54磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)22.47氯化胆碱 choline chloride0.20葡萄糖 glucose1.50合计 total100.00粗脂肪 crude lipid6.75粗蛋白质 crude protein29.22营养水平6)总磷 TP1.21nutrient level苏氨酸 Thr1.50蛋氨酸 Met1.00赖氨酸 Lys2.20
注：1)每千克饲料中矿物质预混料的含量：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，Fe 25 mg，Mn 15 mg；2)每千克饲料中维生素预混料的含量：VE 60 mg，VA 8000 IU，VB6 15 mg，VC 500 mg，VB12 0.5 mg，VB2 30 mg，VD3 3000 IU， VK3 5 mg，氯化胆碱5000 mg，泛酸50 mg，烟酸175 mg，叶酸5 mg，肌醇1000 mg，D-生物素2.5 mg；3)L-苏氨酸的有效含量≥99%；4)DL-蛋氨酸的有效含量≥99%； 5)L-赖氨酸的有效含量98.5%； 6)粗脂肪和粗蛋白质均为干物质的实测值，其余为计算值
Note：1)Per kg of the diet contains the following minerals：Se 0.4 mg，Zn 25 mg，Co 0.1 mg，Cu 3 mg，I 0.6 mg，Fe 25 mg，and Mn 15 mg； 2)The vitamin premix contains the following at per kg of the diet：VE 60 mg，VA 8000 IU，VB6 15 mg，VC 500 mg，VB12 0.5 mg，VB2 30 mg，VD3 3000 IU， VK3 5 mg，choline chloride 5000 mg，pantothenic acid 50 mg，nicotinic acid 175 mg，folic acid 5 mg，inositol 1000 mg，and D-biotin 2.5 mg；3)The actual level of L-Thr is ≥99%； 4)The actual level of DL-Met is ≥99%； 5)The actual level of L-Lys is 98.5%； 6)EE and CP values are measured in dry matter, while the others values are calculated
1.2.4 指标的测定
(1)肌肉一般营养成分。鱼体肌肉水分采用烘干法测定，即在一个大气压、(105±2)℃条件下烘干，直至恒重，逸失的重量即为水分含量(GB/T5009.3—2003)；采用索氏抽提法(GB/T5009.6—2003)、全自动凯氏定氮仪(N×6.25)(GB/T5009.5—2003)、灼烧法(GB/T5009.4—2003)分别测定粗脂肪、粗蛋白质和粗灰分含量。
(2)氨基酸。准确称取40～50 mg肌肉干样品(精确至0.1 mg)置于50 mL安瓿瓶中。加入6 mol/L的盐酸溶液10 mL，封管后放入(110±1)℃恒温干燥箱中水解24 h。待冷却后打开安瓿瓶，用2 mL双蒸水冲洗数次后一并转入150 mL旋转蒸发瓶内，并置于旋转蒸发器中于60 ℃条件下抽真空，蒸发至干。然后用盐酸溶液(0.02 mol/L)洗涤蒸发瓶3～5次，洗涤液转移至100 mL容量瓶中，最后用盐酸溶液(0.02 mol/L)定溶，摇匀后即为试样水解液。吸取混合氨基酸标准工作液及试样水解液2～3 mL，经孔径0.45 μm以下两性滤膜直接滤入自动进样瓶中并加盖，通过全自动氨基酸分析仪(日立L-8900)测定。
(3)碱性磷酸酶活性。根据试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书测定肠道、肝脏和血清的AKP活性。
1.3 数据处理
试验数据均用平均值±标准误(mean±S.E.)表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，若差异显著，则用Duncan法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 松浦镜鲤肌肉一般营养成分
从表2可见：OKG组鱼体肌肉粗蛋白质含量显著高于对照组及其他处理组(P<0.05)，其他组间均无显著性差异(P>0.05)；2Na-AKG组鱼体粗灰分含量显著高于对照组及其他处理组(P<0.05)；不同处理组鱼体粗脂肪含量与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)；OKG组和AAKG组鱼体肌肉水分含量均显著低于对照组、Glu组和2Na-AKG组(P<0.05)。
