扇贝是中国海水贝类养殖的主要品种之一，因其具有味道鲜美、营养丰富等特点，深受人们的喜爱。目前，国内广泛养殖的扇贝品种主要有中国土著的栉孔扇贝Chlamys farreri、从美国引进的海湾扇贝Argopecten irradians[1]和从日本引进的虾夷扇贝Patinopecten yessoensis[2]。然而，伴随着扇贝养殖产业的迅猛发展，纵观整个产业链条从苗种生产到成贝养殖均存在诸多问题，如种质衰退严重、疾病灾害频发、死亡率升高、品质下降等[3]。因此，新品种的引进将成为解决上述问题的有效途径之一。自2000年以来，先后由大连碧龙海产有限公司于2005年将海扇贝Placopecten magellanicus引入中国并繁育成功[4]和青岛农业大学王春德教授于2008年从秘鲁引进紫扇贝Argopecten purpuratus并繁育成功[5]。但目前这两种扇贝在国内均未被广泛推广养殖，具体原因尚不清楚。岩扇贝Crassadoma gigantea隶属于软体动物门Mollusca、双壳纲Bivalvia、扇贝目 Pectinida、扇贝科 Pectinidae，原产于北美太平洋沿岸，因其具有个体大、生长速度快、抗逆性强、肉质鲜美等优点，在国际市场备受青睐。大连海洋大学曹善茂等于2012年从加拿大温哥华引进美洲岩扇贝，于2015年完成了全人工室内育苗试验并获得成功[6]。目前，国内外有关岩扇贝的研究主要集中在生理生态、生产养殖等方面[7－13]，对其遗传学背景的研究在国内外却鲜见报道。作为外来引进物种，查明其遗传学及种质资源资料将有益于其养殖生产和育种推广。
线粒体DNA(mtDNA)作为核外遗传物质，具有结构简单、分子量小、易于分离、进化速度快等特点，适用于种群遗传分析[14－15]。在mtDNA中，相比rRNA基因和非编码区，蛋白质的编码基因更易发生重排，其进化速度适中，且在试验过程中容易扩增[16]。已有的研究表明，细胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)在mtDNA众多蛋白质的编码基因中是最为可靠的分子标记之一，目前，对其结构和功能的研究较为深入[17－18]，普遍被认为是研究群体遗传多样性和系统进化的理想工具[16，19－20]。为此，本研究中拟测定岩扇贝及3种国内主要养殖扇贝 (栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝)的mtDNA Cyt b基因序列，分析其遗传变异，计算4种扇贝的基因差异和遗传距离，结合GenBank中扇贝科其他物种的相应基因序列进行系统进化分析，从分子水平上了解岩扇贝的遗传背景及其与3种主要经济扇贝的亲缘关系，以期为岩扇贝的引种与推广养殖，以及今后的遗传育种研究工作提供参考信息。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用岩扇贝为从加拿大温哥华引进种贝的F1代个体，为1龄贝，养殖于大连龙王塘海域 (简记为Y)；虾夷扇贝 (简记为X)和栉孔扇贝 (简记为Z)均购自于大连新长兴海产品市场，均为2龄贝；海湾扇贝 (简记为H)采自山东莱州某养殖场，为1龄贝。采样时间均为2017年5月，每种扇贝随机取10个样本，经形态学鉴定后取闭壳肌保存于无水乙醇中备用。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 取约50 mg扇贝闭壳肌组织，参考Sambrook等[21]的酚/氯仿抽提法并略做修改进行基因组DNA的提取。将沉淀后的基因组DNA溶解于200 μL的TE溶液中保存，取溶解后的2 μL基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，检测基因组DNA的完整性，并取1 μL，在 NanoDrop 2000微量分光光度计上测定浓度，最后稀释成约50 ng/μL的工作液于4℃下保存备用。
1.2.2 引物设计与合成 试验用引物使用Primer 5软件[22]进行设计，最后由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。其中虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝的Cyt b基因序列扩增引物，分别根据Gen-Bank数据库公布的该物种线粒体基因组全序列进行设计，而岩扇贝的Cyt b基因序列则根据本实验室测得的岩扇贝线粒体基因组序列设计 (表1)。
