饲料中添加蚯蚓粪、蚯蚓粉，可提高动物的生长性能及免疫力，在畜牧和水产养殖中已有许多将其饲 喂 鸡[1－3]、 猪 [4－5]、 草 鱼[6－7]、 鲶 鱼[8]、 黄鳝[9－11]、 虾[12－13]、 罗非鱼[14－15]、 鳢[16]等的研究报道。但分离蚯蚓是一个费工费力的工作，且蚯蚓粉的价格较高，有价无市，不适合该饲料的开发推广。而蚯蚓粪不仅仅是蚯蚓的粪便，还含有蚯蚓卵和小蚯蚓，且价格较为低廉。蚯蚓粪中富含氮、磷、钾、腐殖酸及多种微量元素，还含有抗菌微生物，有益于微生态平衡[17]。刘波等[18]测定了蚯蚓粪的营养组成，发现其含粗蛋白质12.44%，且适口性氨基酸相对较多。程静等[6]报道，蚯蚓粪不仅有药用价值，还可以替代麸皮作为鱼类及畜、禽的饲料。因此，可尝试将单独蚯蚓粪或者蚯蚓与蚯蚓粪不分离一同烘干粉碎的混合物，开发成添加剂。目前，已有添加蚯蚓粪饲养动物的研究报道，如 饲 养 田 螺[19]、 草 鱼[6－7]、 鲫[18，20]、 鲶[8]、鸡[2，21]等，其报道结果均显示，蚯蚓粪可提高其生长性能，但这些试验数据还是相对较少。在开发蚯蚓粪水产饲料添加剂前，还需对其真实饲养效果进行试验验证。
罗非鱼Oreochromis niloticus又称非洲鲫鱼，是一种具有较强生存适应能力的淡水鱼类。其味美肉嫩、出肉率高、营养丰富，且无肌间刺，食用方便，养殖周期较短，养殖前景非常广阔，目前在中国南方大部分地区，尤其是广东、广西、海南等地为经济鱼类的主要养殖品种。但随着集约化养殖程度的提高，养殖成本也在增加，且各种应激因素不断增多，对罗非鱼的经济效益，以及生长、抗病等性能产生了严重影响，因而若利用添加蚯蚓粪降低饲料系数，提高鱼体生长和抗氧化性能，将对罗非鱼经济、健康养殖具有重要意义。为此，本试验在饲料中添加不同水平的蚯蚓粪，并设计添加蚯蚓粪与蚯蚓粉混合物，以模拟添加蚯蚓与蚯蚓粪同体时烘干粉碎所得混合物情形，观察其对罗非鱼生长和血清抗氧化指标影响，以期为开发蚯蚓粪添加剂产品及蚯蚓粪、蚯蚓在水产饲料中得到有效应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用蚯蚓粉和蚯蚓粪购自北京市通州区西河各庄村蚯蚓养殖场，蚯蚓为赤子爱胜蚓Eisenia foetida，俗称 “大平2号”，蚯蚓所用饵料全部为新鲜的奶牛牛粪，未掺杂其他品种粪肥及杂草。将新鲜蚯蚓与蚯蚓粪分离干净后，分别在阳光下烘晒干燥并粉碎，过60目筛，即为蚯蚓粉和蚯蚓粪。
试验用鱼取自水产良种繁育基地，为吉富罗非鱼Oreochromis niloticus。
1.2 方法
1.2.1 饲养管理 试验鱼暂养于实验室玻璃水族箱 (100 cm×50 cm×50 cm)中，有自动过滤循环系统，每天清洗过滤棉以清除粪便等脏物，水温为27～29℃，每3 d换水约二分之一。每个水族箱放养10尾鱼，试验期间每天8:00、12:00、16:00定时饱食投喂，以投料后鱼基本不再抢食为止。
1.2.2 试验用蚯蚓粉、蚯蚓粪及其常规营养成分的测定 采用常规分析法测定蚯蚓粉、蚯蚓粪的营养成分。分别采用凯氏定氮法[22]、索氏提取法[22]、酸碱消煮法和常压干燥法[22]测定粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维和灰分含量。
1.2.3 试验饲料原料和配方 试验饲料由鱼粉、鸡肉粉、豆粕、棉粕、菜粕、米糠、面粉、鸡油、蚯蚓粉和蚯蚓粪等原料组成。测定了蚯蚓粪和蚯蚓粉及饲料原料的常规成分后，设计饲料配方，配制饲料。在中国农业科学院昌平南口实验基地用小型实验饲料设备加工制作。试验饲料配方及营养水平见表1、 表2。
1.2.4 试验设计 挑选规格整齐的罗非鱼180尾，暂养10 d，待鱼体健壮、摄食正常后开始试验，此时测量初始体质量为 (52.98±0.33)g。试验开始后，将试验鱼随机分为6组，每组设3个平行，每个平行放10尾鱼。对照组 (A组)鱼，仅饲喂基础饲料，不添加蚯蚓粪及蚯蚓粉；饲喂添加不同水平蚯蚓粪2.5%、5.0%、7.5%饲料的试验组记为B1、B2、B3组；饲喂添加5.0%蚯蚓粪＋0.150%蚯蚓粉、7.5%蚯蚓粪＋0.225%蚯蚓粉饲料的试验组记为C1、C2组 (表1)。C组是模拟蚯蚓与蚯蚓粪同体状态下被烘干粉碎的添加剂，蚯蚓粉的添加量是以5.0%、7.5%蚯蚓粪为基础计算出。饲养60 d后，测量罗非鱼生长指标和血清抗氧化指标，并进行统计分析。