表2 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肌肉成分的影响
Tab.2 Effects of Gln and its precursors on muscle composition of Songpu mirror carp w/%
组别 group粗蛋白质 crude protein粗灰分 crude ash粗脂肪 crude lipid水分 moisture对照 control18.36±0.30bc1.30±0.05bc2.25±0.25ab78.23±0.53ab谷氨酰胺(Gln)19.09±0.32b1.42±0.07b2.04±0.13b77.81±0.52bc谷氨酸(Glu)17.93±0.18c1.29±0.04bc1.99±0.11b78.56±0.73aα-酮戊二酸(AKG)18.26±0.34bc1.30±0.03bc2.60±0.09a77.93±0.50abcL-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)20.43±0.50a1.43±0.14b2.42±0.21ab77.54±0.41cL-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)18.50±0.32bc1.08±0.01c1.93±0.16b77.50±0.55cα-酮戊二酸钠(2Na-AKG)17.95±0.23c1.74±0.15a1.97±0.15b78.32±0.47ab
注：同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)，下同
Note:The means with different letters within the same column are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same column are not significant differences， et sequentia
2.2 松浦镜鲤肌肉氨基酸组成
从表3可见：必需氨基酸中，AKG组、2Na-AKG组鱼体肌肉异亮氨酸含量和亮氨酸含量均显著低于对照组(P<0.05)；Glu组、2Na-AKG组赖氨酸含量均显著低于Gln组、OKG组、AAKG组和对照组(P<0.05)，且Glu组蛋氨酸含量显著低于对照组P<0.05)；OKG组和AAKG组苏氨酸含量显著高于对照组和AKG组(P<0.05)；Glu组缬氨酸含量显著低于其他各组(除2Na-AKG组外)(P<0.05)；不同处理组中苯丙氨酸、精氨酸和组氨酸含量与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。
非必需氨基酸中，Glu组和2Na-AKG组鱼体天冬氨酸含量均显著低于对照组、OKG组和AAKG组(P<0.05)，且Glu组脯氨酸显著低于对照组(P<0.05)；不同处理组中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸和酪氨酸含量与对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。
Glu组、AKG组和2Na-AKG组必需氨基酸(EAA)总量均显著低于对照组、OKG组和AAKG组(P<0.05)；而与对照组相比，不同处理组中非必需氨基酸(NEAA)、呈味氨基酸(DAA)和总氨基酸(TAA)含量均无显著性差异(P>0.05)。
表3 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肌肉氨基酸组成的影响
Tab.3 Effects of Gln and its precursors on muscle amino acid composition of Songpu mirror carp %
氨基酸 amino acid 对照 control谷氨酸组 Glu谷氨酰胺组 Gln鸟氨酸-α-酮戊二酸组 OKG α-酮戊 二酸组 AKG精氨酸-α-酮戊二酸组 AAKGα-酮戊二酸钠组2Na-AKG异亮氨酸 Ile1.50±0.01a1.44±0.02abc1.42±0.02bc1.49±0.00ab1.41±0.01c1.45±0.04abc1.41±0.02c亮氨酸 Leu1.47±0.01a1.40±0.03c1.45±0.02abc1.47±0.01a1.41±0.02bc1.46±0.02ab1.39±0.02c赖氨酸 Lys1.63±0.01ab1.56±0.01c1.62±0.04ab1.67±0.02a1.58±0.02bc1.67±0.01a1.50±0.01c蛋氨酸 Met0.51±0.01a0.47±0.01b0.51±0.02a0.50±0.00a0.50±0.01a0.51±0.00a0.49±0.01ab苯丙氨酸 