牛膝提取物对大鳞鲃生长、部分非特异性免疫指标及抗病性的影响

摘要:为研究牛膝提取物对大鳞鲃Barbus capito生长性能、部分非特异性免疫指标和抗病性的影响，采用单因子试验方法，选取450尾体质量为 (98.92±2.25)g的大鳞鲃，随机分成5组，分别投喂牛膝提取物水平为0(对照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%的5种试验饲料，养殖周期为60 d。结果表明:在饲料中添加0.20%的牛膝提取物，能够显著提高大鳞鲃体质量、增重率和特定生长率；添加0.10%的牛膝提取物，可显著增加大鳞鲃的头肾体指数和脾体指数 (P＜0.05)；与对照组相比，0.20%、0.40%牛膝提取物添加组大鳞鲃血清溶菌酶 (LZM)和酸性磷酸酶 (ACP)活力均有显著提高 (P＜0.05)；用嗜水气单胞菌攻毒后，0.20%牛膝提取物添加组大鳞鲃存活率最高。研究表明，牛膝提取物可提高大鳞鲃生长性能、非特异性免疫力和抗病性，建议饲料中牛膝提取物的添加水平为0.20%。

牛膝Achyranthes bidentata是中国的传统中药，属于觅科植物，广泛分布于中国的山西、山东、河南等地。牛膝药用部分为其块根，块根味苦、甘、酸，性平。牛膝的化学成分主要有皂苷类、甾酮类和糖类等，它们是牛膝药理作用的物质基础。皂苷类主要以齐墩果酸型三萜皂苷类化合物为主。甾酮类化合物种类较多，目前已分离到近20种，包括蜕皮甾酮、牛膝甾酮和漏芦甾酮B等。糖类化合物包括牛膝多糖、寡糖和多种糖类化合物。此外，牛膝中还含有有机酸、生物碱、黄酮和甾醇等活性成分。对畜禽和小鼠等动物的试验表明，牛膝具有提高机体免疫力[1－3]、促进神经生长[4]、治疗关节炎[5－6]、镇痛[7]、抗衰老[8]、抗炎[9]、抗肿瘤[10]和抑菌[11]等作用，而牛膝提取物在水产动物中的应用主要集中在免疫调节和抗氧化功能方面[12－13]。

大鳞鲃Barbus capito隶属于鲤科、鲃属，是名贵的经济鱼类，具有耐盐碱、抗病性强、生长快、肉质嫩等特性[14]，2003年首次从乌兹别克斯坦引入中国，现已经在全国多个地方推广，特别是在中国苏北地区已开展大规模养殖，是苏北地区的特色水产品，对推动苏北地区水产养殖业起到了非常重要的作用。随着大鳞鲃养殖规模的不断扩大，各种病害也日趋严重。传统的防治手段主要依靠抗生素和化学类药物，给水产品质量安全带来潜在危害。因此，急需寻找安全性较高的添加剂替代抗生素类药物，而中草药应用于水产养殖完全符合发展无公害水产、生产绿色水产品的病害防治准则。目前，有关大鳞鲃的人工繁殖、驯化、养殖、生理和病理等研究已取得相应进展[15－17]。但关于大鳞鲃饲料营养方面尤其是饲料添加剂的研究尚未见报道，这限制了大鳞鲃的规模化养殖。为此，本研究中初步探讨了牛膝提取物对大鳞鲃生长性能及免疫力的影响，以期为牛膝作为免疫增强剂应用于水产养殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用大鳞鲃取自江苏省农业科学院宿迁农科所水产养殖中心，健康且规格一致。牛膝提取物(多糖含量≥50%)购自陕西澳源生物技术有限公司，分别按照0(对照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%比例添加到大鳞鲃基础饲料中，用搅拌机混匀，经平模饲料颗粒机制成硬颗粒沉性饲料，粒径为2 mm，自然晾干后备用，各试验组的饲料配比及营养成分见表1、表2。

1.2 方法

1.2.1 试验设计试验采用单因子试验设计，选取450尾体质量为 (98.92±2.25)g的大鳞鲃，随机分成5组，分别投喂添加0(对照)、0.05%、0.10%、0.20%、0.40%牛膝提取物 (ABE)的饲料，每组设3个重复，每个重复放30尾鱼。