其中需特别说明，目前市场尚无蚯蚓与蚯蚓粪同体烘干的蚯蚓粉，因此，本试验中设计C组来模拟蚯蚓与蚯蚓粪不分离一同烘干粉碎的情况。C组蚯蚓粪添加量为对比B组得出，蚯蚓粉添加的比例是根据蚯蚓养殖生产中1 t鲜牛粪可以生产出200 kg蚯蚓粪与6 kg蚯蚓粉计算得出，即蚯蚓粪与蚯蚓粉比例为100∶3。
1.2.5 指标的测定与计算
(1)生长指标。饲养试验结束后禁食24 h，采集样品，测定体质量、增重率、特定生长率、饲料系数、存活率5个生长指标，其计算公式分别为
表1 试验饲料配方 (干物质)Tab.1 Ingredients of the diets in the experiment(dry matter) w/%
注: 每千克预混料中含VA 5.5×105IU， VD31.0×105IU， VE 3000 IU， VK3300 mg， VB1700 mg， VB21000 mg， VB6800 mg， VB122 mg， VC 6000 mg，叶酸100 mg，生物素10 mg，肌醇2500 mg，烟酸3000 mg，泛酸钙3200 mg，铁8000 mg，铜250 mg，锰1000 mg，锌4000 mg，硒15 mg， 碘30 mg， 钴20 mg
Note:One kilogram premix includes VA 5.5×105IU， VD31.0×105IU， VE 3000 IU， VK3300 mg， VB1700 mg， VB21000 mg， VB6800 mg， VB122 mg， VC 6000 mg， folic acid 100 mg， biotin 10 mg， inositol 2500 mg， niacin 3000 mg， calcium pantothenate 3200 mg， Fe 8000 mg， Cu 250 mg，Mn 1000 mg， Zn 4000 mg， Se 15 mg， I 30 mg， Co 20 mg
组别group鱼粉fish meal肉粉meat meal豆粕soybean meal棉粕cottonseed meal菜粕rapeseed meal面粉flour米糠rice bran鸡油chicken oil预混料premix盐NaCl磷酸二氢钙MCP胆碱choline蚯蚓粉earthworm powder蚯蚓粪vermic compost合计total A 2 4 20 20 13 24.20 10 3 1 0.5 2 0.2 100 B1 2 4 20 20 13 21.70 10 3 1 0.5 2 0.2 2.50 100 B2 2 4 20 20 14 18.20 10 3 1 0.5 2 0.2 5 100 B3 2 4 20 20 15 14.70 10 3 1 0.5 2 0.2 7.50 100 C1 2 4 20 20 14 18.05 10 3 1 0.5 2 0.2 0.150 5 100 C2 2 4 20 20 15 14.47 10 3 1 0.5 2 0.2 0.225 7.50 100
表2 饲料营养水平理论值与实测值 (干物质)
Tab.2 Nutritional levels(calculated theoretical values and measured ones)of the diets(dry matter) w/%
粗灰分crude ash A 29.98 6.08 5.92 6.79 B1 29.97 6.09 5.90 7.63理论值 B2 29.99 6.07 5.95 8.49 calculated B3 30.00 6.05 6.00 9.35 value C1 30.05 6.08 5.95 8.52 C2 29.98 6.06 5.95 9.37 A 31.92 6.86 8.75 8.90 B1 32.05 6.83 8.05 9.97实测值 B2 31.93 6.91 10.32 11.95 measured B3 32.36 6.50 8.67 14.06 value C1 31.58 6.64 10.00 11.90 C2 32.53 6.45 10.08 12.94组别group粗蛋白质crude protein粗脂肪crude lipid粗纤维crude fiber