1.2.3 PCR扩增及序列测定 PCR反应总体系为25 μL， 包括模板 DNA(50 ng/μL)1.0 μL， 10×reaction buffer 2.5 μL， dNTP MIX(2.5 mmol/L)1.0 μL，上下游混合引物 (各 10 μmol/L)1.0 μL，1 U Taq DNA聚合酶0.2 μL，用ddH2O补足至25 μL。PCR反应条件为:94℃下预变性5 min；94℃下变性35 s，50℃下退火40 s，72℃下延伸40 s，共进行38个循环；最后在72℃下充分延伸10 min。PCR产物用10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，经BioSpin Gel Extraction Kit纯化回收后，连接到pMD18－T载体上，再转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α中。挑选阳性克隆送天一辉远 (武汉)生物科技有限公司进行双向测序。
表1 试验用引物序列及其退火温度
Tab.1 Sequences and annealing temperatures of the primers uesd in the expriment
种名species GenBank号Accession No.岩扇贝C.gigantea序列sequence(5′－3′)F:CATAGCTTTTATGAGGGTTT R:CTATTTACCACTACTTCACC MH016739栉孔扇贝C.farreri F:CTTCCCTGTCCTTCAAACT R:TCTTCTATCACCTTCACCC EU715252虾夷扇贝P.yessoensis F:ATCCTTGTTGGGTTTCTGTG R:AAAGACGAAGAACCAGGAGA NC009081海湾扇贝A.irradians F:TTTAAGCTCGAAAGATGAG R:CACTCTAGCACCTAAGACG EU023915
1.3 数据分析
首先，根据测序峰结果进行人工校对；使用NCBI的BLAST工具搜索其他贝类的同源序列，下载扇贝科8种扇贝和贻贝科两种贻贝的Cyt b基因的同源序列 (图1)；使用ClustalX 1.83程序[23]对不同物种DNA序列进行多重比对和人工校准；使用GeneMarkS 4.6b[24]对岩扇贝的测序结果进行Cyt b基因的预测；使用DNAsp 5[25]分析核酸基本参数；使用MEGA 5.1[26]计算碱基组成和Kimura双参数遗传距离，并利用获得的4种扇贝Cyt b基因序列 (所有单倍型序列)，结合GenBank数据库中扇贝科其他扇贝的相应序列，基于邻接法 (Neighbor－Joining，NJ) 和最大简约法 (Maximum－Parsimory，MP)分别构建系统发育树，采用重抽样法(Bootstrap)1000检验系统树分支的置信度，选取贻贝科的两个种作为外源群。
2 结果与分析
2.1 Cyt b基因的序列组成
经PCR扩增及测序，获得了4种扇贝的Cyt b基因全序列 (已提交至GenBank数据库)，其中栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝的Cyt b基因序列与GenBank数据库中相应序列的一致性达98%以上。从表2可见:4种扇贝的Cyt b基因序列长度为1146～1173 bp，岩扇贝序列长度最长，其次为栉孔扇贝，海湾扇贝序列长度最短；4种扇贝的A、T、G、C含量分别为19.65%～22.39%、35.23%～37.80%、25.94%～29.41% 和12.71%～17.29%，A＋T含量为57.12%～59.64%，栉孔扇贝A＋T含量最高，岩扇贝最低，但均高于G＋C含量。此外，栉孔扇贝、海湾扇贝、岩扇贝的启动密码子均为ATG，虾夷扇贝为ATT；虾夷扇贝、海湾扇贝、岩扇贝的终止密码子均为TAG，栉孔扇贝为TAA。
表2 4种扇贝Cyt b基因的序列特征及碱基组成Tab.2 Sequence characteristics and base composition of Cyt b gene in four scallop species
碱基组成base composition/%终止密码子stop codon岩扇贝Crassadoma gigantea 20.55 36.57 29.41 13.47 57.12 1173 ATG TAG栉孔扇贝 Chlamys farreri 21.84 37.80 27.65 12.71 59.64 1171～1173 ATG TAG虾夷扇贝Patinopecten yessoensis 22.39 35.23 27.39 14.99 57.62 1161 ATG TAA海湾扇贝Argopecten irradians 19.65 37.18 25.94 17.29 58.83 1146 ATT TAG种名species A T G C A＋T序列长度/bp length密码子codon启动密码子start codon