1.2.2 饲养管理养殖试验在江苏省农业科学院宿迁农科所水产养殖基地循环养殖系统中完成。饲养过程中定时监测水质，维持内外环境稳定，水温为 (25±1)℃，pH为 6.5～7.5，氨基氮＜0.01 mg/L，水交换量为5 L/min，DO＞6 mg/L。每日于8:00、12:00、17:00各投喂1次，前20 d投饲率为8%，剩余养殖期投饲率为10%，每10 d调整1次投喂量。每天换水1/3，并做好记录，养殖试验周期为60 d。

1.2.3 样品的采集与指标的测定

(1)生长指标。养殖试验正式开始之前，将试验鱼驯养15 d，用电子天平称量每尾鱼的初始体质量 (精确到0.01 g)，并随机分组。养殖结束后，用同样的方法逐条称量各组试验鱼的终末体质量，并计算各组试验鱼的增重率和特定生长率。计算公式为

(2)血清免疫指标。养殖试验结束后，从每个重复随机选取3尾鱼 (每组9尾)，使用5 mL一次性无菌注射器从尾静脉取血。将所抽取的全血于4℃条件下静置过夜，吸取血清，保存于冰箱(－20℃)中备用。采用空白对照法测定溶菌酶(Lysozyme，LZM)活性，采用微量酶标法测定碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，ALP)活性，采用化学比色法测定酸性磷酸酶 (Acid phosphatase，ACP)活性。测定步骤均按照南京建成生物工程有限公司试剂盒说明书进行。

(3)器官指数。将取完血的试验鱼迅速置于冰盘上解剖，分离其头肾、中肾和脾脏，用生理盐水稍加冲洗，吸干水分，立即称重，并计算免疫器官指数。计算公式为

头肾体指数＝头肾质量/体质量×1000‰，

中肾体指数＝中肾质量/体质量×1000‰，

(4)抗病性指标。将嗜水气单胞菌接种于普通LB液体培养基中，用0.65%生理盐水调节菌浓度至108cfu/mL，经计算，半数致死量浓度为4×107cfu/mL。饲养试验结束后，用嗜水气单胞菌对试验鱼进行攻毒，从每个重复选取20尾鱼，每尾注射4×107cfu/mL浓度的嗜水气单胞菌，注射后48 h内观察并记录试验鱼的死亡情况，并计算存活率。计算公式为

1.3 数据处理

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行单因素方差分析 (One－way ANOVA)和多重比较 (Duncan法)，试验数据均用平均值±标准差表示，显著性水平设为0.05。

2 结果与分析

2.1 牛膝提取物对大鳞鲃生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，在饲料中添加0.10%、0.20%和0.40%牛膝提取物能够提高大鳞鲃的体质量、增重率和特定生长率。其中，0.20%牛膝提取物添加组大鳞鲃终末体质量最高，为235.68 g，且显著高于对照组 (P＜0.05)；0.10%和0.20%牛膝提取物添加组大鳞鲃的增重率、特定生长率均显著高于对照组 (P＜0.05)，增重率分别为128.63%和137.81%，特定生长率分别为1.33%和1.41%；而0.05%牛膝提取物添加组与对照组无显著性差异 (P＞0.05)。

2.2 牛膝提取物对大鳞鲃头肾、中肾和脾脏体指数的影响

由表4可知，饲料中添加牛膝提取物对大鳞鲃中肾体指数影响不显著 (P＞0.05)，对大鳞鲃头肾体指数和脾体指数有显著性影响 (P＜0.05)。牛膝提取物添加组大鳞鲃的头肾体指数较对照组均有所增长，其中0.10%和0.40%添加组分别为0.303‰和0.292‰，显著高于对照组 (P＜0.05)；与对照组相比，0.10%、0.20%和0.40%牛膝提取物添加组大鳞鲃的脾体指数分别增加6.48%(P＜0.05)、9.38%(P＜0.05) 和 3.46%(P＞0.05)。