其中:W0、Wt分别为试验开始和结束时罗非鱼体质量 (g)；F为饲料摄食量 (g)；t为试验时间(d)。
(2)血清抗氧化指标。从每组分别随机取6尾试验鱼，从尾部采血，用草酸钾与氟化钠抗凝，于4℃下以3500 r/min离心10 min，离心后取血清于超低温冰箱 (－80℃)中保存待用。
试验测定的血清抗氧化指标为总超氧化物歧化酶 (T－SOD)、丙二醛 (MDA)、总抗氧化能力(T－AOC)。各抗氧化指标均采用南京建成生化试剂盒测定，测定方法按照说明书进行。
1.3 数据处理
试验数据以平均值±标准差 (mean±S.D.)表示，采用 SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(One－way ANOVA)，若差异显著，再用Tukey方法进行多重比较，显著性水平设为0.05。
2 结果与分析
2.1 蚯蚓粉和蚯蚓粪的营养成分
从表3可见:蚯蚓粉粗蛋白质含量为57.93%，粗脂肪含量为4.21%；而蚯蚓粪粗蛋白质含量为3.81%，粗脂肪含量为0.06%。
表3 蚯蚓粉和蚯蚓粪主要营养水平 (干物质，实测值)
Tab.3 Approximate compositions levels of earthworm powder and vermicompost(dry matter，measured values) w/%
原料ingredient粗蛋白质crude protein粗脂肪crude lipid粗纤维crude fiber粗灰分crude ash蚯蚓粉earthworm powder 57.93 4.21 1.66 12.04蚯蚓粪vermicompost 3.81 0.06 3.15 79.51
2.2 蚯蚓粪和蚯蚓粉对罗非鱼生长性能的影响
经方差分析表明，蚯蚓粪和蚯蚓粉对罗非鱼的增重、特定生长率、存活率和饲料系数均无显著性影响 (P＞0.05)。
从表4可见:6个试验组初体质量比较接近(P＞0.05)；B组和C组的终体质量比A组略大，以B2蚯蚓粪组为最大，各组间均无显著性差异(P＞0.05)；B2与 C1增重率最高，分别为174.58%和172.29%，比A组149.41%分别提高了16.8%和15.3%，各组间也无显著性差异 (P＞0.05)；B2与C1组特定生长率最高，比对照组分别提高了10.5%和9.8%，各组间也无显著性差异(P＞0.05)；B2与 C1组饲料系数最低，均为1.48，其次为C2组，为1.52，分别比对照组降低了12.4%和10.0%，各组间也无显著性差异 (P＞0.05)；成活率均为100%。
表4 蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼生长性能的影响
Tab.4 Effects of dietary earthworm powder and vermicompost on growth performance in Nile tilapia
组别group饲料系数FCR A 52.86±0.28 131.84±3.92 149.41±6.10 1.52±0.04 100 1.69±0.07 B1 53.08±0.25 133.44±6.91 151.37±11.97 1.53±0.08 100 1.63±0.05 B2 52.92±0.52 145.29±3.03 174.58±8.32 1.68±0.52 100 1.48±0.09 B3 52.86±0.49 141.31±16.59 167.39±32.48 1.63±0.20 100 1.57±0.16 C1 53.22±0.25 144.92±6.54 172.29±11.58 1.67±0.07 100 1.48±0.05 C2 52.93±0.23 142.93±9.11 170.07±17.94 1.65±0.11 100 1.52±0.05初体质量/g initial body weight终体质量/g final body weight增重率/%WGR特定生长率/(%·d－1)SGR存活率/%SR
2.3 不同添加水平的蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼血清抗氧化指标的影响
