菲律宾蛤仔Ruditapes philippinarum(以下简称蛤仔)，在辽宁俗称蚬子，在山东俗称蛤喇，在南方俗称花蛤等，是广泛生活于中国南北沿海的埋栖贝类，具有重要的经济价值[1]。在中国北方，蛤仔养殖过程中要经历冬季的低温，甚至冰冻，盐度为30～35的海水，冰点为 －1.9～－2℃。北方冬季近岸海水或者海水池塘的最低水温通常低于－1℃，甚至更低[2－3]。而北方蛤仔养殖的苗种主要来自于南方 (主要是福建)，经高温培育所得。这样的苗种在北方潮间带的低温环境下无法安全越冬，致使大量的浅海滩涂被闲置。
蛤仔斑马蛤 (以下简称斑马蛤)是辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心通过选择育种方法培育得到的抗逆性很强的蛤仔新品种。目前，关于斑马蛤的研究主要集中在遗传性状[4－6]、养殖方式[7]和生态学[8－13]等方面。胥贤等[10]在研究低温对蛤仔呼吸代谢影响时发现，温度由7.6℃逐渐降低至－2.1℃，并且在冰水混合状态下胁迫 7 d时，斑马蛤存活率为93.3%，较普通蛤仔 (存活率为74.6%)有更强的耐低温能力。生产试验表明，斑马蛤可以在北方水温条件下安全越冬。了解斑马蛤的耐低温机制，对于该新品种的推广和北方浅海滩涂的充分利用具有重要意义。
酶活性是常见的研究环境胁迫的生理生化机制的观测指标。已有研究表明，饵料[14]、规格[15]、壳色[16]、家系[17]、温度和 pH[18－20]等均对贝类的酶活性有影响。而温度是影响酶活性的重要因素之一，关于温度对贝类酶活性的影响研究绝大多数集中在粗酶液提取后反应温度对酶活性的影响方面[18－23]，而关于外环境温度胁迫对贝类酶活性影响的报道较少[24－28]，尤其是关于低温对斑马蛤酶活性影响的研究尚未见报道。为此，本试验中模拟冬季低温水平，进行了渐变低温对斑马蛤幼贝消化酶和抗氧化酶活性的影响研究，以期为探明斑马蛤的耐低温机制，以及完善和推广斑马蛤的养殖技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用斑马蛤幼贝由辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心人工繁育提供，其中大规格壳长为(17.08±0.7)mm、壳宽为 (11.2±0.84)mm，中规格壳长为 (13.12±0.72)mm、壳宽为 (8.8±0.41)mm，小规格壳长为 (7.67±0.71)mm、壳宽为 (5.72±0.54)mm。试验前，幼贝在水温为(14.4±0.2)℃的海水中暂养，暂养期间连续充气，每天全量更换海水1次，投喂螺旋藻粉2～3次。
暂养和试验用水为大连市黑石礁近岸海域经过沉淀、过滤的新鲜海水，水质状况符合 《GB 11607—1989渔业水质标准》的要求。
1.2 方法
1.2.1 渐变低温的控制 试验温度设置为8(对照组)、5、2、0℃，实测为 (8.2±0.1)、 (5.4±0.1)、 (2.2±0.1)、 (0.2±0.1)℃。从暂养水温(14℃)开始，以每3 d降低1℃的幅度逐渐降温至设定的试验温度。具体方法为，首先在第一天降温1℃，然后在此温度下维持3 d后再进行降温。在水温降至8℃时，第一次取样测定酶活性。由暂养水温14℃降至6℃期间的降温过程在控温循环水族箱中进行，由6℃降至0℃期间的降温在冰柜中进行。试验期间每天换水一次并投饵，取样前24 h只换水不投饵，使幼贝排空肠胃，避免肠道中食物对试验结果的影响。
1.2.2 粗酶液的制备 随机挑选一定数量的斑马蛤，其中小规格斑马蛤每组取8～10枚，中规格斑马蛤每组取5～8枚，大规格斑马蛤每组取3～5枚，每组设3个平行。在冰盘上用解剖刀将斑马蛤的闭壳肌切断，从中取出斑马蛤的内脏组织，称取质量，按质量与体积比为1 mg∶4 mL的比例加入预冷生理盐水，用电动匀浆机 (10 000 r/min)在冰浴条件下匀浆3 min，匀浆液经离心机 (3500 r/min)离心10 min后，取上清液备用。