2.3 牛膝提取物对大鳞鲃部分血清免疫指标的影响

由表5可知，饲料中添加牛膝提取物对大鳞鲃血清LZM、ALP和ACP活力有显著性影响 (P＜0.05)。与对照组相比，0.20%和0.40%牛膝提取物添加组大鳞鲃血清LZM活力分别增加51.00%(P＜0.05) 和36.12%(P＜0.05)，ACP分别增加20.34%(P＜0.05) 和 19.42%(P＜0.05)；大鳞鲃血清中ALP活性随着牛膝提取物添加量的增加呈增加的趋势，与对照组相比，0.10%、0.20%、0.40%添加组的ALP分别增加34.44%(P＜0.05)、39.12%(P＜0.05) 和57.30%(P＜0.05)。

2.4 牛膝提取物对大鳞鲃抗病性的影响

用嗜水气单胞菌攻毒后，牛膝提取物对大鳞鲃成活率的影响如图1所示。0.20%牛膝提取物添加组的抗病性最好，大鳞鲃存活率最高，为67.78%，且0.20%、0.40%牛膝提取物添加组存活率显著高于其他组 (P＜0.05)。

3 讨论

3.1 牛膝提取物对大鳞鲃生长性能的影响

经过60 d的养殖试验发现，饲料中添加牛膝提取物可提高大鳞鲃的生长性能，这在其他中草药和水产动物中也有类似的报道。例如，饲料中添加浒苔能够显著提高大菱鲆的增重率和特定生长率[18]。另外，芦笋、薄荷叶、山楂等复方中草药能显著降低中华绒螯蟹的饲料系数，其中1.0%添加量促生长效果最佳[19]。适量的虎杖和肉桂对尼罗罗非鱼幼鱼均具有促生长效果，但过量或者长期食用会对鱼体肠道造成一定程度的损害[20]。此外，将黄芪、甘草、板蓝根等发酵中草药添加到鲤饲料中，可提高鲤肥满度，促进鲤生长[21]。添加量为3%和5%的海带渣能够显著促进凡纳滨对虾生长[22]。一般认为，中草药饲料添加剂的促生长机理主要是改善鱼体免疫功能，提高其抗病能力，增加食欲，改善消化吸收，从而促进其生长。本试验中，添加0.10%和0.20%牛膝提取物的大鳞鲃体质量、增重率和特定生长率较高，且与对照组相比有显著性差异。

3.2 牛膝提取物对大鳞鲃非特异性免疫力的影响

鱼类作为低等脊椎动物中的一种，其非特异性免疫系统发育较早，在免疫防御中具有重要意义[23]。免疫器官指数是反映免疫器官发育程度和免疫状态的重要指标，一般认为，免疫器官指数越大，免疫器官发育越完善，机体的免疫力就越强。胸腺、脾脏和肾脏是机体中重要的免疫器官，在非特异性免疫反应中起到重要作用。研究表明，中草药能促进机体免疫器官的发育，增加免疫器官重量和指数，提高机体的免疫力。

王志敬等[24]在基础日粮中添加玉屏风多糖，结果显示，添加量为0.8～1.6 g/kg时，草鱼头肾和脾脏体指数随添加量的增加而升高，当添加量达到1.6 g/kg时，显著高于对照组。林旋等[25]研究认为，当黄芪多糖浓度达到500 mg/kg时，可以促进罗非鱼免疫器官发育，提高免疫器官指数。王红权等[13]研究表明，牛膝多糖能显著增加草鱼脾体指数。本试验中有类似结果，饲料中添加0.10%和0.20%牛膝提取物可显著增加大鳞鲃头肾体指数和脾体指数。