经方差分析表明，蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼的血清T－SOD、MDA和T－AOC水平均无显著性影响 (P＞0.05)。从表5可见:B、C组罗非鱼血清中T－SOD活力均比A组有所增加，其中B2和B3组增加最多，比对照增加了约20.0%；B、C组MDA含量比A组有所降低，B2组最低；B、C组T－AOC能力较A组有所提高，尤其是B2组，比对照组提高了56.6%。但各组中3项抗氧化指标指标差异均未达到显著性水平 (P＞0.05)。
表5 蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼血清抗氧化指标影响
Tab.5 Effects of dietary earthworm powder and vermicompost on serum antioxidant indices in Nile tilapia
组别group总抗氧化能力/(U·mL－1)T－AOC A 49.22±18.65 3.57±0.61 4.75±1.53 B1 52.10±16.42 3.23±1.16 6.35±3.66 B2 58.72±9.48 2.83±0.81 7.44±2.96 B3 59.07±11.43 3.28±1.65 5.97±0.84 C1 53.81±13.54 2.99±1.29 6.73±2.43 C2 51.48±5.99 3.21±0.94 6.87±1.72总超氧化物歧化酶/(U·mL－1)T－SOD丙二醛/(nmol·mL－1)MDA
3 讨论
3.1 对蚯蚓粉和蚯蚓粪营养成分实测值的分析
据报道，蚯蚓体内蛋白质含量约占干质量的53.5%～65.1%，其中，利用冷冻干燥的方法加工得到的蚯蚓粉含粗蛋白质较高，其含量能达到65%～70%[23]。程静等[6－7]测得蚯蚓 (干物质，实测值)粗蛋白质为57.38%、粗脂肪为5.49%、粗灰分为7.03%。而本试验中测得蚯蚓 (干物质，实测值)粗蛋白质为57.93%、粗脂肪为4.21%、粗灰分为12.04%，与以上所报道的测定结果比较一致。本试验测定结果验证表明，蚯蚓粉粗蛋白质含量为53.5%～65.1%。
刘波等[18]测定了蚯蚓粪营养组成，发现其粗蛋白质含量为12.44%、粗脂肪为0.86%、粗灰分为35.88%，包括适口性氨基酸相对较多；程静等[6－7]测得蚯蚓粪 (干物质，实测值)中粗蛋白质含量为 9.81%、粗脂肪为 0.38%、粗灰分为38.61%；李云格等[24]测得蚯蚓粪 (干物质，实测值)粗蛋白质为8.96%、粗脂肪为0.10%、粗纤维为2.73%、粗灰分为58.22%；程宁[19]测得蚯蚓粪 (干物质，实测值)粗蛋白质7.41%、粗脂肪为2.2%、粗灰分为67.2%；陈宝书等[25]测得蚯蚓粪 (干物质，实测值)粗蛋白质为6.00%、粗脂肪为 0.49%、粗纤维为 4.59%、粗灰分为71.84%。与这些文献所报道的蚯蚓粪测定结果比较，本试验中测得的粗蛋白质和粗脂肪含量相对较低，所测蚯蚓粪 (干物质，实测值)粗蛋白质为3.81%、粗脂肪为0.06%、粗纤维为3.15%、粗灰分为79.51%。将以上各研究报道和本试验结果进行比较，所测蚯蚓粪营养物质含量均有差异。蚯蚓粪中营养物质含量因原材料不同而有差异，同时也与蚯蚓活性有关[26]。李云格等[24]测得蚯蚓粪是经过蚯蚓粪→炭化→发酵加工工艺后所得；程宁[19]所测蚯蚓粪是用牛粪和稻草混合作为基质饲养赤子爱胜蚯蚓所得；陈宝书等[25]所测蚯蚓粪是新鲜奶牛牛粪常温自然发酵后投放一定数量的蚯蚓所得。而本试验中所测蚯蚓粪是均为新鲜奶牛牛粪 (未掺杂其他品种粪肥及杂草)饲养赤子爱胜蚯蚓所得，这可能是彼此间蚯蚓粪营养物质含量出现差异的主要原因。
3.2 饲料中添加蚯蚓粉和蚯蚓粪对罗非鱼生长的影响