1.2.3 酶活性测定 对粗酶液上清液分别进行消化酶 (淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)酶活性的测定。使用南京建成科技有限公司试剂盒测定酶活性。其中，淀粉酶 (AMS)是组织中每毫克蛋白在37℃条件下与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活力单位 (U)；脂肪酶 (LPS)是在37℃条件下，每克组织蛋白在本反应体系中与底物反应1 min，每消耗1 μmol底物为1个酶活力单位 (U)；胃蛋白酶是在37℃条件下反应，每分钟能催化水解血红蛋白生成1 μmol酪氨酸的酶量为1个活力单位 (U)；过氧化氢酶 (CAT)是在37℃反应条件下，每毫克组织蛋白每秒钟水解1 μmol的H2O2的量为1个活力单位 (U)；超氧化物歧化酶 (SOD)是在37℃反应条件下，每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD的量为1个活力单位 (U)。
1.3 数据处理
试验数据均用平均值±标准差 (mean±S.D.)表示，用SPSS 20.0软件进行双因素方差分析，用Tukey方法进行多重比较。显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 低温下斑马蛤的死亡率
低温对斑马蛤酶活性影响试验的死亡率结果见表1。温度从5.4℃降至2.2℃时，死亡率较8.2℃降至5.4℃时略有增加，其后维持在较低水平；至试验结束时，3种规格斑马蛤的死亡率＜3%。
表1 低温对斑马蛤酶活性影响试验的死亡率
Tab.1 Mortality of zebra clam in the effects of low temperature on enzyme activity experiment %
注:某温度下的死亡率＝某温度下的死亡数/上一个温度下的存活数Note:mortality at given temperature＝the number of deaths at certain temperature/the number of survivors at previous temperature
实测温度/℃measured temperature斑马蛤壳长zebra clam shell length/mm 7.67±0.71 13.12±0.72 17.08±0.7 8.2(对照) 0.0 0.0 0.0 5.4 0.24 0.74 0.21 2.2 1.49 1.88 2.15 0.2 0.12 0.0 0.0总计total 1.85 2.62 2.36
2.2 低温下斑马蛤消化酶的变化
2.2.1 低温对淀粉酶的影响 低温对不同规格斑马蛤内脏组织淀粉酶活性的影响结果见图1。除壳长为13 mm的幼贝在温度降至0.2℃时淀粉酶活性下降外 (但仍高于对照组)，随着温度下降，其他规格组幼贝平均淀粉酶活性基本呈直线升高趋势。水温为8.2、5.4、2.2、0.2℃时，3种壳长幼贝的平均淀粉酶活性依次为0.24、0.37、0.56、0.80 U/mg prot；8、13、17 mm幼贝在各温度下的平均淀粉酶活性依次为0.51、0.41、0.55 U/mg prot。
双因素方差分析表明，温度、规格及二者的交互作用均对斑马蛤淀粉酶活性影响极显著 (P＜0.01)。多重比较结果表明:同一规格下，不同温度组斑马蛤淀粉酶活性有显著性差异 (P＜0.05)，同一温度下，不同规格的斑马蛤淀粉酶活性有显著性差异 (P＜0.05) (除2.2℃下13 mm与17 mm壳长组外)。
图1 低温对不同壳长斑马蛤淀粉酶活力的影响
Fig.1 Impact of low temperature on amylase activity in zebra clam with different shell length