血清生化指标可以反映机体在生理、病理和毒理方面的变化，常用来评价鱼类健康和营养状况。血清中LZM、ALP、ACP作为非特异性免疫系统的组成元素，其含量变化可反映机体免疫水平。溶菌酶是一种低分子碱性蛋白，可以水解细菌细胞壁N－乙酰氨基葡萄糖和N－乙酰胞壁酸间β－1，4糖苷键，从而使细菌溶解死亡。溶菌酶广泛存在于鱼类肌肉、血清、各种体液和淋巴细胞中，主要参与炎症反应和修复再生等病理过程[26－27]。碱性磷酸酶是溶酶体酶系的标志酶，参与机体磷、RNA、DNA、蛋白质和脂质等的代谢，与动物的生产性能和生长速度有关。鱼类血清中碱性磷酸酶在免疫防御过程中发挥重要作用，酸性磷酸酶是一种可参与信号传导和能量转化并能够调节机体非特异性免疫和营养代谢的水解酶。本研究结果表明，饲料中添加牛膝提取物能够提高大鳞鲃血清LZM、ALP和ACP活力。这3种酶活力在牛膝提取物浓度为0.20%和0.40%时，显著高于对照组，效果最佳。这与对草鱼[28]、血鹦鹉[12]、大菱鲆[29]、中华绒螯蟹[19]和凡纳滨对虾[30]等的研究结果基本一致。

3.3 牛膝提取物对大鳞鲃抗病性的影响

吴斌[31]利用嗜水气单胞菌对福瑞鲤进行攻毒试验，结果显示，浓度为0.5%和0.3%的太子参多糖免疫保护率均为54.55%，显著高于其他组，表明太子参多糖能够提高福瑞鲤抗病力。秦志华等[32]认为，紫锥菊提取物能够降低大菱鲆死亡率，40 mg/mL浓度效果最佳。俞军等[33]研究表明，投喂姜黄素后，大黄鱼抵抗溶藻弧菌感染的能力显著增强，大黄鱼累积死亡率显著降低。牟绍霞等[34]研究报道，黄连须和小檗碱可提高草鱼对嗜水气单胞菌的抗病性，其中0.50%的黄连须组试验鱼存活率最高，比对照组增加44%。耿昕颖等[35]在鳙饲料中分别添加0.50%、1.00%和2.00%的醇提五倍子，试验鱼的抗病性均有不同程度提高。本研究中同样发现，饲料中添加牛膝提取物可提高大鳞鲃抗病性，其中，0.20%和0.40%添加组大鳞鲃成活率较高，显著高于对照组。

4 结论

本研究结果表明，在大鳞鲃饲料中添加牛膝提取物，可以提高大鳞鲃生长性能、免疫器官发育和抗病性，增加大鳞鲃血清LZM、ALP和ACP酶活力，从而提高大鳞鲃的生长性能和免疫力。建议大鳞鲃饲料中牛膝提取物的最佳添加水平为0.20%。

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Effects of Achyranthes bidentata extracts on growth performance，partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbel Barbus capito

WU Chun， SHAN Jin－feng， DING Chen－long
(Suqian Institute of Agricultural Sciences， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Suqian 223800， China)

Abstract:A total of 450 individuals of bulatmai barbel Barbus capito with body weight of(98.92±2.25)g were randomly allocated into a circulating water system and fed diets containing Achyranthes bidentata extracts(ABE)at a rate of 0%(a control group)，0.05%，0.10%，0.20%，and 0.40%at water temperature of(25±1)℃ for 60 d to investigate effects of ABE on growth performance， partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbel.The results showed that significantly higher body weight，weight gain ratio(WGR)and specific growth rate(SGR)were found in the fish fed the diets containing 0.2%of ABE，and that significantly higher head kidney－somatic index and spleen－somatic index were observed in the fish fed the diets containing 0.1%of ABE(p＜0.05).There were significantly higher activities of acid phosphatase(ACP)and lysozyme(LZM)in the fish fed the diets containing 0.20%and 0.40%of ABE than in fish fed the control diet(p＜0.05).A challenge test of bulatmai barbel by pathogen Aeromonas hydrophila revealed that the maximal survival rate was observed in the infected fish fed the diet containing 0.20%of ABE.The findings indicate that ABE leads to significantly promote growth performance， partial non－specific immunity and disease resistance of bulatmai barbell， with appropriate ABE content of 0.20%.

Key words:Achyranthes bidentata； Barbus capito； non－specific immunity； growth performance

基金项目:宿迁市农业科技自主创新资金项目 (SQCX2017－02)；江苏省水产三新工程项目 (Y2016－15)

作者简介:吴春 (1990—)，女，硕士，助理研究员。E－mail:youyouwuchun＠126.com

通信作者:丁辰龙 (1977—)，男，副研究员。E－mail:wuchun9080＠163.com