2.2 Cyt b基因序列的遗传变异
从表3可见:从岩扇贝、栉孔扇贝、虾夷扇贝和海湾扇贝中分别检测到3、3、4、4种单倍型，多态性位点数依次为2、4、5、14，4种扇贝的单倍型多样性指数 (Hd)、核苷酸多样性指数 (π)和平均核苷酸差异 (k)分别为 0.545～0.800、0.001 00～0.005 72和0.788～6.545； Hd值为虾夷扇贝最高，栉孔扇贝最低，而π值和k值均为海湾扇贝最高，岩扇贝最低。
表4为4种扇贝Cyt b基因序列多态性核苷酸位点及单倍型分布情况。从表4可见:海湾扇贝的单倍型H4仅为某一个体所独有；除栉孔扇贝单倍型Z3含有两2个插入/缺变异位点外，且同样为某一个体所独有，较为特殊；4种扇贝的其余变异位点均由转换和颠换引起。
表3 4种扇贝Cyt b基因序列的遗传变异参数
Tab.3 Parameters of genetic variation in the sequences of Cyt b gene in four scallop species
平均核苷酸差异average nucleotide difference(k)岩扇贝Crassadoma gigantea 3 2 0.727 0.00100 0.788栉孔扇贝Chlamys farreri 3 4 0.545 0.00138 1.212虾夷扇贝Patinopecten yessoensis 4 5 0.800 0.00184 2.133海湾扇贝Argopecten irradians 4 14 0.788 0.00572 6.545种名species单倍型数haplotype number(h)多态位点数number of polymorphic site单倍型多样性指数haplotype diversity(Hd)核苷酸多样性指数nucleotide diversity(π)
2.3 种间遗传距离及系统发育树
4种扇贝基于Cyt b基因序列的种间遗传距离如表5所示。4种扇贝间的遗传距离为0.255～0.429，岩扇贝与虾夷扇贝的遗传距离最近，与海湾扇贝的遗传距离最远。
基于Cyt b基因序列的NJ树与MP树如图1、图2所示。用两种方法获得的系统发育树拓扑结构几近一致，且大分支节点的支持率均较高。扇贝科的12种扇贝明显分为两个单系群。其中，Mimachlamys属的两个种单独聚为一个单系群；而另外一个单系群则包括Argopecten、Pecten、Placopecten、 Chlamys、 Patinopecten和Crassadoma 6个属的10种扇贝，该单系群又分为两个主要的分支，具体为P.yessoensis的4种单倍型与C.gigantea的3种单倍型先聚为一支，再与C.farreri的3种单倍型聚类为一大支，而A.irradians的4种单倍型先与Argopecten系的3个种聚为一支，再与Pecten属的2个种进行聚类，最后与Patinopecten属聚为另一个大支。
3 讨论
3.1 4种扇贝Cyt b基因的序列组成分析
4种扇贝Cyt b基因序列的种间同源性较低，变异较大，但未表现出明显的种间长度多态，该现象同样存在于扇贝科的其他物种，因此，笔者认为，序列的长度多态无法作为物种鉴定的依据。此外，4种扇贝Cyt b基因序列的碱基组成均表现为T含量最高，其次为G含量，C含量最低，并且A＋T含量均明显高于G＋C含量，其符合动物细胞色素b的碱基组成特征[27]，与其他贝类及鱼类的碱基组成偏向性相似[28－29]。胡丽萍等[15]推测认为，mtDNA具有较高的A＋T含量在无脊椎动物中是一种普遍现象。
表4 4种扇贝Cyt b基因序列多态性核苷酸位点及各单倍型分布情况
Tab.4 Distribution of variable nucleotides and haplotypes in Cyt b gene fragments of four scallop species
种名species单倍型haplotype单倍型数haplotype number核苷酸变异位点nucleotide variation site岩扇贝Crassadoma gigantea 91 35 Y1 3 C A Y2 3 C G Y3 4 T A栉孔扇贝Chlamys farreri 124 285 709 734 Z1 5 C G T C Z2 4 T G T C Z3 1 CA∗∗虾夷扇贝Patinopecten yessoensis 162 279 332 688 711 X1 3 C C C G T X2 2 C C T G T X3 4 C C C G T X4 1 T T C T C海湾扇贝Argopecten irradians 234 351 372 525 568 602 618 657 777 840 885 936 964 H1 3 T G C C G C C C T A A C T H2 4 T G C C G C C C T A A T T H3 2 T G C C G C C C T A T C T H4 1 C A T T T C T T C T T T C