注:标有不同小写字母者表示同一温度下不同规格组间有显著性差异 (P＜0.05)，标有不同大写字母者表示同一规格下不同温度组间有显著性差异 (P＜0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异 (P＞0.05)，下同
Note:The means with different letters are significant differences at the 0.05 probability level in different size clams at the same temperature，the means with different capital letters denote differences at different temperature at the same size，and the means with the same letters are not significant differences，et sequentia
2.2.2 低温对胃蛋白酶和脂肪酶活性的影响 在8.2、5.4、2.2、0.2℃ 4个温度下，不同规格斑马蛤胃蛋白酶和脂肪酶活性均未检出。
2.3 低温下斑马蛤抗氧化酶的变化
2.3.1 低温对总超氧化物歧化酶 (SOD)酶活性的影响 低温对不同规格斑马蛤SOD活力的影响结果见图2。随着温度的下降，SOD酶活性呈诱导－抑制的变化规律，总体呈诱导的趋势，水温为8.2、5.4、2.2、0.2℃时，3种壳长幼贝的平均SOD酶活性依次为 4.71、25.71、15.40、13.98 U/mg prot。但不同规格幼贝的SOD酶活性变化规律不同，13 mm和17 mm幼贝的SOD酶活性在5.4℃时显著升高 (P＜0.05)，后维持在相对稳定的水平；8 mm幼贝SOD酶活力在5.4℃时急剧升高 (P＜0.05)，后回落到较低水平。水温为8.2℃时，8、13、17 mm幼贝的 SOD酶活性依次为9.77、2.39、1.95 U/mg prot，表现为规格越小酶活性越高；水温降至0.2℃时，3种规格的斑马蛤SOD酶活性依次9.15、12.52、20.27 U/mg prot，表现为规格越大酶活性越高。
双因素方差分析表明，温度、规格及二者的交互作用均对SOD酶活性影响极显著 (P＜0.01)。多重比较结果表明:同一规格下，低温试验组SOD活性均显著高于对照组 (P＜0.05)，同时5.4℃组幼贝的酶活性显著高于2.2℃组 (P＜0.05)，其中8 mm壳长组是2.2℃组的2.3倍，而2.2℃和0.2℃组间无显著性差异 (P＞0.05)；8.2、5.4、2.2℃温度下，8 mm壳长组的SOD酶活性均显著高于13 mm和17 mm壳长组 (P＜0.05)，而13 mm和17 mm壳长组间则无显著性差异 (P＞0.05)，温度降至0.2℃时，SOD酶活性由小到大依次为壳长8 mm＜壳长13 mm＜壳长17 mm，并且组间有显著性差异 (P＜0.05)。
图2 低温对不同壳长斑马蛤SOD活力的影响
Fig.2 Impact of low temperature on SOD activity in zebra clam with different shell length
2.3.2 低温对过氧化氢酶 (CAT)酶活性的影响
从图3可见:随着温度的下降，CAT酶活性总体呈下降趋势；壳长为8 mm的斑马蛤酶活性在温度降至5.4℃时急剧下降 (P＜0.05)，并在随后的降温过程中一直维持在较低的水平；而壳长为13 mm和17 mm的斑马蛤在温度降至2.2℃时酶活性才急剧下降 (P＜0.05)。水温为 8.2、5.4、2.2、0.2℃时，3种壳长幼贝的平均CAT酶活性依次为17.2、 5.45、 0.70、 1.74 U/mg prot。 8.2 ℃ 时，8、13、17 mm幼贝的CAT酶活性依次为36.81、5.22、9.56 U/mg prot，温度降至0.2℃时，依次降为 2.55、 2.49、 0.17 U/mg prot。