蚯蚓营养丰富，粗蛋白质含量高于国产鱼粉，且蚯蚓有较强的诱食作用，在中国对虾[12]、凡纳滨对虾[13]、黄鳝[9－11]等养殖生产应用中均具有较好的诱食、促生长、改善生长性能的效果。饲料中添加蚯蚓1.14%＋蚯蚓粪38.86%，可显著提高革胡子鲶的生长性能[8]；李钧等[27]报道，用蚯蚓粉替代进口鱼粉，虽然在鸡的生长上未有显著差异，但蚯蚓饲料转化率高，可有效地降低生产成本；孙振军等[2]报道，用鲜蚯蚓和蚯蚓粪替代鱼粉作为蛋白质源饲喂肉仔鸡，添加鲜蚯蚓12%＋蚯蚓粪10.5%，其增重效果最为明显，且体质量的增加与日粮中蚯蚓和蚯蚓粪的添加量呈正相关；李云格等[26]在肉仔鸡基础日粮中加入经加工发酵的蚯蚓粪3%，可降低氨气浓度，提高体质量。而关于在罗非鱼饲料中添加蚯蚓粪及蚯蚓的研究，目前有两个报道:徐捷等[14]在饲料中分别添加5%、7.5%的鲜蚯蚓饲养尼罗罗非鱼，增重率分别比对照组提高了85.21%、49%；顾海林等[15]在基础饲料中添加蚯蚓1.14%＋蚯蚓粪38.8%混合物配制成颗粒饵料饲养尼罗罗非鱼，结果鱼产量比对照组提高22.4%。但这两个报道中使用的鲜蚯蚓和高比例的蚯蚓粪，会造成饲料成本过高，实际生产执行难度较大，综合效益不高。邹青等[20]在改良鲫饲料中添加4%蚯蚓粪时，鱼特定生长率达到最大值，这与本试验中添加5%蚯蚓粪时罗非鱼特定生长率最高的结果较一致；但邹青等[20]报道的特定生长率差异达到显著水平，而本试验中未达到显著水平。程静等[6]在草鱼饲料中添加6%蚯蚓粪时饲料系数最低 (1.35±0.11)，其次为添加4%时 (1.59±0.08)，这与本试验中饲料添加5%蚯蚓粪时饲料系数最低 (1.48±0.09)的结果也较为一致；但程静等[6]指出，添加7.5%～10%的蚯蚓或6%蚯蚓粪均能显著提高草鱼的增重率并降低饲料系数 (P＜0.05)。而本试验中添加蚯蚓粪及蚯蚓，各项指标均未达到显著水平，这可能与其他研究人员试验所用基础饲料营养水平差异、蚯蚓粪营养成分含量差异、试验鱼类品种不同和统计分析比较方法不同有关。
本研究表明，饲料中添加蚯蚓粪效果虽未达到显著水平，但在一定程度上也能改善罗非鱼的生长性能。首先，蚯蚓粪含有一定量蛋白质，与沸石粉、麦饭石等载体相比具有一定营养价值；其次，蚯蚓粪富含Fe、Cu、Zn[28]，是酶合成配体的离子中心[29]，有可能会促进消化酶的合成与分泌；另外，蚯蚓粪富含腐植酸类物质[28]，而腐植酸物质可以保护动物肠胃的黏膜[30]，投喂含有蚯蚓粪的饲料可保护鱼类消化道中分泌消化酶的黏膜细胞，从而促进消化酶的分泌[31]；再次，蚯蚓粪中含有较多的有效磷，Garg等[32]在用蚯蚓处理鸡粪、农业副产品与工业废物混合物的研究中，其有效磷含量从1.4%增加到了6.5%，而本试验中蚯蚓粪有效磷含量为0.46%；最后，蚯蚓粪具有多孔结构，其吸附性较强，或许可以吸附饲料中抗营养因子和毒素[6]，也可能使得许多有益微生物在其表面生存，并具有良好的吸收和保持营养物质的能力[28]，从而促进罗非鱼对饲料中营养成分的消化吸收。
3.3 饲料中添加蚯蚓粉、蚯蚓粪对罗非鱼血清抗氧化指标的影响
鱼类免疫系统中非特异性免疫机制对预防疾病起着非常重要的作用，而超氧化物歧化酶、总抗氧化能力等是鱼类非特异性免疫系统中重要的酶类，在一定程度上可反映鱼类免疫能力的强弱[33]。
刘石林等[13]研究表明，饲料中添加一定量的蚯蚓可显著提高凡纳滨对虾血清中的抗菌活力、酚氧化酶活力和血细胞数量，并可显著提高对虾的生长速率。姚东林等[16]研究指出，杂交鳢血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶的活性均随蚯蚓添加量的不同而波动，以7.5%的蚯蚓浆添加量为最高。而本试验中超氧化物歧化酶等酶活性随蚯蚓粉添加量的增加也有增高的趋势，但差异均不显著，其原因可能是因为本试验中蚯蚓粉的添加量较少，分别为0.15%和0.225%，换算成鲜蚯蚓的比例大约为0.75%和1.15%，这与姚东林等[16]试验中最佳添加量为7.5%相比差异较大。本试验中蚯蚓粪对血清中超氧化物歧化酶和总抗氧化能力指标具有一定影响，但均未达到显著性水平，这与程静等[6]研究中蚯蚓粪对草鱼的血清免疫指标无显著影响的研究结果较一致。
4 结论
本试验测得蚯蚓粉所含粗蛋白质为57.93%，蚯蚓粪粗蛋白质为3.81%。罗非鱼饲料中添加蚯蚓粪可在一定程度上改善罗非鱼的生长性能并提高其免疫能力，其中以添加蚯蚓粪5%为最好，但所有指标均未达到显著水平 (P＞0.05)，即饲料中添加所测蚯蚓粪对罗非鱼生长和免疫性能无显著影响 (P＞0.05)。结合本试验验证结果并从饲料成本方面考虑，建议暂时停止开发蚯蚓粪罗非鱼饲料添加剂产品，以待进一步研究。
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