表5 4种扇贝种间Kimura双参数遗传距离
Tab.5 Kimura 2－parameter genetic distance among four scallop species
种名species 岩扇贝Crassadoma gigantea 栉孔扇贝Chlamys farreri 虾夷扇贝Patinopecten yessoensis栉孔扇贝Chlamys farreri 0.260虾夷扇贝Patinopecten yessoensis 0.255 0.289海湾扇贝Argopecten irradians 0.429 0.413 0.407
3.2 4种扇贝的种内遗传变异分析
遗传多样性是物种适应环境变化、维持生存与进化的必要条件，遗传多样性越高，遗传变异越丰富，对环境适应能力就越强，可适宜生存的环境就越广泛[16，29－30]。 通常来说， 核苷酸多样性指数(π)和单倍型多样性指数 (Hd)是评估种群遗传多样性的两个重要指标，但由于单个碱基的变异就能生成一种新的单倍型，Hd值可在短时间内积累变异而快速提高，而π值的提高需要长时间的积累，因此，在评估种群遗传多样性和遗传变异时，π 值比 Hd值更具代表性[17，31－32]。 本研究中， 4种扇贝的π值在0.001 00～0.005 72之间，均表现出较低的遗传多样性水平。虾夷扇贝、栉孔扇贝和海湾扇贝表现出较低的多样性水平，可能与试验样本均为养殖群体有关；而引进种岩扇贝可能是由于试验样本为F1代个体，仅由少数几个引进亲本繁育而来，其遗传背景相对单一，导致较低的遗传变异水平。胡丽萍等[15]曾在其他引进种扇贝中也报道了类似现象。
3.3 亲缘关系及系统发育树分析
本研究中的种间遗传距离结果表明，引进的岩扇贝与虾夷扇贝的亲缘关系较近，而与海湾扇贝间的亲缘关系较远。其余3种扇贝间则是虾夷扇贝与栉孔扇贝之间的亲缘关系较近，该研究结果与秦艳杰等[4]应用AFLP技术对3种扇贝亲缘关系的研究结果一致。
图1 应用邻接法 (NJ)构建基于Cyt b基因序列的扇贝科系统发育树
Fig.1 Neighbor－joining(NJ)phylogenetic tree constructed based on the sequences of Cyt b gene in Pectinidae
图2 应用最大简约法 (MP)构建基于Cyt b基因序列的扇贝科系统发育树
Fig.2 Maximum－parsimory(MP)phylogenetic tree constructed based on the sequences of Cyt b gene in Pectinidae
本研究中，基于两种方法 (NJ和MP)构建的系统进化树的拓扑结构几近一致，表明了结果的准确性和可靠性。系统进化树显示，扇贝科中同属的物种先单独聚为一个分支，再与其他属物种进行聚类，表明了mtDNA Cyt b基因作为一种分子标记在种属间系统发生关系研究中的适用性[33]。基于mtDNA基因片段序列探讨扇贝科物种系统进化关系有较多的研究和报道，如Barucca等[34]通过对16S rDNA和12S rDNA部分序列的比较分析，分别构建了23种扇贝的系统进化树；Saavedra等[35]利用mtDNA 16S rDNA和12S rDNA部分序列对扇贝科27种扇贝进行了系统进化研究；而Puslednik等[36]同时利用两个线粒体基因 (16S和12S)及一个核基因 (H3组蛋白)的部分序列构建了46种扇贝的系统进化树，其结果表明，C.gigantea与P.yessoensis的亲缘关系较近，而 C.gigantea与A.irradians的亲缘关系较远，该部分结果与本研究结果一致。但上述研究中均未对 C.gigantea、A.irradians、P.yessoensis和C.farreri 4种扇贝的系统进化及分子遗传学分析进行阐述，并且构建系统进化树所用序列均为相应基因的部分序列，在分析上存在一定局限性。本研究中则通过Cyt b基因全序列，阐明了引进种岩扇贝与国内3种主要经济扇贝间的亲缘关系，将为岩扇贝今后的遗传育种研究工作提供基础信息。
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