双因素方差分析表明，温度、规格及二者的交互作用均对CAT酶活性影响极显著 (P＜0.01)。多重比较结果表明:壳长为8 mm和17 mm时，3个低温试验组 (5.4、2.2、0.2℃)的酶活性显著低于对照组 (P＜0.05)，并且这3个低温试验组间也有显著性差异 (P＜0.05)；壳长为13 mm时，5.4℃组酶活性显著高于其他温度组 (P＜0.05)。8.2℃时，8 mm壳长组CAT酶活性显著高于13 mm和17 mm壳长组 (P＜0.05)，8 mm壳长组酶活性分别为13、17 mm壳长组的7.1、3.8倍；5.4℃时，8 mm壳长组酶活性显著低于13 mm和17 mm壳长组 (P＜0.05)；温度降至0.2℃时，8 mm和13 mm壳长组CAT酶活性显著高于17 mm壳长组 (P＜0.05)。
图3 低温对不同规格斑马蛤CAT活力的影响
Fig.3 Impact of low temperature on CAT activity in
zebra clam with different shell length
3 讨论
3.1 低温对斑马蛤幼贝消化酶活性的影响
钱佳慧等[24]发现，温度为19～31℃条件下(渐变)，25.6℃时华贵栉孔扇贝Chlamys nobilis幼贝软体部的淀粉酶活力达最大值。刘敏[25]对施氏獭蛤Lutraria sieboldii的研究表明，在水温为12、17、22、27、32℃条件下，胁迫处理 (突变)64 h，各组施氏獭蛤肝胰脏和鳃组织淀粉酶活性在一定范围内随着温度升高而增强，峰值出现在27℃或32℃，低温 (12℃)对淀粉酶活性有较显著的抑制作用。朱晓闻[26]研究表明，在18～34℃范围内，温度为28.06℃时马氏珠母贝淀粉酶活力最高。上述试验表明，在较高温度范围内 (＞12℃)，温度无论突变还是渐变，贝类淀粉酶活性均随着温度的下降而降低。
本试验结果与大多数文献结论相反，在8.2℃到0.2℃范围内，随着水温逐渐下降，淀粉酶活力逐渐升高 (图1)。蛤仔适宜的生存温度为5～35℃[1]，本试验所设定的温度超出了蛤仔适宜的生存温度，这可能是导致本试验结果与大多数试验结果不同的主要原因。本试验中，随着水温的降低淀粉酶活性升高，可能是对低温胁迫的一种积极的应激反应，其具体机制还有待进一步研究。张永谱等[27]研究了不同年龄泥蚶Tegillarca granosa几种消化酶活性的季节变化，发现淀粉酶的活力依次为冬季＞秋季＞春季和夏季，与本试验结果吻合。倪小英等[28]发现，小荚蛏Siliqua minima淀粉酶活性的季节变化为秋季最高、夏季最低，与本试验结果不同。说明不同物种的淀粉酶活性对温度的响应具有特异性，同时也与不同试验的饵料组成不同及贝类发育阶段的食性不同等有关。
本试验中，随着温度的降低，较小规格 (8 mm)斑马蛤淀粉酶活力升高最快，温度为8.4℃时其淀粉酶活性较其他两种规格都低，但当温度降至0.2℃时，其淀粉酶活性最高 (图1)。说明小规格斑马蛤对低温胁迫更敏感。本试验中各个温度条件下均未检测到蛋白酶和脂肪酶。可能与蛤仔的食性、试验期间投喂的饵料 (螺旋藻粉)和过低的水温导致脂肪酶和蛋白酶分泌量很低有关。杨元昊等[29]在对兰州鲇Silurus lanzhouensis消化酶研究时发现，在低于20℃或高于30℃条件下，兰州鲇除后肠外，胃、肝胰脏及前、中肠中的脂肪酶活性均无法检出。
3.2 低温对斑马蛤幼贝抗氧化酶活性的影响
3.2.1 低温对斑马蛤幼贝SOD酶活性的影响SOD是一种具有多种异构体的还原酶，是抗氧化系统中最先起反应的酶。它能够直接作用于超氧阴离子(O2－·)，并与超氧阴离子发生歧化反应，生产危害较低的过氧化氢以及分子氧，减轻自由基对机体的损害[30]。本研究表明，在较低的温度范围内 (8.2～0.2℃)，水温持续下降，SOD酶活性呈升高 (5.4℃时)－下降或相对稳定 (2.2℃时)的变化趋势，总体水平较对照组高。说明低温对SOD酶活性有诱导作用 (图 2)。温度为 0.2、2.2、5.4℃时的平均SOD酶活性为8.2℃时的2.8、5.6和7.6倍。表现为低温条件下，温度越高诱导作用就越明显。