Phe0.80±0.01ab0.83±0.03b0.86±0.00ab0.87±0.00a0.86±0.01ab0.87±0.01a0.85±0.00ab苏氨酸 Thr0.69±0.01b0.71±0.00ab0.72±0.03ab0.76±0.01a0.70±0.02b0.75±0.01a0.71±0.01ab缬氨酸 Val0.81±0.01a0.75±0.01b0.81±0.02a0.80±0.00a0.79±0.01a0.80±0.00a0.78±0.01ab精氨酸 Arg 1.09±0.00ab1.04±0.02b1.06±0.03b1.14±0.02a1.05±0.01b1.14±0.02a1.06±0.02b组氨酸 His0.57±0.01ab0.55±0.00b0.56±0.01ab0.59±0.02a0.55±0.01ab0.58±0.01ab0.55±0.01b必需氨基酸 EAA9.15±0.07ab8.75±0.07c9.01±0.10bc9.31±0.06a8.86±0.12c9.26±0.11ab8.79±0.05c丙氨酸 Ala1.01±0.061.02±0.021.04±0.011.09±0.010.98±0.061.07±0.021.03±0.02谷氨酸 Glu2.34±0.122.35±0.042.38±0.042.49±0.012.35±0.032.47±0.042.34±0.03甘氨酸 Gly0.75±0.040.75±0.000.76±0.010.79±0.000.74±0.040.78±0.020.75±0.02天冬氨酸 Asp1.85±0.04a1.72±0.04b1.77±0.02ab1.85±0.01a1.76±0.02ab1.84±0.03a1.74±0.02b呈味氨基酸 DAA5.94±0.07ab5.85±0.10b5.96±0.10ab6.22±0.03a5.82±0.11b6.16±0.10a5.85±0.09b丝氨酸 Ser0.64±0.01abc0.62±0.01c0.62±0.00bc0.65±0.01ab0.63±0.01abc0.66±0.01a0.62±0.01bc半胱氨酸 Cys0.25±0.01ab0.21±0.00b0.27±0.03a0.22±0.01ab0.25±0.02ab0.23±0.01ab0.23±0.02ab酪氨酸 Tyr0.63±0.01ab0.61±0.01b0.60±0.02b0.66±0.01a0.62±0.01b0.67±0.01a0.62±0.02b脯氨酸 Pro0.55±0.03a0.45±0.01b0.54±0.03a0.50±0.00ab0.51±0.02ab0.51±0.01ab0.50±0.02ab非必需氨基酸NEAA8.01±0.06ab7.72±0.10b7.99±0.07ab8.25±0.04a7.83±0.15b8.22±0.11a7.83±0.08b总氨基酸TAA17.16±0.08abc16.48±0.17cd17.00±0.17bcd17.56±0.09a16.69±0.25cd17.48±0.22ab16.61±0.13cd
注：同行中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)
Note: The means with different letters within the same line are significant differences at the 0.05 probability level, and the means with the same letters within the same line are not significant differences
2.3 松浦镜鲤AKP活性
从表4可见：AAKG组和2Na-AKG组鱼体前肠AKP活性均显著高于对照组及其他处理组(P<0.05)，而各试验组中肠和后肠AKP活性较对照组均无显著性差异(P>0.05)；Glu组鱼体肝脏AKP活性均显著高于对照组、Gln组、AKG组和OKG组(P<0.05)；鱼体血清AKP活性在不同组间均无显著性差异(P>0.05)。
表4 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肠道、肝胰脏和血清中AKP活性的影响
Tab.4 Effects of Gln and its precursors on AKP activities in intestine, hepatopancreas and serum of Songpu mirror carp