孔祥会等[31]研究表明，与温度为27℃时相比，锯缘青蟹Scylla serrata Forskal的SOD活性在5℃和10℃驯化下显著高于对照组 (27℃)，此结果与本试验结果吻合。时少坤[32]对杂交鲍Haliotis discus hannai Ino研究表明，水温由18℃经12℃降至6℃时，SOD酶活性与对照组无显著性差异。王天神等[33]研究表明，在水温为10～30℃条件下，克氏原螯虾Procambarus clarkii SOD活性随着温度升高而增强。不同研究者所得规律不同，其原因可能与物种的不同、物种发育阶段的不同、对照组温度的高低、试验设定的温度范围、降温方式及胁迫时间等不同有关。如，周鲜娇等[34]对凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei的试验结果表明，水温从28℃降至18℃ (A组)和14℃ (B组)时，降温后1 h内，对虾肝胰腺中SOD活性迅速上升，之后则逐渐下降。刘伟等[35]对刺参的研究表明，缓降模式下体腔液中 SOD活力均呈先升高后降低再升高的变化趋势，而骤降模式下SOD活力则呈先升高后降低的变化趋势。
本试验中，除了降温过程中蛤仔酶活性的平均值为壳长8 mm＜壳长13 mm＜壳长17 mm以外，3种规格幼贝SOD酶活性对降温的响应也不相同(图2)。水温由8.2℃降到5.4℃时，3种规格幼贝均较对照组 (8.2℃)显著升高，但是壳长8 mm幼贝的SOD活力比13、17 mm幼贝升高的幅度最大，随后急剧下降，至0.2℃时，其酶活性为对照组的93%；而壳长13 mm和17 mm幼贝在5.4℃酶活性显著升高后，随着水温的下降酶活性始终维持在较高水平，温度降至0.2℃时酶活性分别为对照组的5.2倍和10.4倍。说明规格越大，通过提高SOD酶活性来抵御低温胁迫的能力就越强。3.2.2 低温对斑马蛤幼贝CAT酶活性的影响CAT与SOD具有协同作用，可将SOD酶催化生成的过氧化氢催化生成氧气和水，以消除超氧阴离子等的中间产物对细胞的毒害，并且增强吞噬细胞的防御能力和机体免疫功能[13]。本试验表明，水温从8.2℃降至5.4℃时，8 mm的斑马蛤酶活力下降的幅度最大，而13 mm和17 mm的斑马蛤在水温降至2.2℃时酶活力才急剧下降 (图3)。说明低温对CAT有抑制作用，并且对小规格幼贝 (壳长为8 mm)的抑制作用强于较大规格幼贝 (壳长为13 mm和17 mm)。水温降至0.2℃时，壳长为8 mm和13 mm幼贝的CAT活性略有回升，显示与SOD协同作用来抵御低温胁迫的不良刺激。
受试验条件和物种的影响，不同的研究者所得低温对CAT的影响结果也不同。时少坤[32]对杂交鲍的研究结果显示，水温由18℃经12℃降至6℃时，CAT酶活性与对照组无显著性差异。周鲜娇等[34]对凡纳滨对虾的研究结果表明，水温从28℃降至18℃和14℃，降温后1 h内对虾肝胰腺中CAT活性上升，而后下降，其中14℃时CAT活性下降的趋势比18℃时更加迅速、明显。刘伟等[35]对刺参的研究表明，缓降模式下CAT活力呈先降低后升高的变化趋势，骤降模式下CAT活力呈先升高后降低的变化趋势。王天神等[33]研究表明，在10～30℃水温范围内，克氏原螯虾的CAT活性随着温度的升高呈下降趋势。孔祥会等[31]研究表明，与27℃相比，锯缘青蟹CAT活性在5、10、15℃3个驯化温度下均显著升高，此结果与本试验中CAT酶活性的变化规律相反。
综上，以每天1℃并维持3 d的幅度渐变降温条件下，斑马蛤幼贝主要通过提高淀粉酶和SOD酶活性来抵御低温带来的恶劣环境和氧化损伤，较小规格幼贝 (8 mm和13 mm)在接近0℃时CAT有微弱的协同作用，总体上较大规格幼贝的抗低温能力较强。所得试验结论可为弄清蛤仔斑马蛤越冬生理机制及大规模生产推广提供一定参考。
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