组别 group 前肠/(U·g-1 prot)foregut中肠/(U·g-1 prot)midgut后肠/(U·g-1 prot) hindgut肝胰脏/(U·g-1 prot)hepatopancreas血清/(U·L-1)serum对照 control1019.50±102.17bc248.23±20.38abcd61.56±5.86abcd5.99±0.56b6.70±0.26谷氨酰胺(Gln)642.55±34.74c354.17±29.33a164.98±13.43a6.98±0.71b5.85±0.47谷氨酸(Glu)1079.06±110.05b343.90±33.07ab221.15±21.56ab13.36±0.98a7.51±0.62α-酮戊二酸(AKG)1030.07±109.43bc299.74±23.89abc194.48±15.39abc5.15±0.39b7.57±0.56L-鸟氨酸-α-酮戊二酸(OKG)872.66±53.52bc102.63±11.05d213.64±20.80d6.42±0.53b8.46±0.59L-精氨酸-α-酮戊二酸(AAKG)1677.42±137.92a203.97±19.25bcd74.76±6.96bcd10.34±0.82ab6.13±0.29α-酮戊二酸钠(2Na-AKG)1667.27±129.34a158.77±14.78cd106.83±10.58cd7.81±0.77ab6.60±0.16
3 讨论
3.1 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肌肉一般营养成分的影响
研究表明，不同Gln水平均对罗非鱼鱼体水分和粗蛋白质含量具有显著影响，但对粗脂肪和灰分影响不显著[15]。对鲟鱼的研究结果亦表明，饲料中添加1.2%和1.5%的Gln均可显著提高鲟鱼全鱼粗蛋白质含量，但对粗脂肪、灰分和水分含量均无显著影响[16]。本试验中，饲料中添加1.5%的Gln对松浦镜鲤肌肉粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量均无显著影响，这些结果表明，Gln对鱼体体成分的影响在不同鱼种间具有差异性。一些学者的研究结果表明，日粮中添加AKG对松浦镜鲤全鱼及杂交鲟幼鱼体成分各指标均无显著影响[16-17]，这与本研究结果一致，表明AKG可能对鱼体主要营养成分沉积的影响并不明显。李晋南等[10]对松浦镜鲤的研究显示，AKG、OKG、Glu对其体成分各指标均无显著影响。而本研究结果表明，饲料中添加OKG可显著增加镜鲤肌肉粗蛋白质含量，且添加2Na-AKG能显著增加鱼体肌肉中粗灰分含量，这可能与2Na-AKG中含有较高的钠含量有关。同时，本研究中添加OKG和AAKG可显著降低鱼体肌肉中水分含量，添加AKG和OKG则可有效增加鱼体肌肉中脂肪含量，这可能与AKG或OKG在机体内直接参与供能有关，其影响机制有待于进一步研究。
3.2 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肌肉氨基酸组成的影响
蛋白质营养从本质上来说就是氨基酸营养。本研究中共检测出17种氨基酸，其中包括9种必需氨基酸、6种非必需氨基酸和2种半必需氨基酸，非必需氨基酸中有4种(Glu、Asp、Ala和Gly)氨基酸共同组成呈味氨基酸(DAA)。研究表明，日粮中添加Gln可显著提高肉仔鸡胸脯肌肉中的必需氨基酸、呈味氨基酸、谷氨酸和苯丙氨酸的含量[18-19]。李永塘等[20]研究表明，日粮中添加AKG可有效缓解免疫应激对仔猪氨基酸代谢的影响。陈迪[21]研究表明，饲料中添加AKG可显著提高鲟鱼Arg、Asp和Glu含量。魏玉强等[22]研究表明，饲料中添加AKG可显著提高松浦镜鲤肌肉中总氨基酸和呈味氨基酸含量。本研究结果显示，饲料中添加OKG和AAKG对氨基酸总量、EAA、NEAA和DAA含量的提高均优于其他替代物，且相对于对照组也有相应提高，究其原因可能是由于鸟氨酸和精氨酸与AKG的协同作用导致鱼体代谢差异所致。
3.3 谷氨酰胺及其前体物对松浦镜鲤肠道、肝脏和血清中AKP活性的影响
AKP酶广泛存在于动物机体的肝脏、肠道、骨骼等组织中，是经肝脏向胆外排出的一组同工酶，能催化核酸脱掉5′端磷酸基团，且与生长相关。Lin等[5]研究表明，饲料中添加1.2%的Gln能够显著影响建鲤肠道的AKP活性。本研究中，饲料中添加1.5%的Gln对松浦镜鲤鱼体肠道、肝脏和血清中AKP活性均无显著影响，表明Gln对鱼体AKP的作用可能存在不同鱼种的种间差异。本研究中，添加AAKG和2Na-AKG可显著提高松浦镜鲤鱼体前肠AKP活性，而添加Glu可显著提高鱼体肝脏AKP活性，表明Gln的某些前体物可在一定程度上影响松浦镜鲤机体与AKP活性相关的代谢活动，其作用机理有待于进一步研究。
4 结论
本研究中，饲料中添加1.5%的OKG能显著提高松浦镜鲤鱼体肌肉粗蛋白质及苏氨酸含量，同时能够显著降低鱼体肌肉水分含量；饲料中添加1.5%的AAKG和2Na-AKG能够显著提高松浦镜鲤鱼体前肠的AKP活性。
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